论文部分内容阅读
摘要：为寻求适用性广、性能高效的有染料降解菌株，以含多种混合染料的溶液来模拟成份复杂的印染废水，驯化并分离出多株高效染料脱色菌。其中一株菌经分子生物学鉴定为副氧化微杆菌（Microbacterium paraoxydans），对四种不同的活性染料溶液均表现出良好的脱色性。
关键词：活性染料、菌株筛选、生物脱色、菌体吸附
【分类号】：X703
1 引言
纺织印染工业由于生产中废水排放量大，因此成为最大的污染源和水资源消耗者之一，印染废水难降解有机物含量高、污染物浓度高、色度较深，是非常难处理达标的工业废水[1]。能对印染废水中的有机物进行降解的技术，是治理印染工业废水的重要前提。生物技术处理具有运行费用低、无二次污染等优点，符合可持续发展的要求，是寻求新处理方式的研究热点、有巨大的潜力[3]。
为提高系统处理废水能力，增强生物处理系统中微生物群落对高浓度难降解印染废水有机物的能力，寻求优化组合的菌落群体的途径可以是[4]：（1） 寻求高效的降解菌株.（2） 寻找适用性广泛的菌株。（3） 降解菌株的融合技术，创建复合式菌群，乃至人工合成高效脱色菌群落。
本文以四种典型的活性染料溶液作为模拟印染废水，通过逐步加大染料浓度的方式富集培养，从某印染废水处理厂的生物池活性污泥中驯化筛选到一株对多种活性染料均表现出较好脱色作用的细菌，以期为实际解决印染废水提供科学依据。
2 实验方法
2.1 高耐菌种的富集培养
配置200mL含混合染料总浓度为 20mg/L的LB培养基（10g/L蛋白胨、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠、PH=7.2，其中投入活性艳蓝X-BR、活性艳蓝KN-R、活性红X-3B、活性金黄KN-G；四种染料浓度平均分配）。取污水处理生物池内的样品活性污泥10g投于含染料的富集培养基中。在35°C下，以150r/min 的转速震荡培养2d。2d后取出后以1：9的比例接种到新的含混合染料总浓度40mg/L的富集培养基中。随后混合染料总浓度逐步增加，分别为20mg/L、40mg/L 、80mg/L、160mg/L 、200mg/L（染料浓度平均分配）。当混合染料总浓度提升高达200mg/L时，培养2d后，移取10%至新的同染料浓度的富集培养基中，驯化培养3d后，反复一次同样过程。
2.2菌株的划线、涂布、分离分纯
以平板划线法，将最后一次驯化培养的培养液（染料浓度为200mg/L）划线多个LB平板，放置恒温培养箱内35°C 培养。在48小时内，每隔8小时连续观察几个划线的培养平板，对比出现的不同特征菌落，并及时挑出划线分离；再将划线分离的每株菌用稀释涂布法，可得到单个菌株的菌落平板。
2.3高效脱色菌的筛选
将分离纯化的菌株分别接种一环于LB培养基内，培养基投放活性红X-3B（λmax=540nm），染料浓度50mg/L。接种好的培养基在150r/min、35°C下培养2d后按以下方式测算菌的脱色率：将脱色发酵液以10000r/min离心10min，取上清液在用紫外分光度计测其OD值，并用含相同染料浓度的空白发酵菌悬液作为对照、以不含染料的空白发酵液做分光度计调零，计算脱色率，以表示该菌对染料的脱色能力。按下面公式计算出脱色率η。
（脱色清液测值为At、含同染料浓度的空白发酵液测值为A0，后续的脱色研究实验均用此法计算脱色率）
按上述实验方法计算出脱色率最高的菌株，作为优势菌种。
2.4优势菌的菌种鉴定
本实验的脱色优势菌的菌种鉴定采用应用分子生物学的手段对其进行16s rDNA测序鉴定，根据GenBank的数据库对比，来确定菌种。
2.5脱色菌脱色广谱性的测试
配制4份成份相同的LB培养基，分别加入四种不同的活性染料，染料浓度为50mg/L。将培养26h的菌悬液以3%的比例接种到四瓶分别含活性艳蓝KN-R，活性金黄KN-R、活性红X-3B、活性艳蓝X-BR的LB培养基中，将接种后的培养基放恒温培养摇床，调150r/min、35°C下培养48h小时后，放离心机离心后取出观察，同时配制含相同染料浓度的空白发酵液做对比，观察实验现象。
3实验结果与讨论
3.1脱色菌的富集与分离
通过梯度逐步增加染料浓度的方式，从活性污泥中驯化、分离得到多株细菌，菌落特征各不相同，见表1：
表1 菌落形态
五铢菌U1、U2、U3、U4、U5在含染料浓度（活性红X-3B）为50mg/L的LB培养基中的脱色率依次是17.64%、6.44%、44.83%、87.34%、22.78%，因此编号U4的菌株为脱色优势菌种，作为研究对象。
3.2高效脱色菌的鉴定与电子显微镜观察
U4菌株经16S rDNA生物分子技术鉴定为副氧化微杆菌（Microbacterium paraoxydans）；微杆菌属；微杆菌科；放线菌目；放线菌纲；放线菌门。
3.5 U4菌脱色的广谱性测试
分别含四种不同染料的发酵脱色液在离心后，上清液的染料颜色均明显消褪，按照公式测试对四种染料的脱色率分别为：性艳蓝KN-R为75.44%，活性金黄KN-R为82.51%、活性红X-3B为85.82%、活性艳蓝X-BR为70.77%。说明U4脱色菌的脱色活性较高，可作用于多种活性染料。
4.结论
本实验对寻找适用广泛的高效脱色菌株的方法进行探索，此筛选方式不同于其他只使用单种染料的驯化方式，筛选出的菌种脱色的应用性更广泛，利于进一步的工业化應用。
参考文献：
[1] 王辉，张明，李朗晨. 印染废水处理技术现状及发展趋势. 现代商贸工业，2009，（10）：279～280
[ 2] 陈荣圻. 现代活性染料与分散染料的发展. 染料与染色， 2007，（1）：5～13
关键词：活性染料、菌株筛选、生物脱色、菌体吸附
【分类号】：X703
1 引言
纺织印染工业由于生产中废水排放量大，因此成为最大的污染源和水资源消耗者之一，印染废水难降解有机物含量高、污染物浓度高、色度较深，是非常难处理达标的工业废水[1]。能对印染废水中的有机物进行降解的技术，是治理印染工业废水的重要前提。生物技术处理具有运行费用低、无二次污染等优点，符合可持续发展的要求，是寻求新处理方式的研究热点、有巨大的潜力[3]。
为提高系统处理废水能力，增强生物处理系统中微生物群落对高浓度难降解印染废水有机物的能力，寻求优化组合的菌落群体的途径可以是[4]：（1） 寻求高效的降解菌株.（2） 寻找适用性广泛的菌株。（3） 降解菌株的融合技术，创建复合式菌群，乃至人工合成高效脱色菌群落。
本文以四种典型的活性染料溶液作为模拟印染废水，通过逐步加大染料浓度的方式富集培养，从某印染废水处理厂的生物池活性污泥中驯化筛选到一株对多种活性染料均表现出较好脱色作用的细菌，以期为实际解决印染废水提供科学依据。
2 实验方法
2.1 高耐菌种的富集培养
配置200mL含混合染料总浓度为 20mg/L的LB培养基（10g/L蛋白胨、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠、PH=7.2，其中投入活性艳蓝X-BR、活性艳蓝KN-R、活性红X-3B、活性金黄KN-G；四种染料浓度平均分配）。取污水处理生物池内的样品活性污泥10g投于含染料的富集培养基中。在35°C下，以150r/min 的转速震荡培养2d。2d后取出后以1：9的比例接种到新的含混合染料总浓度40mg/L的富集培养基中。随后混合染料总浓度逐步增加，分别为20mg/L、40mg/L 、80mg/L、160mg/L 、200mg/L（染料浓度平均分配）。当混合染料总浓度提升高达200mg/L时，培养2d后，移取10%至新的同染料浓度的富集培养基中，驯化培养3d后，反复一次同样过程。
2.2菌株的划线、涂布、分离分纯
以平板划线法，将最后一次驯化培养的培养液（染料浓度为200mg/L）划线多个LB平板，放置恒温培养箱内35°C 培养。在48小时内，每隔8小时连续观察几个划线的培养平板，对比出现的不同特征菌落，并及时挑出划线分离；再将划线分离的每株菌用稀释涂布法，可得到单个菌株的菌落平板。
2.3高效脱色菌的筛选
将分离纯化的菌株分别接种一环于LB培养基内，培养基投放活性红X-3B（λmax=540nm），染料浓度50mg/L。接种好的培养基在150r/min、35°C下培养2d后按以下方式测算菌的脱色率：将脱色发酵液以10000r/min离心10min，取上清液在用紫外分光度计测其OD值，并用含相同染料浓度的空白发酵菌悬液作为对照、以不含染料的空白发酵液做分光度计调零，计算脱色率，以表示该菌对染料的脱色能力。按下面公式计算出脱色率η。
（脱色清液测值为At、含同染料浓度的空白发酵液测值为A0，后续的脱色研究实验均用此法计算脱色率）
按上述实验方法计算出脱色率最高的菌株，作为优势菌种。
2.4优势菌的菌种鉴定
本实验的脱色优势菌的菌种鉴定采用应用分子生物学的手段对其进行16s rDNA测序鉴定，根据GenBank的数据库对比，来确定菌种。
2.5脱色菌脱色广谱性的测试
配制4份成份相同的LB培养基，分别加入四种不同的活性染料，染料浓度为50mg/L。将培养26h的菌悬液以3%的比例接种到四瓶分别含活性艳蓝KN-R，活性金黄KN-R、活性红X-3B、活性艳蓝X-BR的LB培养基中，将接种后的培养基放恒温培养摇床，调150r/min、35°C下培养48h小时后，放离心机离心后取出观察，同时配制含相同染料浓度的空白发酵液做对比，观察实验现象。
3实验结果与讨论
3.1脱色菌的富集与分离
通过梯度逐步增加染料浓度的方式，从活性污泥中驯化、分离得到多株细菌，菌落特征各不相同，见表1：
表1 菌落形态
五铢菌U1、U2、U3、U4、U5在含染料浓度（活性红X-3B）为50mg/L的LB培养基中的脱色率依次是17.64%、6.44%、44.83%、87.34%、22.78%，因此编号U4的菌株为脱色优势菌种，作为研究对象。
3.2高效脱色菌的鉴定与电子显微镜观察
U4菌株经16S rDNA生物分子技术鉴定为副氧化微杆菌（Microbacterium paraoxydans）；微杆菌属；微杆菌科；放线菌目；放线菌纲；放线菌门。
3.5 U4菌脱色的广谱性测试
分别含四种不同染料的发酵脱色液在离心后，上清液的染料颜色均明显消褪，按照公式测试对四种染料的脱色率分别为：性艳蓝KN-R为75.44%，活性金黄KN-R为82.51%、活性红X-3B为85.82%、活性艳蓝X-BR为70.77%。说明U4脱色菌的脱色活性较高，可作用于多种活性染料。
4.结论
本实验对寻找适用广泛的高效脱色菌株的方法进行探索，此筛选方式不同于其他只使用单种染料的驯化方式，筛选出的菌种脱色的应用性更广泛，利于进一步的工业化應用。
参考文献：
[1] 王辉，张明，李朗晨. 印染废水处理技术现状及发展趋势. 现代商贸工业，2009，（10）：279～280
[ 2] 陈荣圻. 现代活性染料与分散染料的发展. 染料与染色， 2007，（1）：5～13