论文部分内容阅读
摘 要 目的：目前亲权鉴定案件越来越多，但在鉴定中经常会见到基因缺失和基因突变的情况，本文通过对215例亲权鉴定案件结果的统计，分析和研究其产生的原因。 方法：收集215例亲权鉴定案件的506份样本，应用Identifiler-plus试剂盒和GoldenEye-20A免提试剂盒复核扩增，扩增产物经过3130XL基因分析仪进行毛细管电泳检测，使用分析软件分析结果。结果：215例亲权鉴定案件中认定亲子关系案件206例，排除亲子关系案件9例；等位基因缺失1例，等位基因突变8例。结论：Identifiler-plus试剂盒和GoldenEye-20A免提试剂盒均有较高的效能，可以满足本地区亲权鉴定需要；STR基因座具有遗传稳定性，但存在基因缺失和突变的情况。
关键词 亲权鉴定 STR基因座 基因缺失 基因突变
作者简介：张戎、邓宝斌，山西忻州市公安局。
中图分类号：D668 文献标识码：A DOI：10.19387/j.cnki.1009-0592.2016.10.089
STR基因座是人类遗传学中重要的遗传标记，是目前个体识别和亲子鉴定最常用的遗传标记，具有高度多态性和遗传稳定性，但同时也存在一定数量的遗传突变。本文应用Identifiler-plus试剂盒和GoldenEye-20A免提试剂盒对山西忻州地区2013年-2015年215例亲权鉴定案件的结果进行统计和观察，分析其结果产生的原因，为今后研究的和工作提供数据参考。
一、材料与方法
（一）样本的收集
收集山西省忻州市公安局2013年1月-2015年12月三年受理的215例亲权鉴定案件的506份样本，均为FTA血样采集卡。215例亲权鉴定中，三联体案例57例，占26.5%；二联体案例158例，占73.5%。二联体案例数是三联体案例数的2.8倍。
（二）樣本DNA的提取、扩增
本次收集的215例案件，样本的提取方法均采用chelex-100法提取DNA，具体操作步骤按《中华人民共和国公共安全行业标准》GA/T383-2014中方法进行。40例案件样本采用美国ABI公司生产的Identifiler-plus试剂盒复合扩增15个STR基因座，反应体系均为10ul。热循环参数为：95℃11min，94℃20s，59℃3min，60℃30min，28个循环，4℃保存。175例案件样本采用北京基点认知技术有限公司生产的GoldenEye-20A免提试剂盒复核扩增19个STR基因座，反应体系均为10ul。热循环参数为：95℃5min，94℃30s，60℃1min，70℃1min，28个循环，60℃60min，15℃保存。
（三）样本的电泳检测
采用Identifiler-plus试剂盒扩增的产物，在电泳时每个样本均使用Hi-Di甲酰胺9.8ul与Liz 500混合物0.2ul混匀，加入扩增产物1ul，待检；采用GoldenEye-20A免提试剂盒扩增的产物，在电泳时每个样本均使用Hi-Di甲酰胺9.5ul与orange 500混合物0.5ul混匀，加入扩增产物1ul，待检。上述样本均使用美国ABI公司生产的3130XL基因分析仪进行毛细管电泳检测，通过运用分析软件（GeneMapper v3.0/GeneMapper ID-X）分析所得结果。
（四）数据处理
案例所得数据均按照《中华人民共和国公共安全行业标准》GA/T965-2011中方法计算父权指数（PI）和父权相对机会（RCP）。
二、 结果
（一）亲权鉴定案例排除和认定情况统计
表1：215例案件中排除亲子关系案件情况
表2：19个STR基因座非父排除概率
215例案件中，排除亲子关系案件9例，占4.2%，其中三联体案件6例，二联体案件3例；认定亲子关系案件206例，占95.8%，其中三联体案件51例，二联体案件155例。排除亲子关系案件情况见表1。19个STR基因座非父排除概率情况见表2。
（二）亲权鉴定案例中遗传变异情况
随着所检测的遗传标记数目的增加，遗传变异数目的增加亦可能成正比。这些出现的遗传变异会使亲代之间的遗传规律表现为不符合 。215例案件中，肯定亲子关系案件206例，占95.8%，其中三联体51例，二联体155例。共发现基因缺失1例，基因突变8例，均为一步突变。9例案件的STR基因座突变情况及概率见表3。
表3：9例案件中STR基因座丢失及突变情况
三、讨论
（一）亲权鉴定系统的效能分析
本文中案例检测均使用CODIS系统中的15个STR基因座。D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、CSF1PO、THO1、vWA、TPOX、FGA等13个STR基因座均为美国“DNA联合索引系统”，是全球公认的DNA检测应用遗传标记系统 ，有相关文献报道，其基因突变率一般在0-7€？0-3之间；另外，本文中案例还应用GoldenEye-20A免提试剂盒检测，在CODIS系统之外增加Penta D、Penta E、D6S1043和D12S391四个STR基因座。文献报道及在实际工作中，我们普遍认为GoldenEye-20A免提试剂盒较稳定，可用于各类型检材 ，试剂盒的检测灵敏度均为0.125ng，且具有较高的个体识别率和非父排除率，可用于法庭科学的检案和建库 。本文中统计案例使用该两种系统进行检验，所得数据结果准确、可靠，三联体认定案件中RCP≥99.99%，具有较高的检测效能和应用价值。 （二）STR基因座丢失及突变情况讨论
1. 基因座丢失原因分析：
本文案例中有1例出现STR基因座丢失的情况：父亲基因型为15.2，母亲基因型为14，而子代只出现基因型14，丢失父方基因型。有文献报道，在使用STR试剂盒检验时，有可能出现基因座丢失的现象。这是由于DNA模板在引物的3’端附近结合，此处存在DNA多态性、碱基缺失或者插入，PCR扩增时相应的引物无法完成退火有关，即由于某一PCR扩增系统中的引物无法识别突变的引物，从而造成引物不能与DNA模板正常结合，DNA模板不能得到有效扩增而出现基因座丢失。
2.基因座突变原因分析：
在实际工作中，可以导致亲代和子代的遗传规律不符合的重要原因是突变，可能会影响鉴定结果的判断，亦可能造成误读。不同基因座的突变率是不同的，一般而言，选用的遗传标记突变率应低于0.2%。研究发现，可以形成STR多态性的原因之一是复制滑动突变，造成STR基因座基因突变的主要原因也是复制滑动突变。其突变多表现为等位基因减少或者增加一个基序，其中只涉及一个基序的减少或者增加均称为一步突变，有相关文献曾做过调查表明一步突变大约可以占STR基因座突变的90%，与本文中突变数据的情况相一致。
在推测发生突变的来源时，可以认为亲代可能为子代提供新等位基因的母方或者父方之间的差异大小来判定，一般认为差异小的就是新等位基因的来源；如果出现差异相同的情况，则判定为无法确定其来源。依据这一方法，可以根据亲代的等位基因对子代进行推测，由此，我们一般可以把STR的基因座突變分为“父源性基因座突变”、“母源性基因座突变”和“无法确定突变”。在本文8例突变案例中，突变来源于父方的有5例，来源于母方的有3例。研究表明，STR基因座的突变可能与性别有一定的关系，通过资料收集，发现其规律一般为父亲的基因座突变相较母亲多。男性与女性的突变比例观察值为17：3，分析其产生的原因：一是因为精子细胞分裂次数是卵细胞的10倍；二是由于精子染色体碱基替换的积累是卵细胞的2倍。研究表明基因突变率和细胞分裂次数有密切的关系，因为DNA进行复制的次数越多，可能因滑动错配的几率就会越大。本文中数据与文献报道情况相符。
（三）其它原因分析
观察本文中数据可知，215例亲缘鉴定中三联体案例有57例，二联体案例有158例。二联体案例较多，分析其原因与被鉴定人生活的环境有很大关系。笔者通过询问得知，二联体亲缘鉴定中，大多为母方缺失，究其原因在女方生育子女后，因家庭贫困或因本是被拐卖妇女逃脱等原因离家；而父方缺失多因未婚生子。
在山西省忻州市的各个村镇中，未给孩子及时办理户口的情况多有发生，分析其原因有四点：
1.违反计划生育政策，没有或没有能力缴纳社会抚养费，无法办理户口。
2.生育子女时，未在医院生育，没有办理医学出生证明，无法正常办理户口。
3.对户籍相关法律法规不清楚或是没有正确的认识，未及时办理户口。
4.生产活动范围相对狭隘，多因子女上学需要办理户口。
笔者由此建议，应在农村中加大相关法律法规的宣传和教育，相关部门开设绿色便民措施，及时办理户口，为日常生活和出行提供便利和保障。
注释：
侯一平，等.法医物证学.人民卫生出版社.2005.221-223.
邓志辉、吴国光、程良红，等.13个STR基因座在亲子鉴定案例中的基因突变观察.中国法医学杂志.2003，18（3）.150-153.
王洁、黄艳梅、张庆霞，等. 国产GoldeneyeTM20A试剂盒性能指标验证.中国法医学杂志.2012，27（1）.12-15.
周密、韦凡、唐涛，等.GoldeneyeTM DNA ID System 20A试剂盒确证实验.皖南医学院学报.2011，30（3）.235-237.
关键词 亲权鉴定 STR基因座 基因缺失 基因突变
作者简介：张戎、邓宝斌，山西忻州市公安局。
中图分类号：D668 文献标识码：A DOI：10.19387/j.cnki.1009-0592.2016.10.089
STR基因座是人类遗传学中重要的遗传标记，是目前个体识别和亲子鉴定最常用的遗传标记，具有高度多态性和遗传稳定性，但同时也存在一定数量的遗传突变。本文应用Identifiler-plus试剂盒和GoldenEye-20A免提试剂盒对山西忻州地区2013年-2015年215例亲权鉴定案件的结果进行统计和观察，分析其结果产生的原因，为今后研究的和工作提供数据参考。
一、材料与方法
（一）样本的收集
收集山西省忻州市公安局2013年1月-2015年12月三年受理的215例亲权鉴定案件的506份样本，均为FTA血样采集卡。215例亲权鉴定中，三联体案例57例，占26.5%；二联体案例158例，占73.5%。二联体案例数是三联体案例数的2.8倍。
（二）樣本DNA的提取、扩增
本次收集的215例案件，样本的提取方法均采用chelex-100法提取DNA，具体操作步骤按《中华人民共和国公共安全行业标准》GA/T383-2014中方法进行。40例案件样本采用美国ABI公司生产的Identifiler-plus试剂盒复合扩增15个STR基因座，反应体系均为10ul。热循环参数为：95℃11min，94℃20s，59℃3min，60℃30min，28个循环，4℃保存。175例案件样本采用北京基点认知技术有限公司生产的GoldenEye-20A免提试剂盒复核扩增19个STR基因座，反应体系均为10ul。热循环参数为：95℃5min，94℃30s，60℃1min，70℃1min，28个循环，60℃60min，15℃保存。
（三）样本的电泳检测
采用Identifiler-plus试剂盒扩增的产物，在电泳时每个样本均使用Hi-Di甲酰胺9.8ul与Liz 500混合物0.2ul混匀，加入扩增产物1ul，待检；采用GoldenEye-20A免提试剂盒扩增的产物，在电泳时每个样本均使用Hi-Di甲酰胺9.5ul与orange 500混合物0.5ul混匀，加入扩增产物1ul，待检。上述样本均使用美国ABI公司生产的3130XL基因分析仪进行毛细管电泳检测，通过运用分析软件（GeneMapper v3.0/GeneMapper ID-X）分析所得结果。
（四）数据处理
案例所得数据均按照《中华人民共和国公共安全行业标准》GA/T965-2011中方法计算父权指数（PI）和父权相对机会（RCP）。
二、 结果
（一）亲权鉴定案例排除和认定情况统计
表1：215例案件中排除亲子关系案件情况
表2：19个STR基因座非父排除概率
215例案件中，排除亲子关系案件9例，占4.2%，其中三联体案件6例，二联体案件3例；认定亲子关系案件206例，占95.8%，其中三联体案件51例，二联体案件155例。排除亲子关系案件情况见表1。19个STR基因座非父排除概率情况见表2。
（二）亲权鉴定案例中遗传变异情况
随着所检测的遗传标记数目的增加，遗传变异数目的增加亦可能成正比。这些出现的遗传变异会使亲代之间的遗传规律表现为不符合 。215例案件中，肯定亲子关系案件206例，占95.8%，其中三联体51例，二联体155例。共发现基因缺失1例，基因突变8例，均为一步突变。9例案件的STR基因座突变情况及概率见表3。
表3：9例案件中STR基因座丢失及突变情况
三、讨论
（一）亲权鉴定系统的效能分析
本文中案例检测均使用CODIS系统中的15个STR基因座。D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、CSF1PO、THO1、vWA、TPOX、FGA等13个STR基因座均为美国“DNA联合索引系统”，是全球公认的DNA检测应用遗传标记系统 ，有相关文献报道，其基因突变率一般在0-7€？0-3之间；另外，本文中案例还应用GoldenEye-20A免提试剂盒检测，在CODIS系统之外增加Penta D、Penta E、D6S1043和D12S391四个STR基因座。文献报道及在实际工作中，我们普遍认为GoldenEye-20A免提试剂盒较稳定，可用于各类型检材 ，试剂盒的检测灵敏度均为0.125ng，且具有较高的个体识别率和非父排除率，可用于法庭科学的检案和建库 。本文中统计案例使用该两种系统进行检验，所得数据结果准确、可靠，三联体认定案件中RCP≥99.99%，具有较高的检测效能和应用价值。 （二）STR基因座丢失及突变情况讨论
1. 基因座丢失原因分析：
本文案例中有1例出现STR基因座丢失的情况：父亲基因型为15.2，母亲基因型为14，而子代只出现基因型14，丢失父方基因型。有文献报道，在使用STR试剂盒检验时，有可能出现基因座丢失的现象。这是由于DNA模板在引物的3’端附近结合，此处存在DNA多态性、碱基缺失或者插入，PCR扩增时相应的引物无法完成退火有关，即由于某一PCR扩增系统中的引物无法识别突变的引物，从而造成引物不能与DNA模板正常结合，DNA模板不能得到有效扩增而出现基因座丢失。
2.基因座突变原因分析：
在实际工作中，可以导致亲代和子代的遗传规律不符合的重要原因是突变，可能会影响鉴定结果的判断，亦可能造成误读。不同基因座的突变率是不同的，一般而言，选用的遗传标记突变率应低于0.2%。研究发现，可以形成STR多态性的原因之一是复制滑动突变，造成STR基因座基因突变的主要原因也是复制滑动突变。其突变多表现为等位基因减少或者增加一个基序，其中只涉及一个基序的减少或者增加均称为一步突变，有相关文献曾做过调查表明一步突变大约可以占STR基因座突变的90%，与本文中突变数据的情况相一致。
在推测发生突变的来源时，可以认为亲代可能为子代提供新等位基因的母方或者父方之间的差异大小来判定，一般认为差异小的就是新等位基因的来源；如果出现差异相同的情况，则判定为无法确定其来源。依据这一方法，可以根据亲代的等位基因对子代进行推测，由此，我们一般可以把STR的基因座突變分为“父源性基因座突变”、“母源性基因座突变”和“无法确定突变”。在本文8例突变案例中，突变来源于父方的有5例，来源于母方的有3例。研究表明，STR基因座的突变可能与性别有一定的关系，通过资料收集，发现其规律一般为父亲的基因座突变相较母亲多。男性与女性的突变比例观察值为17：3，分析其产生的原因：一是因为精子细胞分裂次数是卵细胞的10倍；二是由于精子染色体碱基替换的积累是卵细胞的2倍。研究表明基因突变率和细胞分裂次数有密切的关系，因为DNA进行复制的次数越多，可能因滑动错配的几率就会越大。本文中数据与文献报道情况相符。
（三）其它原因分析
观察本文中数据可知，215例亲缘鉴定中三联体案例有57例，二联体案例有158例。二联体案例较多，分析其原因与被鉴定人生活的环境有很大关系。笔者通过询问得知，二联体亲缘鉴定中，大多为母方缺失，究其原因在女方生育子女后，因家庭贫困或因本是被拐卖妇女逃脱等原因离家；而父方缺失多因未婚生子。
在山西省忻州市的各个村镇中，未给孩子及时办理户口的情况多有发生，分析其原因有四点：
1.违反计划生育政策，没有或没有能力缴纳社会抚养费，无法办理户口。
2.生育子女时，未在医院生育，没有办理医学出生证明，无法正常办理户口。
3.对户籍相关法律法规不清楚或是没有正确的认识，未及时办理户口。
4.生产活动范围相对狭隘，多因子女上学需要办理户口。
笔者由此建议，应在农村中加大相关法律法规的宣传和教育，相关部门开设绿色便民措施，及时办理户口，为日常生活和出行提供便利和保障。
注释：
侯一平，等.法医物证学.人民卫生出版社.2005.221-223.
邓志辉、吴国光、程良红，等.13个STR基因座在亲子鉴定案例中的基因突变观察.中国法医学杂志.2003，18（3）.150-153.
王洁、黄艳梅、张庆霞，等. 国产GoldeneyeTM20A试剂盒性能指标验证.中国法医学杂志.2012，27（1）.12-15.
周密、韦凡、唐涛，等.GoldeneyeTM DNA ID System 20A试剂盒确证实验.皖南医学院学报.2011，30（3）.235-237.