【摘 要】
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目的构建人蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)慢病毒载体并包装慢病毒颗粒(lentivirus),探讨成肌细胞C2C12中PERK基因慢病毒修饰对内质网应激介
【机 构】
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重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室,重庆医科大学发育生物学与模式动物平台,
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目的构建人蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)慢病毒载体并包装慢病毒颗粒(lentivirus),探讨成肌细胞C2C12中PERK基因慢病毒修饰对内质网应激介导凋亡的作用。方法设计并合成人PERK基因的上、下游引物,采用PCR方法从真核质粒pcDNA3.l(-)-PERK中扩增目的基因。鉴定后与慢病毒载体pWPT-GFP进行重组,再将重组慢病毒载体pWPT-GFP-PERK与慢病毒包装质粒pMD2G、pSPAX2共转入293T细胞中,进一步包装形成PERK慢病毒(LV-PERK);收集转染后48h的细胞上清,体外感染成肌细胞C2C12,观察绿色荧光蛋白(GFP)感染效率,并应用流式细胞仪(FCM)检测内质网应激时重组慢病毒PERK对C2C12细胞增殖凋亡的影响,蛋白质印迹法检测凋亡相关基因Cleaved Caspase-3与Chop蛋白的表达。结果成功构建和包装了滴度为4.2×108 efu/mL的PERK重组慢病毒。FCM检测结果表明,TM+LV-PERK处理组G1期细胞比例为54.37%,低于TM组(77.91%)和LV-GFP组(66.41%);TM+LVPERK处理组S期细胞比例为31.36%,高于TM组(12.14%)和LV-GFP组(16.96%),各组差异均具有统计学意义(P<0.05);此外,TM+LV-PERK处理组细胞凋亡率为25.91%,高于TM组(11.79%)和Ad-GFP组(11.24%),各组差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫印迹检测Cleaved Caspase-3和Chop蛋白的表达与FCM结果一致。结论成功构建和包装LVPERK重组慢病毒颗粒,在内质网应激时,LV-PERK慢病毒可促进C2C12细胞的增殖和凋亡。
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