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目的:本论文通过对广金钱草乙醇提取物进行分离纯化,获得纯化的总黄酮(TFDS),再通过ODS柱层析法对TFDS进行不同极性部位的分离,得到广金钱草不同极性部位的黄酮成分。通过体外的抗氧化实验初步筛选得到两个具有较强的抗氧化部位,且利用细胞实验考察TFDS及两个不同极性部位对保护一水草酸钙(COM)损伤HK-2细胞的作用,筛选出药效部位,并对其作用机理进行初步研究。利用细胞膜色谱法对TFDS与HK-2细胞靶向结合成分进行鉴定,获得活性成分。还通过对TFDS成分在草酸钙肾结石大鼠体内代谢的研究,探索其黄酮成分的代谢产物及途径,为更深一步探究广金钱草活性成分提供基础。方法:1.TFDS的纯化与活性部位初步筛选实验利用广金钱草醇提物,通过大孔树脂联合聚酰胺分离纯化得到纯度较高的总黄酮,并利用ODS柱层析,以甲醇和水作为洗脱溶剂进行梯度洗脱,获得不同极性的黄酮部位。并采用DPPH、ABTS、铜的还原能力方法对洗脱部位进行抗氧化能力筛选,筛选出两个活性较强的部位,为后续的研究提供基础。2.TFDS及不同极性部位对治疗COM损伤细胞的保护作用选择TFDS、25%洗脱部位、85%洗脱部位为研究对象,采用MTT、MDA、GSH、SOD、LDH测定法考察及比较TFDS及不同极性部位对保护COM损伤细胞的作用,并考察药物对损伤的HK-2细胞内活性氧、线粒体膜电位的影响,还测定药物对细胞凋亡的影响,比较药效差异。3.TFDS及不同极性部位对COM黏附的HK-2细胞膜上occludin与ZO-1蛋白影响实验利用Western Blot法对TFDS及不同极性部位在50μg/mL、200μg/mL下浓度下,保护HK-2细胞的机制进行初步探究。选取细胞膜上的ZO-1与occludin蛋白作为研究对象,探索TFDS及不同极性部位是否通过调控细胞TJ蛋白中的ZO-1与occludin蛋白表达,保护COM对HK-2细胞的损伤。4.细胞膜色谱法筛选TFDS与HK-2结合的成分将HK-2与TFDS共培养后,利用裂解液裂解细胞,通过UPLC-Q-TOF-MS方法对给药后的细胞裂解液进行检测,鉴定HK-2与TFDS吸附结合的成分。5.TFDS在草酸钙肾结石大鼠中的代谢研究实验通过建立大鼠草酸钙肾结石模型,给予TFDS药物治疗,收集其血浆、尿液、粪便后,采用UPLC-Q-TOF-MS对三种代谢成分进行分析,利用Metabolynx软件对代谢产物进行提取分析,并进一步分析鉴定获得代谢产物。成果:1.通过大孔树脂联合聚酰胺分离纯化得到TFDS纯度达到75%以上。通过ODS柱层析洗脱得到四个不同极性洗脱部位的化合物,分别为5%、25%、85%、100%洗脱部位,黄酮含量分别41.56%、77.93%、79.30%、63.72%。通过体外抗氧化能力实验:DPPH、ABTS及铜的还原能力实验,筛选出了两个具有较强的抗氧化能力的洗脱部位,分别为25%、85%洗脱部位。2.确定最佳造模浓度:100μg/mL,及造模时间为:24 h,对细胞的抑制率达到70%左右。通过MDA、GSH、SOD、LDH指标测定,总体发现85%洗脱部位效果佳;在TFDS及不同洗脱部位对COM黏附的细胞产生活性氧的检测中发现85%洗脱部位对活性氧的调节作用强于25%洗脱部位;从细胞内线粒体膜电位测定结果发现,高剂量的85%洗脱部位对升高线粒体红绿荧光比值作用最强,但低中剂量的作用不如25%洗脱部位;通过细胞凋亡结果发现,85%洗脱部位对抑制细胞凋亡作用最强;通过实验发现,TFDS及两个不同洗脱部位通过调控细胞TJ蛋白中的ZO-1与occludin的蛋白表达,保护COM对HK-2细胞膜的破坏。其中85%洗脱部位对TJ蛋白中的ZO-1与occludin的蛋白表达明显强于其他两个成分。3.在细胞膜色谱法研究中,发现TFDS中的维采宁-2、维采宁-1、carlinoside、异夏佛塔苷、夏佛塔苷、异牡荆苷、紫云英苷、染料木素、香叶木素、夏佛塔苷同分异构体Ⅰ和夏佛塔苷同分异构体Ⅱ,可与HK-2细胞膜上的特异位点结合。4.通过对TFDS成分在药物体内的代谢研究,发现血浆、尿液和粪便中含有的黄酮原型成分分别有5、11、10个,三种代谢物中共有原型产物的分别为:维采宁-2、异牡荆苷、夏佛塔苷、异夏佛塔苷、染料木素。尿液中还含有:木犀草素、香叶木素、carlinoside、柚皮素、大豆苷、橙皮苷;粪便中含有的原型产物为:木犀草素、异荭草苷、香叶木素、柚皮素和大豆苷,实验鉴定的代谢产物共有71种,多数除了以原型成分存在,还以还原、水解、氧化、甲基化等方式代谢。结论:本论文综合以上多种方法的检测分析,通过对广金钱草药效物质的筛选,确定TFDS中85%洗脱部位药效作用较强;而通过UPLC-Q-TOF-MS鉴定出11个与细胞膜结合的成分,说明TFDS中与细胞特异性结合的成分,可能是发挥药效的成分。在草酸钙肾结石大鼠中的血浆代谢产物中,得到5个原型成分、16个代谢成分,在尿液中得到11个原型成分、21个代谢成分,在粪便中得到10个原型成分、43个代谢成分。