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摘要：通过对烟草驱动蛋白家族新成员NtTkr尾部的酵母双杂交筛选，得到多个与NtTkr互作的候选蛋白。为进一步验证NtTkr与候选蛋白之间的相互作用，以pGBKT7-NtTkr质粒为模板，PCR扩增烟草NtTKR全长，将其克隆入原核表达载体pMXB10，重组质粒pMXB10-NtTkr-3582经生物公司测序，结果正确。将其转化为BL21（DE3），IPTG诱导其表达目的蛋白，经几丁质法纯化及SDS-PAGE检测，结果表明笔者得到了高纯度的目的蛋白。该试验为进一步运用Pull Down确定NtTkr与候选蛋白之间的体外互作及深入研究该蛋白的其他生物学功能奠定了基础。
关键词：烟草；新驱动蛋白；NtTkr；诱导表达；纯化
中图分类号： S572.01文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）14-0024-03
通过cDNA文库差异筛选方法，成功分离出了一个新基因NtTKR（Nicotiana tabacum kinesin related protein），该基因是驱动蛋白超家族中的一员。NtTkr与现已知的广泛表达的多数植物的驱动蛋白不同[1-3]，该基因仅在植物的叶和各发育时期的胚中优势表达。这一特异表达模式说明它可能在胚胎发生及叶组织分化过程中具有独特的功能[4-5]。
众所周知，多数蛋白质需与其他蛋白质互作才能发挥其自身的作用。因此，为了解NtTkr这一新发现的蛋白的功能，通过对NtTkr尾部的酵母双杂交筛选，得到多个与NtTkr互作的候选蛋白。
为进一步运用Pull-Down试验验证NtTkr与筛选的各候选蛋白之间能否相互作用，以含NtTKR全长的pGBKT7-NtTkr质粒为模板，PCR扩增烟草NtTKR全长，并将其克隆入IMPACT原核表达载体系统新成员pMXB10载体，得到重组质粒pMXB10-NtTkr-3582，将其转化为BL21（DE3），再经IPTG诱导表达、几丁质法纯化及SDS-PAGE检测，结果显示了与预期相符的单一蛋白条带，说明得到了高纯度的纯化NtTkr蛋白。该试验为进一步运用Pull-Down确定NtTkr与候选蛋白之间的体外互作及深入研究该蛋白的其他生物学功能奠定了基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株、质粒
DH5α、BL21（DE3）菌株、原核表达载体pMXB10及含NtTKR全长的pGBKT7-NtTkr质粒由笔者所在实验室保存。
1.1.2工具酶及试剂
PCR所用的KOD-plus高保真酶、10×KOD-缓冲液、dNTPs（浓度均为2 mmol/L）、25 mmol/L MgSO4，均购自ToYoBo公司；在TIANGEN公司购买PCR产物纯化和DNA凝胶回收试剂盒；于TaKaRa公司购买T4 DNA连接酶、DNA标准分子量Marker和限制性内切酶；几丁质亲和柱购自NEB公司；于Fermentas公司购买蛋白分子量标准；其余试剂购于生工生物工程（上海）股份有限公司或Sigma公司。
1.2方法
1.2.1質粒制备与SDS-PAGE
主要参照Sambrook的方法[6]。采用碱裂解法制备质粒，CaCl2法进行转化。SDS-PAGE：各蛋白样品与等体积2×上样缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L DTT，4% SDS，20%甘油，0.12%溴酚蓝，pH值为6.8）混合，煮沸5～10 min后，13 000 r/min离心5 min，取上清液进行SDS-PAGE。
1.2.2PCR扩增及扩增产物的克隆和鉴定
由北京三博远志生物工程公司合成引物，引物序列：正向KNs，5′-NNNNNNNCATATGTCAGAGAACAGATTC-3′，反向Kca，5′-NNNNNNNNGCGGCCGCNTATGCGTTCCTGGTAAATGGC-3′，以含NtTKR全长的pGBKT7-NtTkr质粒为模板进行PCR扩增，产物经电泳检测，结果正确后，用引物两端引入的NdeⅠ和NotⅠ双酶切PCR产物，电泳回收NtTKR片段。
1.2.3原核表达载体构建与鉴定
pMXB10经NdeⅠ和 NotⅠ 双酶切，凝胶回收片段，于16 ℃下用T4 DNA连接酶连接该载体片段与NtTKR片段，16 h后得到连接产物。将该产物转化DH5α超感细胞，经筛选得到成功转化重组质粒的DH5α，扩大培养该细胞，然后提取质粒，酶切鉴定质粒，鉴定结果无误后，将该重组质粒PMXB10-NtTkr-3582送往北京三博远志生物工程公司进行测序。
1.2.4目的蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测
将测序无误的PMXB10-NtTkr-3582质粒转化为BL21（DE3）感受态细胞，转化液涂布在LB 50 mg/mL氨苄青霉素（Amp）培养基上进行筛选，然后挑取单克隆至液体LB Amp培养基中于37 ℃、180 r/min下过夜培养，次日按1 ∶[KG-*3]100稀释菌液，37 ℃ 下培养4 h左右至其D600 nm为0.8时，分别经0、0.06、01、0.6 mmol/L IPTG于37 ℃诱导4 h，取2 mL菌液，于 4 ℃、1 000 r/min 离心1 min，弃上清收集菌体。然后，分别加入 100 μL 去离子水和还原型2×SDS上样缓冲液悬浮菌体，三者混匀后煮沸10 min，取15 μL样品进行SDS-PAGE鉴定[6]。
1.2.5目的蛋白的纯化
目的蛋白的纯化参照李芬等的方法[7-8]，主要步骤如下：（1）细胞粗提物的制备；（2）几丁质柱的平衡；（3）上样；（4）洗柱；（5）内含肽的自我裂解活性的诱导；（6）目的蛋白的洗脱释放；（7）几丁质树脂的再生。于 -70 ℃ 保存纯化的目的蛋白。 2试验结果
2.1烟草NtTkr基因全长的克隆及酶切片段的回收
以pGBKT7-NtTkr质粒为PCR扩增模板进行PCR扩增，产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到与NtTKR基因全长大小相符的3 582 bp大小的扩增带（图1）。NdeⅠ和NotⅠ酶切引入引物两端的PCR产物，凝胶回收的NtTKR片段用于连接反应。
2.2原核表达载体pMXB10-NtTkr-3582的构建与鉴定
凝胶回收NdeⅠ和NotⅠ双酶切后的pMXB10载体片段，该片段与“1.2.1”节同样双酶切的NtTKR片段在T4 DNA连接酶作用下进行连接，连接产物经转化并双酶切鉴定得到与预期相符的6 675 bp的载体片段和3 582 pb的NtTKR全长（图2），且测序无突变，这表明笔者已成功获得正确的原核表达载体pMXB10-NtTkr-3582。
重组质粒PMXB10-NtTkr-3582转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态，转化子经0、0.06、0.1、0.6 mmol/L IPTG诱导培养4 h后收集菌体，煮沸后经12% SDS-PAGE检测蛋白的表达。结果表明，上述3个浓度的IPTG都可诱导细胞表达分子量约160 ku的NtTkr与内含肽的融合蛋白，其中 0.1 mmol/L IPTG诱导物目的蛋白表达量最高（图3）。
2.4目的蛋白的纯化
由于目的蛋白NtTkr-3582与原核表达载体pMXB10上的内含肽形成融合蛋白，而DTT可通过诱导激活内含肽的肽键裂解活性使目标蛋白从几丁质介质上释放出来，而内含肽留在几丁质介质上，从而纯化目的蛋白。SDS-PAGE分析结果显示，表达的NtTkr全长经过几丁质柱纯化得到分子量约132.5 ku的目的蛋白单一条带（图4），与预期蛋白大小相符。
3讨论
已知的植物驱动蛋白多在不同组织中广泛表达[1-3]，烟草[CM（25]新驱动蛋白NtTkr却仅在叶和各发育时期的胚中优势表达[4-5]。这一组织特异性表达模式说明它可能在胚胎發生及叶组织分化过程中具有独特的功能。欲揭示一个未知蛋白的功能，筛选与之互作的蛋白质极其重要，因为生物体内几乎所有的生命活动即DNA的复制、基因的转录、蛋白的合成或信号的转导等，都离不开蛋白质与蛋白质之间的相互作用。通过[CM（25]对烟草幼叶cDNA文库的酵母双杂交筛选，得到多个与NtTkr互作的候选蛋白。由于酵母双杂交的局限性，假阳性的存在不可避免[9-11]，候选蛋白是否真的能够与目的蛋白发生作用必须通过Pull-Down及CoIP或免疫共定位进一步验证[12-14]。所以，本试验以pGBKT7-NtTkr质粒为模板，PCR扩增烟草NtTKR全长，并将其克隆入原核表达载体pMXB10，转入BL21（DE3），诱导其成功表达，为Pull-Down验证该蛋白与候选蛋白互作奠定基础。
pMXB10是经过优化的IMPACT原核表达载体系统的新成员，携带有大肠杆菌mal E基因，含有1个小的蛋白剪切元件，即来自酿酒酵母（Saccharomyces scerevisiae）VMA1基因的内含肽（Sce VMA内含肽，50 ku）[15-16]。内含肽标签中含有几丁质结合域，可以与几丁质珠结合，从而使融合有内含肽与几丁质标签的目的蛋白得到纯化。目前，已有蛋白质工程的许多重要领域应用了这种新型的蛋白融合表达及纯化系统[7，17]，有诸多优点，可非常方便地纯化目的蛋白并获得较高纯度用于抗体制备的目的抗原[7-8]，因此本试验按照经济实用的原则，选用该系统的PMXB10用于NtTkr的表达和纯化，以期获得足够的NtTkr蛋白用于体外确定其与候选蛋白是否存在真正的相互作用。
成功构建重组原核表达载体PMXB10-NtTkr-3582后，将其转化并诱导其表达。因为目的蛋白的可溶性、稳定性和表达量因蛋白而异，所以诱导表达条件须依实际情况进行调整。影响蛋白表达量的因素有培养时间、温度及合适的IPTG工作浓度。为使蛋白达到较大的表达量，须找到合适的IPTG工作浓度。因此，在相同温度和诱导时间条件下，设置4个IPTG浓度，蛋白电泳检测结果表明，IPTG为0.1 mmol/L时的表达量比0.06 mmol/L时要大，但却和0.6 mmol/L差别不大，表明IPTG工作浓度应为0.1 mmol/L。因为当IPTG工作浓度达到0.1 mmol/L时，目的蛋白的表达量不会随着IPTG浓度的升高而升高，而浓度低于0.1 mmol/L，表达量却会受到影响。
在37 ℃下，以最适浓度的IPTG大量诱导细胞，4 h后收集细胞，用DTT释放目的蛋白，经SDS-PAGE检测，得到了与预期大小相符的NtTkr单一条带，该高纯度的目的蛋白利于以后的Pull-Down试验的进行。
本试验成功构建了烟草新驱动蛋白NtTKR基因全长和PMXB10载体大片段连接的融合表达载体并成功地诱导其高效表达，目的蛋白的成功表达和纯化为进一步研究NtTkr与候选蛋白之间的体外互作及深入研究该蛋白的其他生物学功能奠定了坚实的试验基础。
参考文献：
[1]Sablin E P，Kull F J，Cooke R，et al. Crystal structure of the motor domain of the kinesin-related motor ncd[J]. Nature，1996，380（6574）：555-559.
[2]Asbury C L，Fehr A N，Block S M. Kinesin moves by an asymmetric hand-over-hand mechanism[J]. Science，2003，302（5653）：2130-2134. [3]Yildiz A，Tomishige M，Vale R D，et al. Kinesin walks hand-over-hand[J]. Science，2004，303（5658）：676-678.
[4]李芬，吳秀丽，郭君丽. 新基因NtTKR及其同源物LeTKR的生物信息学分析[J]. 河南师范大学学报（自然科学版），2014，42（5）：110-115，124.
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[7]李芬，田树娟，张帅，等. 酵母组蛋白乙酰转移酶Elp3多克隆抗体的制备、鉴定及应用[J]. 生物工程学报，2009，25（8）：1261-1266.
[8]李芬，田树娟，许森，等. 抗人Elp3的N末端抗体制备及在染色质免疫沉淀中的应用[J]. 中国生物化学与分子生物学报，2009，25（10）：919-925.
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[14]Zheng Y，Tan X Y，Pyczek J，et al. Generation and characterization of yeast two-hybrid cDNA libraries derived from two distinct mouse pluripotent cell types[J]. Molecular Biotechnology，2013，54（2）：228-237.
[15]Watanabe T，Ito Y，Yamada T，et al. The roles of the C-terminal domain and type Ⅲ domains of chitinase A1 from Bacillus circulans WL-12 in chitin degradation[J]. Journal of Bacteriology，1994，176（15）：4465-4472.
[16]Chong S，Mersha F B，Comb D G，et al. Single-column purification of free recombinant proteins using a self-cleavable affinity tag derived from a protein splicing element[J]. Gene，1997，192（2）：271-281.
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关键词：烟草；新驱动蛋白；NtTkr；诱导表达；纯化
中图分类号： S572.01文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）14-0024-03
通过cDNA文库差异筛选方法，成功分离出了一个新基因NtTKR（Nicotiana tabacum kinesin related protein），该基因是驱动蛋白超家族中的一员。NtTkr与现已知的广泛表达的多数植物的驱动蛋白不同[1-3]，该基因仅在植物的叶和各发育时期的胚中优势表达。这一特异表达模式说明它可能在胚胎发生及叶组织分化过程中具有独特的功能[4-5]。
众所周知，多数蛋白质需与其他蛋白质互作才能发挥其自身的作用。因此，为了解NtTkr这一新发现的蛋白的功能，通过对NtTkr尾部的酵母双杂交筛选，得到多个与NtTkr互作的候选蛋白。
为进一步运用Pull-Down试验验证NtTkr与筛选的各候选蛋白之间能否相互作用，以含NtTKR全长的pGBKT7-NtTkr质粒为模板，PCR扩增烟草NtTKR全长，并将其克隆入IMPACT原核表达载体系统新成员pMXB10载体，得到重组质粒pMXB10-NtTkr-3582，将其转化为BL21（DE3），再经IPTG诱导表达、几丁质法纯化及SDS-PAGE检测，结果显示了与预期相符的单一蛋白条带，说明得到了高纯度的纯化NtTkr蛋白。该试验为进一步运用Pull-Down确定NtTkr与候选蛋白之间的体外互作及深入研究该蛋白的其他生物学功能奠定了基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株、质粒
DH5α、BL21（DE3）菌株、原核表达载体pMXB10及含NtTKR全长的pGBKT7-NtTkr质粒由笔者所在实验室保存。
1.1.2工具酶及试剂
PCR所用的KOD-plus高保真酶、10×KOD-缓冲液、dNTPs（浓度均为2 mmol/L）、25 mmol/L MgSO4，均购自ToYoBo公司；在TIANGEN公司购买PCR产物纯化和DNA凝胶回收试剂盒；于TaKaRa公司购买T4 DNA连接酶、DNA标准分子量Marker和限制性内切酶；几丁质亲和柱购自NEB公司；于Fermentas公司购买蛋白分子量标准；其余试剂购于生工生物工程（上海）股份有限公司或Sigma公司。
1.2方法
1.2.1質粒制备与SDS-PAGE
主要参照Sambrook的方法[6]。采用碱裂解法制备质粒，CaCl2法进行转化。SDS-PAGE：各蛋白样品与等体积2×上样缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L DTT，4% SDS，20%甘油，0.12%溴酚蓝，pH值为6.8）混合，煮沸5～10 min后，13 000 r/min离心5 min，取上清液进行SDS-PAGE。
1.2.2PCR扩增及扩增产物的克隆和鉴定
由北京三博远志生物工程公司合成引物，引物序列：正向KNs，5′-NNNNNNNCATATGTCAGAGAACAGATTC-3′，反向Kca，5′-NNNNNNNNGCGGCCGCNTATGCGTTCCTGGTAAATGGC-3′，以含NtTKR全长的pGBKT7-NtTkr质粒为模板进行PCR扩增，产物经电泳检测，结果正确后，用引物两端引入的NdeⅠ和NotⅠ双酶切PCR产物，电泳回收NtTKR片段。
1.2.3原核表达载体构建与鉴定
pMXB10经NdeⅠ和 NotⅠ 双酶切，凝胶回收片段，于16 ℃下用T4 DNA连接酶连接该载体片段与NtTKR片段，16 h后得到连接产物。将该产物转化DH5α超感细胞，经筛选得到成功转化重组质粒的DH5α，扩大培养该细胞，然后提取质粒，酶切鉴定质粒，鉴定结果无误后，将该重组质粒PMXB10-NtTkr-3582送往北京三博远志生物工程公司进行测序。
1.2.4目的蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测
将测序无误的PMXB10-NtTkr-3582质粒转化为BL21（DE3）感受态细胞，转化液涂布在LB 50 mg/mL氨苄青霉素（Amp）培养基上进行筛选，然后挑取单克隆至液体LB Amp培养基中于37 ℃、180 r/min下过夜培养，次日按1 ∶[KG-*3]100稀释菌液，37 ℃ 下培养4 h左右至其D600 nm为0.8时，分别经0、0.06、01、0.6 mmol/L IPTG于37 ℃诱导4 h，取2 mL菌液，于 4 ℃、1 000 r/min 离心1 min，弃上清收集菌体。然后，分别加入 100 μL 去离子水和还原型2×SDS上样缓冲液悬浮菌体，三者混匀后煮沸10 min，取15 μL样品进行SDS-PAGE鉴定[6]。
1.2.5目的蛋白的纯化
目的蛋白的纯化参照李芬等的方法[7-8]，主要步骤如下：（1）细胞粗提物的制备；（2）几丁质柱的平衡；（3）上样；（4）洗柱；（5）内含肽的自我裂解活性的诱导；（6）目的蛋白的洗脱释放；（7）几丁质树脂的再生。于 -70 ℃ 保存纯化的目的蛋白。 2试验结果
2.1烟草NtTkr基因全长的克隆及酶切片段的回收
以pGBKT7-NtTkr质粒为PCR扩增模板进行PCR扩增，产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到与NtTKR基因全长大小相符的3 582 bp大小的扩增带（图1）。NdeⅠ和NotⅠ酶切引入引物两端的PCR产物，凝胶回收的NtTKR片段用于连接反应。
2.2原核表达载体pMXB10-NtTkr-3582的构建与鉴定
凝胶回收NdeⅠ和NotⅠ双酶切后的pMXB10载体片段，该片段与“1.2.1”节同样双酶切的NtTKR片段在T4 DNA连接酶作用下进行连接，连接产物经转化并双酶切鉴定得到与预期相符的6 675 bp的载体片段和3 582 pb的NtTKR全长（图2），且测序无突变，这表明笔者已成功获得正确的原核表达载体pMXB10-NtTkr-3582。
重组质粒PMXB10-NtTkr-3582转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态，转化子经0、0.06、0.1、0.6 mmol/L IPTG诱导培养4 h后收集菌体，煮沸后经12% SDS-PAGE检测蛋白的表达。结果表明，上述3个浓度的IPTG都可诱导细胞表达分子量约160 ku的NtTkr与内含肽的融合蛋白，其中 0.1 mmol/L IPTG诱导物目的蛋白表达量最高（图3）。
2.4目的蛋白的纯化
由于目的蛋白NtTkr-3582与原核表达载体pMXB10上的内含肽形成融合蛋白，而DTT可通过诱导激活内含肽的肽键裂解活性使目标蛋白从几丁质介质上释放出来，而内含肽留在几丁质介质上，从而纯化目的蛋白。SDS-PAGE分析结果显示，表达的NtTkr全长经过几丁质柱纯化得到分子量约132.5 ku的目的蛋白单一条带（图4），与预期蛋白大小相符。
3讨论
已知的植物驱动蛋白多在不同组织中广泛表达[1-3]，烟草[CM（25]新驱动蛋白NtTkr却仅在叶和各发育时期的胚中优势表达[4-5]。这一组织特异性表达模式说明它可能在胚胎發生及叶组织分化过程中具有独特的功能。欲揭示一个未知蛋白的功能，筛选与之互作的蛋白质极其重要，因为生物体内几乎所有的生命活动即DNA的复制、基因的转录、蛋白的合成或信号的转导等，都离不开蛋白质与蛋白质之间的相互作用。通过[CM（25]对烟草幼叶cDNA文库的酵母双杂交筛选，得到多个与NtTkr互作的候选蛋白。由于酵母双杂交的局限性，假阳性的存在不可避免[9-11]，候选蛋白是否真的能够与目的蛋白发生作用必须通过Pull-Down及CoIP或免疫共定位进一步验证[12-14]。所以，本试验以pGBKT7-NtTkr质粒为模板，PCR扩增烟草NtTKR全长，并将其克隆入原核表达载体pMXB10，转入BL21（DE3），诱导其成功表达，为Pull-Down验证该蛋白与候选蛋白互作奠定基础。
pMXB10是经过优化的IMPACT原核表达载体系统的新成员，携带有大肠杆菌mal E基因，含有1个小的蛋白剪切元件，即来自酿酒酵母（Saccharomyces scerevisiae）VMA1基因的内含肽（Sce VMA内含肽，50 ku）[15-16]。内含肽标签中含有几丁质结合域，可以与几丁质珠结合，从而使融合有内含肽与几丁质标签的目的蛋白得到纯化。目前，已有蛋白质工程的许多重要领域应用了这种新型的蛋白融合表达及纯化系统[7，17]，有诸多优点，可非常方便地纯化目的蛋白并获得较高纯度用于抗体制备的目的抗原[7-8]，因此本试验按照经济实用的原则，选用该系统的PMXB10用于NtTkr的表达和纯化，以期获得足够的NtTkr蛋白用于体外确定其与候选蛋白是否存在真正的相互作用。
成功构建重组原核表达载体PMXB10-NtTkr-3582后，将其转化并诱导其表达。因为目的蛋白的可溶性、稳定性和表达量因蛋白而异，所以诱导表达条件须依实际情况进行调整。影响蛋白表达量的因素有培养时间、温度及合适的IPTG工作浓度。为使蛋白达到较大的表达量，须找到合适的IPTG工作浓度。因此，在相同温度和诱导时间条件下，设置4个IPTG浓度，蛋白电泳检测结果表明，IPTG为0.1 mmol/L时的表达量比0.06 mmol/L时要大，但却和0.6 mmol/L差别不大，表明IPTG工作浓度应为0.1 mmol/L。因为当IPTG工作浓度达到0.1 mmol/L时，目的蛋白的表达量不会随着IPTG浓度的升高而升高，而浓度低于0.1 mmol/L，表达量却会受到影响。
在37 ℃下，以最适浓度的IPTG大量诱导细胞，4 h后收集细胞，用DTT释放目的蛋白，经SDS-PAGE检测，得到了与预期大小相符的NtTkr单一条带，该高纯度的目的蛋白利于以后的Pull-Down试验的进行。
本试验成功构建了烟草新驱动蛋白NtTKR基因全长和PMXB10载体大片段连接的融合表达载体并成功地诱导其高效表达，目的蛋白的成功表达和纯化为进一步研究NtTkr与候选蛋白之间的体外互作及深入研究该蛋白的其他生物学功能奠定了坚实的试验基础。
参考文献：
[1]Sablin E P，Kull F J，Cooke R，et al. Crystal structure of the motor domain of the kinesin-related motor ncd[J]. Nature，1996，380（6574）：555-559.
[2]Asbury C L，Fehr A N，Block S M. Kinesin moves by an asymmetric hand-over-hand mechanism[J]. Science，2003，302（5653）：2130-2134. [3]Yildiz A，Tomishige M，Vale R D，et al. Kinesin walks hand-over-hand[J]. Science，2004，303（5658）：676-678.
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[6]Sambrook J，Frisch E F，Maniatis T E. Molecular cloing：a laboratory manual[M]. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989：880-885.
[7]李芬，田树娟，张帅，等. 酵母组蛋白乙酰转移酶Elp3多克隆抗体的制备、鉴定及应用[J]. 生物工程学报，2009，25（8）：1261-1266.
[8]李芬，田树娟，许森，等. 抗人Elp3的N末端抗体制备及在染色质免疫沉淀中的应用[J]. 中国生物化学与分子生物学报，2009，25（10）：919-925.
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