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摘 要 从‘云香’水仙转录组文库中筛选出1条NAC基因序列，采用PCR技术克隆得到其cDNA序列。序列分析表明，该NAC基因包含822 bp的开放阅读框，编码273个氨基酸，分子量30 903.9 u，命名为NtNAC3153（GenBank登录号：KU375569）。理化性质分析和多重序列比对显示，NtNAC3153蛋白是一个无跨膜区域的亲水性蛋白，在N端具有一段保守结构域。系统进化树分析表明，NtNAC3153与同为单子叶植物的小果野芭蕉MaNAC、二穗短柄草BdNAC和小米SiNAC亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析显示，NtNAC3153基因能够被ABA、盐胁迫和高温诱导表达。研究表明：NtNAC3153可能参与‘云香’水仙的抗逆调控机制。
关键词 ‘云香’水仙；NAC转录因子；基因克隆；序列分析；非生物胁迫
中图分类号：S682.21 文献标识码 A
Abstract A sequence of one NAC gene from‘Yunxiang’transcriptome library was cloned using PCR technology. Sequence analysis indicates that the cDNA of NAC， named NtNAC3153（GenBank accession number： KU375569）， contained an open reading frame of length 822 bp（encoding 273 amino acids， molecular weight： 30.903 9 ku）. Physiochemical properties analysis and multiple sequence alignment showed that NtNAC3153 protein was a hydrophilic protein which was free of trans-membrane region and had a conserved N-terminal domain. Phylogenetic analysis indicated that the NtNAC3153 had the closest relationship with Musa acuminata MaNAC， Brachypodium distachyon BdNAC and Setaria italica SiNAC. Real-time PCR analysis showed that the expression of NtNAC3153 gene could be induced by ABA， salt stress and high temperatures. NtNAC3153 may be involved in the regulation of resistance mechanisms of‘Yunxiang’.
Key words ‘Yunxiang’； NAC transcription factor； cloning； sequence analysis； abiotic stress
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.02.020
NAC轉录因子是植物所特有的最大的转录因子家族之一[1]，在陆生植物中分布广泛。NAC家族的命名起源于矮牵牛（Petunia hybrida）NAM、拟南芥（Arabidoposis thaliana）ATAF1、ATAF2和CUC2基因[2-3]。目前，已在拟南芥、水稻、大麦、小麦、玉米和大豆等多种植物中分离得到NAC家族基因[4-8]。NAC转录因子主要在高等植物生长发育和胁迫应答中发挥作用，参与调控相关结构基因的表达[9-10]。近年来，大量关于NAC基因参与胁迫应答的研究相继被报道[11-14]，Yu Xingwang等[11]将鹰嘴豆CarNAC4基因转入拟南芥中进行研究，发现CarNAC4转录因子增强了拟南芥的抗旱性和抗盐性；Liu Guanze等[12]将水稻SNAC1基因转入棉花中进行研究，发现过量表达水稻SNAC1基因能够增加根系生长和降低蒸腾速率，从而增强了转基因棉花的抗旱性和抗盐性；Xu Zhongyang等[14]将小麦TaNAC29基因转入拟南芥中，发现TaNAC29通过增强抗氧化系统和参与调控非生物胁迫相关信号途径来减少H2O2的积累和对细胞膜的伤害，从而增加了转基因拟南芥的抗盐性。由此可见，NAC转录因子在植物的胁迫应答反应中起着十分重要的作用，但目前为止，对其分子机制的研究报道主要集中在模式植物和粮食作物上，因此进一步开展NAC转录因子在园艺作物中的研究具有非常重要的意义。
‘云香’水仙（Narcissus tazetta var. chinesis‘Yunxiang’）是福建农林大学园艺植物遗传育种研究所培育出的一个具有自主知识产权的水仙新品种[15]，与传统中国水仙相比，植株大而健壮，鳞球较大且紧实，花期长，花香浓郁，抗病性强，在市场竞争中具有很大的优势。本研究从‘云香’水仙不同开花时期花瓣转录组文库中筛选出一个差异表达的NAC基因，在NCBI上进行Blast比对，初步推测其可能与抗性相关，进而对其进行克隆、生物信息学分析和抗性表达分析，研究该基因与‘云香’水仙抗逆机制的关系，为该基因功能的后续研究奠定基础，为水仙抗性新品种的培育提供分子辅助育种资料。
1 材料与方法
1.1 材料
试验使用的‘云香’水仙为大小一致，无病虫害的一年生子球，由福建农林大学园艺植物遗传育种研究所提供。
1.2 方法
1.2.1 总RNA的提取和反转录 使用多糖多酚植物总RNA快速提取试剂盒（百泰克公司）提取‘云香’水仙的总RNA。1%琼脂糖凝胶电泳分析RNA条带的清晰度、完整性，将质量完好的RNA置于 -80 ℃冰箱中储存备用。用Fermenta Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录，所得cDNA用于克隆目的基因；用TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time）进行逆转录，所得cDNA用于荧光定量分析。具体步骤，见试剂盒说明书。
1.2.2 云香水仙NAC基因的克隆 用DNAMAN对基因序列进行分析，根据其ORF两端序列设计出1对特异性引物。以‘云香’水仙的cDNA为模版，以NAC3153-F和NAC3153-R（表1）分别为上、下游引物进行PCR扩增，克隆NtNAC3153基因ORF。反应采用25 μL体系：Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTP Mix 2 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，Ex Taq酶0.2 μL，ddH2O 18.3 μL。反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，48.9 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环30次；72 ℃延伸5 min。4 ℃恒温保存。将PCR产物进行凝胶电泳后回收目的片段DNA，连接至pMD18-T载体（TaKaRa）后轉化大肠杆菌DH5α，菌液PCR鉴定后送阳性克隆菌液至博尚测序。
1.2.3 NAC3153基因生物信息学分析 使用DNAMAN软件对基因ORF及编码氨基酸序列进行预测；用在线软件ExPASy-ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam）对氨基酸理化性质进行分析；使用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对氨基酸序列进行跨膜预测；利用SOPMA分析蛋白的二级结构，通过Swiss-model（http：//swissmodel，expasy.org/）在线预测蛋白的三级结构。用NCBI中的Blastp程序来检索NtNAC3153的同源蛋白，用DNAMAN进行氨基酸序列的多重比对，在MEGA5.05中用邻近相法进行系统进化树的构建。
1.2.4 ‘云香’水仙NAC3153基因的胁迫表达分析
将‘云香’水仙子球消毒处理后水培，待长出新叶达到3～4 cm后，用100 μmol/L ABA、250 mmol/L NaCl分别浸泡鳞球1、3、6、12、24和48 h，将水培的鳞球置于50 ℃高温，处理同样的时间，用清水处理的水培水仙作为对照。提取清水处理的和ABA、NaCl与高温处理1、3、6、12、24和48 h后的‘云香’水仙叶片RNA，逆转录为cDNA模版，将其稀释10倍后作为初始模板，以中国水仙actin（genebank accession： JN204912.1）为内参基因，NAC3153-Q-F和NAC3153-Q-R为上下游引物检测NtNAC3153基因的表达水平（表1）。qRT-PCR使用25 μL体系：SYBR Premix ExTaqTM（2×）12.5 μL，cDNA 2 μL，Forward Primer（10 μmol/L）0.5 μL，Reverse Primer（10 μmol/L）0.5 μL，ddH2O 9.5 μL。每种处理做3个生物学重复，qPCR时重复3次。qRT- PCR反应程序为：1.94 ℃ 3 min；2.94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40个循环；溶解曲线。采用2-△△Ct法进行目的基因的相对表达量分析。
2 结果与分析
2.1 ‘云香’水仙NAC基因cDNA克隆
以‘云香’水仙RNA 反转录成的cDNA为模板，PCR扩增得到1条1 000 bp左右的条带（图1）。测序结果得到1条为984 bp的cDNA片段，命名为NtNAC3153。结合NCBI上Blast比对，用DNAMAN进行序列分析表明，NtNAC3153包含长度为822 bp的ORF，编码蛋白由273个氨基酸组成（图2）。
2.2 ‘云香’水仙NAC基因的生物信息学分析
理化性质分析表明，NtNAC3153编码蛋白的分子式为C1 363H20 91N373O414S18，分子量为30 903.9 u，等电点为6.09，属于稳定蛋白；NtNAC3153蛋白是亲水性蛋白，其亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸；NtNAC3153蛋白没有明显的跨膜结构域，可能不是膜蛋白。
二级结构预测结果显示，NtNAC3153编码蛋白的氨基酸序列中有59处α-螺旋（Alpha helix），占二级结构的21.53%；55处延伸链（Extended strand），占二级结构的20.07%；25处β-转角（Beta turn），占二级结构的9.12%；135处无规卷曲（Random coil），占二级结构的49.27%（图3-A）。无规则卷曲所占比例最高，推测其作用主要为连接其他二级结构原件。
用Swiss-model分析NtNAC3153蛋白的三级结构（图3-B），结果显示，NtNAC3153蛋白与水稻抗性相关NAC1蛋白的三级结构相似性为51.88%。
将NtNAC3153蛋白的氨基酸序列与其他9个物种的NAC蛋白氨基酸序列进行同源性比对，这9个NAC蛋白分别为：大豆GmNAC（Glycine max，XP_003554001.1）、葡萄VvNAC（Vitis vinifera，XP_
002277068.1V）、木本棉GaNAC（Gossypium arboreum，KHG13515.1）、朝鲜蓟CcNAC（Cynara cardunculus var. scolymus， KVI00075.1）、无油樟AtNAC（Amborella trichopoda，XP_006827310.1）、小果野芭蕉MaNAC（Musa acuminata subsp. malaccensis，XP_009420240.1）、荷花NnNAC（Nelumbo nucifera，XP_010276452.1）、油棕EgNAC（Elaeis guineensis，XP_010938118.1）和绿豆VrNA（Vigna radiata var. radiata，XP_014491001.1）。经DNAMAN比对，结果显示（图4），所有10个NAC转录因子都在N端有一段保守的氨基酸序列，包括约150个氨基酸，含有A、B、C、D、E 5个亚结构域，与前人研究结果相一致，由此断定NtNAC3153为NAC蛋白。 2.3 NtNAC3153蛋白的系统进化树分析
为了研究NtNAC3153蛋白的进化关系，使用MEGA5.05软件将NtNAC3153和与其同源的其他植物NAC转录因子构建了系统进化树（图5）。结果表明，NtNAC3153与同为单子叶植物的小果野芭蕉MaNAC（芭蕉科）、二穗短柄草BdNAC（禾本科）和小米SiNAC（禾本科）亲缘关系最近。
2.4 NtNAC3153基因的胁迫表达分析
荧光定量实验结果表明，ABA、盐胁迫和高温，均可明显诱导NtNAC3153基因的表达。其中，ABA处理后，NtNAC3153基因的表达明显上升，在24 h达到最大值，而后下降；250 mmol/L NaCl处理强烈诱导了NtNAC3153基因的表达，但却出现3 h和24 h两个峰值，呈现出先上升，后下降，再上升，而后又下降的趋势；高温处理后，NtNAC3153基因的表达迅速上升，在3 h即达到最高水平，而后逐渐下降（图6）。
将3种处理后达到最高峰值的时间进行比较，NaCl处理和高温处理后，NtNAC3153基因的表達迅速上升，在3 h即达到最高峰值，而ABA处理后，NtNAC3153基因的表达是逐渐上升，在24 h才达到最高峰。
由此可见，ABA、盐胁迫和高温诱导了NtNAC3153基因的表达，而且随处理时间的延长，趋势明显。由此推断，NtNAC3153基因可能参与了‘云香’水仙的抗逆调控机制。
3 讨论
本研究克隆得到了‘云香’水仙NtNAC3153基因，其编码蛋白在N端有一段保守的氨基酸序列，与其他物种NAC转录因子相同，而C端结构则与其他物种差异很大，高度变异，与前人研究结果一致[16]。已有研究报道表明，NAC转录因子的N端保守氨基酸序列可以被分为A、B、C、D 和E 5个亚结构域[17]，可能参与调控DNA与其他蛋白的结合[18]，而C端是高度变异的，这与不同类型NAC转录因子的不同功能相关。
植物NAC家族成员在响应非生物胁迫的进程中起重要作用，研究NAC转录因子参与植物胁迫反应的机制具有重要的意义。目前，多种植物的NAC基因已经被克隆出来，不同植物NAC基因在逆境胁迫下的表达模式存在差异。小麦中，TaNAC29参与了NaCl、PEG和ABA胁迫的应答反应[14]。胡杨PeNAC1基因能被干旱和高盐胁迫诱导表达，而ABA胁迫处理下相应较弱，超表达PeNAC1基因提高了转基因拟南芥的抗盐能力[19]。甘菊中DlNAC1基因可以被低温、高盐和干旱胁迫分别诱导，对ABA和高温胁迫不敏感[20]。过表达水稻SNAC1基因，增加了棉花的抗旱性和抗盐性[12]。本研究中，‘云香’水仙NtNAC3153基因，能够被ABA、NaCl和高温3种非生物处理分别诱导表达，且趋势明显。在ABA、NaCl和高温处理下，NtNAC3153基因的表达量都是先上升，后下降，在最高处，表达量分别为对照的18倍、24倍和16倍，与小麦TaNAC29基因[14]在ABA处理下和NaCl处理下的表达情况相似。不同的是，在NaCl处理下，NtNAC3153基因的表达在3 h即达到最高峰，而小麦TaNAC29基因在NaCl处理下表达则在12 h才达到最高峰。高温处理时，NtNAC3153基因的表达也是在3 h即达到高峰。由此，可以推测，NtNAC3153基因是‘云香’水仙逆境胁迫应答基因，并且在非生物胁迫处理下有特异的表达模式，但其在参与逆境胁迫中的作用尚不清楚，有待进一步的研究。
转录因子可能同时参与多个基因的表达调控，因而仅通过调控1个转录因子，就可能调控多个相关功能的基因发挥作用，达到改良植物性状的目的[16]。目前，笔者通过对‘云香’水仙NAC转录因子基因进行了克隆，研究分析了其在几种胁迫下的表达情况，初步了解了其在‘云香’水仙遭受胁迫后的应答，对其调控抗性表达提供了直接依据，为进一步通过转基因技术对其进行功能验证打下了基础，为日后培育水仙抗性新品种提供了基因资源。
参考文献
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关键词 ‘云香’水仙；NAC转录因子；基因克隆；序列分析；非生物胁迫
中图分类号：S682.21 文献标识码 A
Abstract A sequence of one NAC gene from‘Yunxiang’transcriptome library was cloned using PCR technology. Sequence analysis indicates that the cDNA of NAC， named NtNAC3153（GenBank accession number： KU375569）， contained an open reading frame of length 822 bp（encoding 273 amino acids， molecular weight： 30.903 9 ku）. Physiochemical properties analysis and multiple sequence alignment showed that NtNAC3153 protein was a hydrophilic protein which was free of trans-membrane region and had a conserved N-terminal domain. Phylogenetic analysis indicated that the NtNAC3153 had the closest relationship with Musa acuminata MaNAC， Brachypodium distachyon BdNAC and Setaria italica SiNAC. Real-time PCR analysis showed that the expression of NtNAC3153 gene could be induced by ABA， salt stress and high temperatures. NtNAC3153 may be involved in the regulation of resistance mechanisms of‘Yunxiang’.
Key words ‘Yunxiang’； NAC transcription factor； cloning； sequence analysis； abiotic stress
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.02.020
NAC轉录因子是植物所特有的最大的转录因子家族之一[1]，在陆生植物中分布广泛。NAC家族的命名起源于矮牵牛（Petunia hybrida）NAM、拟南芥（Arabidoposis thaliana）ATAF1、ATAF2和CUC2基因[2-3]。目前，已在拟南芥、水稻、大麦、小麦、玉米和大豆等多种植物中分离得到NAC家族基因[4-8]。NAC转录因子主要在高等植物生长发育和胁迫应答中发挥作用，参与调控相关结构基因的表达[9-10]。近年来，大量关于NAC基因参与胁迫应答的研究相继被报道[11-14]，Yu Xingwang等[11]将鹰嘴豆CarNAC4基因转入拟南芥中进行研究，发现CarNAC4转录因子增强了拟南芥的抗旱性和抗盐性；Liu Guanze等[12]将水稻SNAC1基因转入棉花中进行研究，发现过量表达水稻SNAC1基因能够增加根系生长和降低蒸腾速率，从而增强了转基因棉花的抗旱性和抗盐性；Xu Zhongyang等[14]将小麦TaNAC29基因转入拟南芥中，发现TaNAC29通过增强抗氧化系统和参与调控非生物胁迫相关信号途径来减少H2O2的积累和对细胞膜的伤害，从而增加了转基因拟南芥的抗盐性。由此可见，NAC转录因子在植物的胁迫应答反应中起着十分重要的作用，但目前为止，对其分子机制的研究报道主要集中在模式植物和粮食作物上，因此进一步开展NAC转录因子在园艺作物中的研究具有非常重要的意义。
‘云香’水仙（Narcissus tazetta var. chinesis‘Yunxiang’）是福建农林大学园艺植物遗传育种研究所培育出的一个具有自主知识产权的水仙新品种[15]，与传统中国水仙相比，植株大而健壮，鳞球较大且紧实，花期长，花香浓郁，抗病性强，在市场竞争中具有很大的优势。本研究从‘云香’水仙不同开花时期花瓣转录组文库中筛选出一个差异表达的NAC基因，在NCBI上进行Blast比对，初步推测其可能与抗性相关，进而对其进行克隆、生物信息学分析和抗性表达分析，研究该基因与‘云香’水仙抗逆机制的关系，为该基因功能的后续研究奠定基础，为水仙抗性新品种的培育提供分子辅助育种资料。
1 材料与方法
1.1 材料
试验使用的‘云香’水仙为大小一致，无病虫害的一年生子球，由福建农林大学园艺植物遗传育种研究所提供。
1.2 方法
1.2.1 总RNA的提取和反转录 使用多糖多酚植物总RNA快速提取试剂盒（百泰克公司）提取‘云香’水仙的总RNA。1%琼脂糖凝胶电泳分析RNA条带的清晰度、完整性，将质量完好的RNA置于 -80 ℃冰箱中储存备用。用Fermenta Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录，所得cDNA用于克隆目的基因；用TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time）进行逆转录，所得cDNA用于荧光定量分析。具体步骤，见试剂盒说明书。
1.2.2 云香水仙NAC基因的克隆 用DNAMAN对基因序列进行分析，根据其ORF两端序列设计出1对特异性引物。以‘云香’水仙的cDNA为模版，以NAC3153-F和NAC3153-R（表1）分别为上、下游引物进行PCR扩增，克隆NtNAC3153基因ORF。反应采用25 μL体系：Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTP Mix 2 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，Ex Taq酶0.2 μL，ddH2O 18.3 μL。反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，48.9 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环30次；72 ℃延伸5 min。4 ℃恒温保存。将PCR产物进行凝胶电泳后回收目的片段DNA，连接至pMD18-T载体（TaKaRa）后轉化大肠杆菌DH5α，菌液PCR鉴定后送阳性克隆菌液至博尚测序。
1.2.3 NAC3153基因生物信息学分析 使用DNAMAN软件对基因ORF及编码氨基酸序列进行预测；用在线软件ExPASy-ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam）对氨基酸理化性质进行分析；使用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对氨基酸序列进行跨膜预测；利用SOPMA分析蛋白的二级结构，通过Swiss-model（http：//swissmodel，expasy.org/）在线预测蛋白的三级结构。用NCBI中的Blastp程序来检索NtNAC3153的同源蛋白，用DNAMAN进行氨基酸序列的多重比对，在MEGA5.05中用邻近相法进行系统进化树的构建。
1.2.4 ‘云香’水仙NAC3153基因的胁迫表达分析
将‘云香’水仙子球消毒处理后水培，待长出新叶达到3～4 cm后，用100 μmol/L ABA、250 mmol/L NaCl分别浸泡鳞球1、3、6、12、24和48 h，将水培的鳞球置于50 ℃高温，处理同样的时间，用清水处理的水培水仙作为对照。提取清水处理的和ABA、NaCl与高温处理1、3、6、12、24和48 h后的‘云香’水仙叶片RNA，逆转录为cDNA模版，将其稀释10倍后作为初始模板，以中国水仙actin（genebank accession： JN204912.1）为内参基因，NAC3153-Q-F和NAC3153-Q-R为上下游引物检测NtNAC3153基因的表达水平（表1）。qRT-PCR使用25 μL体系：SYBR Premix ExTaqTM（2×）12.5 μL，cDNA 2 μL，Forward Primer（10 μmol/L）0.5 μL，Reverse Primer（10 μmol/L）0.5 μL，ddH2O 9.5 μL。每种处理做3个生物学重复，qPCR时重复3次。qRT- PCR反应程序为：1.94 ℃ 3 min；2.94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40个循环；溶解曲线。采用2-△△Ct法进行目的基因的相对表达量分析。
2 结果与分析
2.1 ‘云香’水仙NAC基因cDNA克隆
以‘云香’水仙RNA 反转录成的cDNA为模板，PCR扩增得到1条1 000 bp左右的条带（图1）。测序结果得到1条为984 bp的cDNA片段，命名为NtNAC3153。结合NCBI上Blast比对，用DNAMAN进行序列分析表明，NtNAC3153包含长度为822 bp的ORF，编码蛋白由273个氨基酸组成（图2）。
2.2 ‘云香’水仙NAC基因的生物信息学分析
理化性质分析表明，NtNAC3153编码蛋白的分子式为C1 363H20 91N373O414S18，分子量为30 903.9 u，等电点为6.09，属于稳定蛋白；NtNAC3153蛋白是亲水性蛋白，其亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸；NtNAC3153蛋白没有明显的跨膜结构域，可能不是膜蛋白。
二级结构预测结果显示，NtNAC3153编码蛋白的氨基酸序列中有59处α-螺旋（Alpha helix），占二级结构的21.53%；55处延伸链（Extended strand），占二级结构的20.07%；25处β-转角（Beta turn），占二级结构的9.12%；135处无规卷曲（Random coil），占二级结构的49.27%（图3-A）。无规则卷曲所占比例最高，推测其作用主要为连接其他二级结构原件。
用Swiss-model分析NtNAC3153蛋白的三级结构（图3-B），结果显示，NtNAC3153蛋白与水稻抗性相关NAC1蛋白的三级结构相似性为51.88%。
将NtNAC3153蛋白的氨基酸序列与其他9个物种的NAC蛋白氨基酸序列进行同源性比对，这9个NAC蛋白分别为：大豆GmNAC（Glycine max，XP_003554001.1）、葡萄VvNAC（Vitis vinifera，XP_
002277068.1V）、木本棉GaNAC（Gossypium arboreum，KHG13515.1）、朝鲜蓟CcNAC（Cynara cardunculus var. scolymus， KVI00075.1）、无油樟AtNAC（Amborella trichopoda，XP_006827310.1）、小果野芭蕉MaNAC（Musa acuminata subsp. malaccensis，XP_009420240.1）、荷花NnNAC（Nelumbo nucifera，XP_010276452.1）、油棕EgNAC（Elaeis guineensis，XP_010938118.1）和绿豆VrNA（Vigna radiata var. radiata，XP_014491001.1）。经DNAMAN比对，结果显示（图4），所有10个NAC转录因子都在N端有一段保守的氨基酸序列，包括约150个氨基酸，含有A、B、C、D、E 5个亚结构域，与前人研究结果相一致，由此断定NtNAC3153为NAC蛋白。 2.3 NtNAC3153蛋白的系统进化树分析
为了研究NtNAC3153蛋白的进化关系，使用MEGA5.05软件将NtNAC3153和与其同源的其他植物NAC转录因子构建了系统进化树（图5）。结果表明，NtNAC3153与同为单子叶植物的小果野芭蕉MaNAC（芭蕉科）、二穗短柄草BdNAC（禾本科）和小米SiNAC（禾本科）亲缘关系最近。
2.4 NtNAC3153基因的胁迫表达分析
荧光定量实验结果表明，ABA、盐胁迫和高温，均可明显诱导NtNAC3153基因的表达。其中，ABA处理后，NtNAC3153基因的表达明显上升，在24 h达到最大值，而后下降；250 mmol/L NaCl处理强烈诱导了NtNAC3153基因的表达，但却出现3 h和24 h两个峰值，呈现出先上升，后下降，再上升，而后又下降的趋势；高温处理后，NtNAC3153基因的表达迅速上升，在3 h即达到最高水平，而后逐渐下降（图6）。
将3种处理后达到最高峰值的时间进行比较，NaCl处理和高温处理后，NtNAC3153基因的表達迅速上升，在3 h即达到最高峰值，而ABA处理后，NtNAC3153基因的表达是逐渐上升，在24 h才达到最高峰。
由此可见，ABA、盐胁迫和高温诱导了NtNAC3153基因的表达，而且随处理时间的延长，趋势明显。由此推断，NtNAC3153基因可能参与了‘云香’水仙的抗逆调控机制。
3 讨论
本研究克隆得到了‘云香’水仙NtNAC3153基因，其编码蛋白在N端有一段保守的氨基酸序列，与其他物种NAC转录因子相同，而C端结构则与其他物种差异很大，高度变异，与前人研究结果一致[16]。已有研究报道表明，NAC转录因子的N端保守氨基酸序列可以被分为A、B、C、D 和E 5个亚结构域[17]，可能参与调控DNA与其他蛋白的结合[18]，而C端是高度变异的，这与不同类型NAC转录因子的不同功能相关。
植物NAC家族成员在响应非生物胁迫的进程中起重要作用，研究NAC转录因子参与植物胁迫反应的机制具有重要的意义。目前，多种植物的NAC基因已经被克隆出来，不同植物NAC基因在逆境胁迫下的表达模式存在差异。小麦中，TaNAC29参与了NaCl、PEG和ABA胁迫的应答反应[14]。胡杨PeNAC1基因能被干旱和高盐胁迫诱导表达，而ABA胁迫处理下相应较弱，超表达PeNAC1基因提高了转基因拟南芥的抗盐能力[19]。甘菊中DlNAC1基因可以被低温、高盐和干旱胁迫分别诱导，对ABA和高温胁迫不敏感[20]。过表达水稻SNAC1基因，增加了棉花的抗旱性和抗盐性[12]。本研究中，‘云香’水仙NtNAC3153基因，能够被ABA、NaCl和高温3种非生物处理分别诱导表达，且趋势明显。在ABA、NaCl和高温处理下，NtNAC3153基因的表达量都是先上升，后下降，在最高处，表达量分别为对照的18倍、24倍和16倍，与小麦TaNAC29基因[14]在ABA处理下和NaCl处理下的表达情况相似。不同的是，在NaCl处理下，NtNAC3153基因的表达在3 h即达到最高峰，而小麦TaNAC29基因在NaCl处理下表达则在12 h才达到最高峰。高温处理时，NtNAC3153基因的表达也是在3 h即达到高峰。由此，可以推测，NtNAC3153基因是‘云香’水仙逆境胁迫应答基因，并且在非生物胁迫处理下有特异的表达模式，但其在参与逆境胁迫中的作用尚不清楚，有待进一步的研究。
转录因子可能同时参与多个基因的表达调控，因而仅通过调控1个转录因子，就可能调控多个相关功能的基因发挥作用，达到改良植物性状的目的[16]。目前，笔者通过对‘云香’水仙NAC转录因子基因进行了克隆，研究分析了其在几种胁迫下的表达情况，初步了解了其在‘云香’水仙遭受胁迫后的应答，对其调控抗性表达提供了直接依据，为进一步通过转基因技术对其进行功能验证打下了基础，为日后培育水仙抗性新品种提供了基因资源。
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