【摘 要】
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目的探讨双荧光素酶报告基因载体构建并鉴定微小RNA-299（miR-299）与IV型胶原α3链（COL4A3）基因的靶标关系,为miR-299调控COL4A3基因影响干细胞成软骨分化研究奠定基础。方法2018年3月至2018年12月,利用生物信息学方法预测miR-299与COL4A3-3’UTR区（3’端非翻译区）的潜在结合位点,并通过PCR法扩增COL4A3-3’UTR野生和突变序列,将其克隆至
【机 构】
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遵义医科大学附属医院骨科，贵州 遵义 563003,广州医科大学第二附属医院骨科 510260,深圳大学医学部生物医学工程系，广东 深圳 518060,中山大学孙逸仙纪念医院急诊科，广州 510275
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目的探讨双荧光素酶报告基因载体构建并鉴定微小RNA-299（miR-299）与IV型胶原α3链（COL4A3）基因的靶标关系,为miR-299调控COL4A3基因影响干细胞成软骨分化研究奠定基础。
方法2018年3月至2018年12月,利用生物信息学方法预测miR-299与COL4A3-3’UTR区（3’端非翻译区）的潜在结合位点,并通过PCR法扩增COL4A3-3’UTR野生和突变序列,将其克隆至psiCHECK-2质粒中构建相应载体,载体鉴定采用酶切法和基因测序法。细胞复苏、扩增并转染,转染分4组,每组3孔,分别为：①COL4A3-WT加miR-299/NC。②COL4A3-WT加miR-299-inhibitor/NC-inhibitor。③COL4A3-MUT加miR-299/NC。④COL4A3-MUT加miR-299-inhibitor/NC-inhibitor；采用双荧光素酶检测试剂盒测定各组荧光素酶活性并行t检验比较组间差异,P<0.05为差异有统计学意义。
结果酶切及DNA测序结果显示psiCHECK-2-COL4A3双荧光素酶报告基因载体构建成功。Luciferase检测显示：野生型COL4A3基因组间比较,miR-299转染组（R/F均值为59.38%）较NC组（R/F均值为100%）荧光素酶活性下降,组间差异有统计学意义（P<0.05）；野生型COL4A3基因加inhibitor后组间比较,miR-299-inhibitor组（R/F均值为153.98%）较NC-inhibitor组（R/F均值为100%）荧光素酶活性上升,组间差异有统计学意义（P<0.05）；突变型COL4A3基因组及突变型组加入inhibitor后组间比较,miR-299转染组（R/F均值为102.09%）及miR-299-inhibitor组（R/F均值为108.51%）较对应NC组（R/F均值为104.70%）及NC-inhibitor组（R/F均值为105.13%）比较,荧光素酶活性差异均无统计学意义（P>0.05）。
结论COL4A3基因3’UTR双荧光素酶报告基因载体构建成功,并通过双荧光素酶实验进一步验证了miR-299直接作用于靶基因COL4A3-3’UTR区域的真实性。
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