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摘要:从公园的花土中分离出一株相对高产碱性果胶酶的菌株,经16srDNA鉴定为枯草芽孢杆菌,命名为TCCCC11286。在初步的酶学性质研究中表明,它耐高温耐碱,最适作用温度为45℃,到60℃仍有酶活,最适作用pH为8.0。经过培养基的初步优化,菌株TCCCC11286对于富含铵根离子的化学物质和淀粉具有很好的利用能力。本实验还对酶的分离纯化进行了初步研究。
关键词:枯草芽孢杆菌 优化 分离纯化
Abstract:A bacterial strainrelativilyhighly producingalkalinepectate lyasewasobtained from the soil of variaseflowersin the Park.The bacteriumwas primarily identifiedasastrainthat belongs to Bacillus sp.based on 16s r DNAand it was named as TCCCC11286.Study on the characteristics of alkalinepectinaseshowedthatit was high temperature resistant and alkali proof.The highestactivityoftheenzymewas at pH8.0 and 45℃,even moreit was more activity at 60℃.Under the optional fermentation conditions,strain TCCCC11286 could make good useofcornstarch and chemical substances full ofNH4+.Furthermore,we preliminarily seperated and purified the pectinase.
Keyword:Bacillus sp. optimization separation and purification.
果胶酶(pectinases)是一类能分解植物组织中果胶质(由D-半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键连接形成的直链状的聚合物)的酶系,按底物专一性、对糖苷键作用机理、切断方式等,大致可分9种组分。碱性果胶酶是指在碱性范围内具有较高活性的果胶酶,一般多指聚半乳糖醛酸裂解酶(polygalacturonate lyase,PGL) [1]。果胶酶广泛应用于食品工业的果汁加工,果酒澄清,饮用酶制剂,生物农药,而碱性果胶酶除在植物病毒的纯化、纸浆漂白等方面得到应用外,已成为绵织物处理过程中至关重要的生物制剂。用果胶酶可以用于不能进行碱精练的织物(如绵和羊毛混纺织物)处理 [2],而且处理后的织物损伤小,织物柔软丰满,对环境的污染少,操作人员的工作环境和设备的腐蚀情况均比碱精练好[3-6]。
自1972年日本学者Koki Horikoshi首次用嗜碱细菌制得碱性果胶酶以来 [7],至今已分离鉴定出几十种碱性果胶酶,但其中能应用于工业化生产的不多,仅Novo Nordisk公司在1999年研制出用基因工程菌生产的碱性果胶酶Bio-Prep,以及于2003年推出的一种碱性果胶裂解酶ScourzymeL,但高昂的生产成本限制了其广泛应用 [8]。因此,如何提高、提纯PGL的产量并降低生产成本是其开发应用的关键。本实验针对从土壤中分离得的一株相对酶活较高的菌株,进行优化、提纯方面的研究,为进一步应用于工业生产提供依据。
1.材料和方法
1.1菌种
枯草芽孢杆菌TCCC11286,这是本实验中心菌种库的编号,筛选编号为521
1.2试剂
Polygalacturonic acid Beijing Biodee Biotechnology
十六烷基三甲基溴化铵 北京奥博星生物技术有限任公司
果胶 天门峡富达果胶工业有限公司
聚乙二醇 天津天泰精细化学品有限公司T.T.R.C
甘氨酸 天津市珠江卫生材料厂
无水葡萄糖 国药集团化学试剂有限公司
可溶性淀粉 天津市四通化工厂
酵母粉 OXOID LTD,BASINGSTOKE,HAMPSIRE,ENGLAND
TPYPTONE OXOID LTD.,BASINGSTOKE,HAMPSIRE,ENGLAND
Agar Japan
磷酸 天津市北方天医化学试剂厂
NaOH 天津市北方天医化学试剂厂
(NH4)2SO4 天津市风船化学试剂科技有限公司
1.3培养基
(1)LB培养基(g/L):蛋白胨20、酵母粉10、NaCl 20于121℃下灭菌20min
(2)种子培养基(g/L):蔗糖20、蛋白胨10、玉米浆30、MgSO4 1、 K2HPO4 18.4、KH2PO4 6、pH=7于121℃下灭菌20min
(3)发酵液(g/L):乳糖20、蛋白胨3、CaCl2 3、果胶20、酵母膏3、MgCl2 0.2、pH=7.0~7.5于121℃下灭菌20min
(4)筛选培养基(g/L):果胶5、酵母膏5、蛋白胨5、MgSO4 2、K2HPO4 1、琼脂20、pH=7.0~7.5于121℃下灭菌20min
(5)斜面培养基(g/L):葡萄糖10、蛋白胨5、牛肉膏5、NaCl 5、琼脂条20、pH=7.0于121℃下灭菌20min
(6)优化发酵培养基(g/L):果胶20、淀粉20、NH4NO3 15、MgCl2 0.2、MgSO4 2、CaCl2 3、K2HPO4 4、pH=8.0于121℃下灭菌0min
(7)测生长曲线用无机盐种子培养基(g/L):蔗糖20、(NH4)2 SO4 40、MgSO4·7H2O 0.2、K2HPO4 4、KH2PO4 0.3、pH=6.5～7.0于121℃下灭菌20min
(8)测生长曲线用无机盐发酵培养基(g/L):蔗糖40、(NH4)2SO4 40、MgSO4·7H2O 0.4、K2HPO4-KH2PO4 0.05mol/L、FeSO4 0.2 pH=6.5～7.0于121℃下灭菌20min
1.4筛选方法
1.4.1富集培养
将从公园中采集到的月季、马兰、竹、美人蕉、菊、迎春、松的培养土分别称取5g土样溶于45ml去离子水中,吸取5ml菌悬液加入到45ml(用250ml锥形瓶配制,121℃灭菌20min)的富集培养基中,作摇床培养,培养温度为37℃,转速为100rpm,培养24h。
1.4.2初筛
将富集培养的样品稀释分离后涂布在筛选培养基中,放入37℃倒置培养24h观察,并在平板倒入少量(1%)十六烷基三甲溴化铵,静置10min观察并测量菌落周围出现透明圈的直径(d/cm)和菌落直径(d/cm),有透明圈者则为有果胶酶活性的菌株。将产果胶酶的菌种接种于斜面培养基贮藏于4℃下。
1.4.3复筛
将初筛得到的51株菌接种到斜面,37℃,培养24h后,接种到摇瓶进行一级发酵,200r/min,24h后对发酵液进行酶活测定。
1.5培养方法
再挑取单菌落接入种子培养液中。(种子培养液按25ml/250ml的量于锥形瓶中分装,并单独灭菌),作摇床培养,转速为200rpm,在37℃下培养24h。然后种子液按8%的接菌量接入发酵培养基中,(发酵培养基按50ml/500ml的量分装于500ml的锥形瓶中,并单独灭菌),作摇床培养,转速为200rpm,在37℃下培养24h后测酶活。
1.6菌种鉴定
1.6.1菌体形态特征
将菌种接种于平板LB培养基上,培养24h后,用双目生物显微镜在油镜下观察菌体形态。
1.6.2菌落形态特征
将菌种接种于平板LB培养基上,培养24h后,按常规方法观察菌落形态。
1.6.3生理生化鉴定
按照伯杰氏细菌鉴定手册方法进行
1.6.416SrDNA测序鉴定
这部分工作由天津科技大学生物工程学院菌种鉴定中心完成
1.7碱性果胶酶酶活测定方法
取20μl发酵液稀释酶液加入到2ml含0.2%聚半乳糖醛酸的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.0),45℃反应15min,用3ml0.03 mol/L的磷酸溶液终止酶反应,在235nm处测定其吸光值。
一个标准酶活单位(1U)定义为:每分钟使聚半乳糖醛酸裂解产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸的酶量。不饱和聚半乳糖醛酸在235nm处的摩尔吸光系数为4600L/mol·cm[9].
1.8酶液的分离纯化
1.8.1果胶酶粗酶液的制备
分别挑一环521菌接种于2个250ml锥形瓶中,每瓶分装25ml种子培养基(灭菌),作37℃摇床培养,200r/min,培养24h后,以8%的接菌量接入10个500ml锥形瓶中,每瓶分装50ml优化发酵培养基中(灭菌),作37℃摇床培养,200r/min,培养24h后,于4000r/min,4℃下离心10min,取上清液。分别测定其酶活力和蛋白含量。
1.8.2硫酸铵梯度盐析提纯
将以上酶液中酶活力在0.3～0.8μg/ml的锥形瓶中的酶液混合得310ml酶液。取70ml的酶液分装于7个250ml的锥形瓶中,以如下的比例浓度加入硫酸铵沉淀过夜。
分别将7个瓶中的酶液在4000r/min,4℃下离心10min,分别收集上清液测酶活力及蛋白含量;将每个样的离心后的沉淀溶于等体积的PH9.0的甘氨酸-NaOH-CaCl2缓冲溶液中,测定酶活力和蛋白含量,并与相对应的酶液的酶活力作对照。取分离效果显著的浓度作为其余240ml酶液处理的最适浓度,并分别测定上清与沉淀的酶活力与蛋白含量。
1.8.3透析和浓缩
将上清液分装于透析袋中静置于去离子水中,4℃下透析过夜,然后,取出透析袋,在周围洒上分子量为20000的PEG,静置于4℃下浓缩过夜。
1.8.4 Sephadex G-75柱层析
20×1000mm的玻璃柱装好Sephadex G-75萄聚糖凝胶,先用0.02mol/L PH 8.0NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液平衡,上样,以0.02mol/L pH 8.0 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液洗脱,流速30ml/h,收集各组分,用于酶活和蛋白含量测定
2.结果和讨论
2.1菌体形态特征
521枯草芽孢杆菌的形态特征:单个细胞0.7～0.8×2～3微米,着色均匀。无荚膜,无鞭毛。最适生长温度为37℃,在保藏培养基上37℃培养10h后菌体呈杆状。产芽孢,芽孢0.6～0.9×1.0～1.5(μm),椭圆到柱状,位于菌体中央或稍偏,芽孢形成后菌体膨大。
2.2菌落形态特征
菌株521的菌落呈不规则形,由无色变淡粉红再时间长变为黑色,腊状,光滑,不透明,边缘较整齐。
2.3 16SrDNA测序鉴定
经16SrDNA测序鉴定521菌株为枯草芽孢杆菌
2.4碱性果胶酶的一般酶学性质研究
2.4.1生长曲线和产酶曲线
521菌株的纯无机盐发酵培养基发酵生长情况及产酶情况如下图3-2所示。可以看出,521菌在5h～18h为对数生长期,菌量生长快速。同时在11h～17h时开始大量产酶,并在13h和17h出现两个明显的酶活峰,以13h出现的酶活峰为最高。表明果胶酶出现在细胞代谢和生长旺盛时期,与细胞生长增殖有关。因而加大菌体含量可大大提高酶活力。
2.4.2碱性果胶酶的动力学曲线
酶反应动力学常数Km和Kcat可表达酶反应性质、反应条件和酶反应速度之间的关系。对于特定的反应、特定的反应条件来说,米氏常数Km(Michaelis constant)是一个特征常数,米氏常数(Michaelis constant)(Km)它的意义如下:它的数值等于酶促反应达到其最大速度Vm一半时的底物浓度[S],单位为mol/L。它可以表示酶和底物之间的亲和能力,Km值越大,亲和能力越弱,反之亦然。其中Km值最小的那个反应的底物就是酶的最适底物。Km是一种酶的特征常数,只与酶的种类有关而与酶的浓度无关,与底物的浓度也无关,这一点与Vm是不同的,因此,我们可以通过Km值来鉴别酶的种类。但是它会随着反应条件(T、pH)的改变而改变。竞争性抑制剂米氏常数不变,最大反应速度减小;反竞争性抑制剂米氏常数减小,最大反应速度减小。
影响酶促动力学常数的主要有以下五点:底物浓度,酶的量,pH值,温度,抑制剂和激活剂。
底物浓度:主要应由酶的Km值决定。当[S]>>Km,反应成0级反应;当[S]<10Km,速度达到理论最大反应速度的91%;当[S]过小时,一是底物溶液的配制不好掌握,二是反应速度太小;一般酶的Km值多在10-5~10-3mol/L,所以[S]应在0.05~5mmol/L之间。而且随着[S]的增大,反应速度也应逐渐增大。
酶的浓度:酶的浓度越大,反应速度越快。酶的浓度太大,会导致反应速度太快,吸光度无法测量;酶的浓度太小,又会导致反应速度太慢,时间扫描时形成的时间-吸光度曲线趋于平缓,效果不明显。所以,酶浓度应控制在使反应在3~5min内到平衡的范围内,一般在10-12~10-7mol/L之间。
图中的横轴截距为-Km,纵轴截距为Km/Vmax,斜率为1/Vmax,求得
Km=0.4123(g/L)
Vmax=0.252(g/s)
即当果胶酶的酶促反应速度达到最大速度的一半时(0.127g/s)时,底物浓度为0.4123g/L。
2.4.3 pH对果胶酶酶活力的影响
2.4.3.1碱性果胶酶最适作用pH的确定
pH通过改变酶和底物分子解离状态影响反应速率,酶催化活性最高时反应体系pH称为酶促反应的最适pH。如图2-4所示,最适作用pH是8.0。
2.4.3.2碱性果胶酶的pH稳定性
从图2-5可以看出,当酶液在不同pH缓冲液范围内耐受30min后,碱性果胶酶在pH8.0～12均具有酶活性。在pH9.5时酶活达到最高,最高耐受范围在pH12,从图的整体趋势可以看出,果胶酶中聚半乳糖醛酸裂解酶的碱性稳定范围在pH9.5～12。这种特性很适合工业生产中耐碱性的条件。
2.4.4温度对碱性果胶酶酶活力的影响
2.4.4.1碱性果胶栈酶的最适作用温度
温度对果胶酶的酶促反应速率具有双重影响。当温度下降时,酶活力也呈下降趋势,当温度升高时酶活力又呈上升趋势,但当温度太高时,则由于酶蛋白的热变性而会使酶活降低,所以,酶促反应的最适温度就是这两种作用综合的结果,即使酶促反应速率表现最快时反应体系的温度。如图2-6所示,果胶酶的最适作用温度为45℃。
2.4.4.2果胶酶酶促反应的温度稳定性
如图2-7所示,酶促反应在45℃作用30min时,具有最大酶活,随着温度的升高酶活呈下降的趋势,在65℃还具有酶活性;
2.4.5金属对碱性果胶酶酶活力的影响
将等体积的酶液与浓度为1mmol/L的Co2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+、Fe2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、K+、Ba2+溶液混合,充分作用30min,然后测定酶活。以空白水为对照,结果如表2-8所示,Ca2+和Cu2+具有明显的激活作用,Mg2+对酶促反应没有影响作用,而Co2+、Mn2+、Fe3+、Fe2+、Zn2+、K+、Ba2+对酶具有抑制作用。
2.4.6碳源种类对产酶的影响
碳源一菌体合成自身骨架的主要物质来源,是影响菌体生长和代谢产物合成的关键因素。本实验以原始发酵培养基中乳糖、果胶、酵母膏为碳源作为对照,分别取总碳摩尔数相同(以10g/L的葡萄糖为基准)的豆饼粉+玉米粉、乳糖、葡萄糖、糊精、淀粉、蔗糖、果胶、淀粉+果胶作为替换的碳源,对照相对比活率。结果如图2-9,521菌对于豆饼粉+玉米粉的利用率比较高,酶活相对提高50%,同时对淀粉+果胶的利用率也比较高,酶活相对提高了44%。考虑到,在实际工业生产中,淀粉+果胶的水溶解度均比豆饼粉+玉米粉要好,而且成本低,因而成为优化培养基的首选。
2.4.7氮源种类对产酶的影响
氮源是菌体合成自身蛋白和遗传物质的主要来源,也是代谢产物中氮元素的来源之一。本实验以原始发酵培养基中以蛋白胨为氮源作为对照,分别称取总氮摩尔数相同(以10g/L为基准)的酵母浸粉、尿素、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钠作为替换的氮源,对照相对比活率。结果如图2-10,521菌对于硫酸铵的利用最好,相对酶活提高了8%。说明521菌对于无机NH4+具有高利用率,可以考虑在大规模发酵生产中使用富含铵根离子的物质。
通过不同离子、碳源、氮源对产酶的影响结果,确定521菌的优化培养基为(g/L):果胶20、淀粉20、NH4NO3 15、MgCl2 0.2、MgSO4 2、CaCl2 3、K2HPO4 4、pH=8.0。在这个优化培养基条件下,经过发酵,以8%的接种量,250ml三角瓶装25ml培养基,在37℃,200r/min回转式摇床上培养24h后测酶活达到28μ/ml,比目前国内报道的最高酶活34U/ml略低,但比原始酶活提高了30%。
2.5酶的分离纯化
2.5.1果胶酶粗酶液的制备、盐析
用优化培养基作为521菌的发酵培养基,经发酵后获得的粗酶液首先用硫酸铵盐析。由于中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此谓盐溶;当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO42-和NH4+)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。在一般文献报道中,大多分离纯化蛋白酶均使用50%～70%的硫酸铵,本实验采用30%的硫酸铵盐析,结果收集的上清液中,提纯总收率达到了141。
2.5.2 Sephadex G-75柱层析
粗酶液在经过盐析、透析和浓缩后,经过SephadexG-75柱层析,进一步除盐,并根据组分中蛋白分子量大小的不同,依次洗脱,从而分离蛋白组分。以时间为横坐标,以收集的每管液体的酶活为纵坐标,绘出其洗脱曲线如图2-11。
可以看出,在洗脱曲线中,在20min和100min处明显有两个酶活峰,均具有聚半乳糖醛酸裂解酶。
最后酶液的分离提纯结果如下表2-1所示。
3.结论
本研究从公园的不同花土中分离得到一株相对高产碱性果胶酶的产生菌并进行了鉴定,鉴定为枯草芽孢杆菌,编号为TCCCC11286。
菌株TCCCC11286所产碱性果胶酶的温度稳定性在45℃～60℃,最适作用温度为45℃,PH稳定性为9.5～12,最适作用PH为8.0,这些耐高温和耐碱性的特点很适合在实际纺织工业中碱性环境下处理织物的特点,因而具有很好的开发前景。
通过产酶条件的初步优化,该菌株的产酶能力相对提高30%。从氮源和碳源的考察中可知,菌株TCCCC11286对于铵根离子和淀粉的利用能力较强,可以考虑在大规模发酵生产中使用廉价的富含铵根离子的化学物质和低成本的淀粉。
在菌株TCCCC11286所产碱性果胶酶的分离纯化中,本实验采用了30%的硫酸铵盐析、SephadexG-75柱层析等方法,由于酶液中含杂离子浓度小,得到很好的纯化分离酶的效果。这种处理方式在实际生产中由于所需盐量少,也节约了酶提纯的成本。本实验的方法为进一步开发工业用菌提供了很好的理论和数据依据。
参考文献:
[1]丁凤平,张秀芝.碱性果胶酶PATE及其测定方法.中国生化药物杂志.1993.64(2):42～43
[2]周文龙等.酶在纺织中的应用.北京:中国纺织出版社,2002.
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[4]FrediB,Marianne L,KarlH E. Enzymatec degumming ofram ie bast fibers.J Biothechnol.2000.76:43~50.
[5]Jing Z,GunnarH,Gunnar J.Polygalacturonase is the key component in enzymatic retting of flax.J Biothechnol.2000.81:85~89.
[6]刘昌龄,王秀玲.碱性果胶酶:成本有效、对环境有利的前处理的关键.印染译丛.2000(4):41～44
[7]Junwei C,Weihua S, Yong P.High-producers of polygalacturo-nase selected from mutants resistant to rifampin in alkalophilic.Bacillus sp.NTT33.Enzyme & MicrobialTechnol.2000.27: 545~548.
[8]张健红,李寅,刘和.一株碱性果胶酶高产细菌的分离、系统发育分析和产酶条件的初步优化[J].应用与环境生物学报,2005.11(3):354～358.
[9]TatsujiS,RoqueAH,Takuo S. Purification,characterization, and pro-duction of two pectic transeliminases with protopectinase activity from Bacillus subtilis.BiosciBiotech. Biochem.1994.58:353~358
作者单位:河北省廊坊市大厂高级实验中学
关键词:枯草芽孢杆菌 优化 分离纯化
Abstract:A bacterial strainrelativilyhighly producingalkalinepectate lyasewasobtained from the soil of variaseflowersin the Park.The bacteriumwas primarily identifiedasastrainthat belongs to Bacillus sp.based on 16s r DNAand it was named as TCCCC11286.Study on the characteristics of alkalinepectinaseshowedthatit was high temperature resistant and alkali proof.The highestactivityoftheenzymewas at pH8.0 and 45℃,even moreit was more activity at 60℃.Under the optional fermentation conditions,strain TCCCC11286 could make good useofcornstarch and chemical substances full ofNH4+.Furthermore,we preliminarily seperated and purified the pectinase.
Keyword:Bacillus sp. optimization separation and purification.
果胶酶(pectinases)是一类能分解植物组织中果胶质(由D-半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键连接形成的直链状的聚合物)的酶系,按底物专一性、对糖苷键作用机理、切断方式等,大致可分9种组分。碱性果胶酶是指在碱性范围内具有较高活性的果胶酶,一般多指聚半乳糖醛酸裂解酶(polygalacturonate lyase,PGL) [1]。果胶酶广泛应用于食品工业的果汁加工,果酒澄清,饮用酶制剂,生物农药,而碱性果胶酶除在植物病毒的纯化、纸浆漂白等方面得到应用外,已成为绵织物处理过程中至关重要的生物制剂。用果胶酶可以用于不能进行碱精练的织物(如绵和羊毛混纺织物)处理 [2],而且处理后的织物损伤小,织物柔软丰满,对环境的污染少,操作人员的工作环境和设备的腐蚀情况均比碱精练好[3-6]。
自1972年日本学者Koki Horikoshi首次用嗜碱细菌制得碱性果胶酶以来 [7],至今已分离鉴定出几十种碱性果胶酶,但其中能应用于工业化生产的不多,仅Novo Nordisk公司在1999年研制出用基因工程菌生产的碱性果胶酶Bio-Prep,以及于2003年推出的一种碱性果胶裂解酶ScourzymeL,但高昂的生产成本限制了其广泛应用 [8]。因此,如何提高、提纯PGL的产量并降低生产成本是其开发应用的关键。本实验针对从土壤中分离得的一株相对酶活较高的菌株,进行优化、提纯方面的研究,为进一步应用于工业生产提供依据。
1.材料和方法
1.1菌种
枯草芽孢杆菌TCCC11286,这是本实验中心菌种库的编号,筛选编号为521
1.2试剂
Polygalacturonic acid Beijing Biodee Biotechnology
十六烷基三甲基溴化铵 北京奥博星生物技术有限任公司
果胶 天门峡富达果胶工业有限公司
聚乙二醇 天津天泰精细化学品有限公司T.T.R.C
甘氨酸 天津市珠江卫生材料厂
无水葡萄糖 国药集团化学试剂有限公司
可溶性淀粉 天津市四通化工厂
酵母粉 OXOID LTD,BASINGSTOKE,HAMPSIRE,ENGLAND
TPYPTONE OXOID LTD.,BASINGSTOKE,HAMPSIRE,ENGLAND
Agar Japan
磷酸 天津市北方天医化学试剂厂
NaOH 天津市北方天医化学试剂厂
(NH4)2SO4 天津市风船化学试剂科技有限公司
1.3培养基
(1)LB培养基(g/L):蛋白胨20、酵母粉10、NaCl 20于121℃下灭菌20min
(2)种子培养基(g/L):蔗糖20、蛋白胨10、玉米浆30、MgSO4 1、 K2HPO4 18.4、KH2PO4 6、pH=7于121℃下灭菌20min
(3)发酵液(g/L):乳糖20、蛋白胨3、CaCl2 3、果胶20、酵母膏3、MgCl2 0.2、pH=7.0~7.5于121℃下灭菌20min
(4)筛选培养基(g/L):果胶5、酵母膏5、蛋白胨5、MgSO4 2、K2HPO4 1、琼脂20、pH=7.0~7.5于121℃下灭菌20min
(5)斜面培养基(g/L):葡萄糖10、蛋白胨5、牛肉膏5、NaCl 5、琼脂条20、pH=7.0于121℃下灭菌20min
(6)优化发酵培养基(g/L):果胶20、淀粉20、NH4NO3 15、MgCl2 0.2、MgSO4 2、CaCl2 3、K2HPO4 4、pH=8.0于121℃下灭菌0min
(7)测生长曲线用无机盐种子培养基(g/L):蔗糖20、(NH4)2 SO4 40、MgSO4·7H2O 0.2、K2HPO4 4、KH2PO4 0.3、pH=6.5～7.0于121℃下灭菌20min
(8)测生长曲线用无机盐发酵培养基(g/L):蔗糖40、(NH4)2SO4 40、MgSO4·7H2O 0.4、K2HPO4-KH2PO4 0.05mol/L、FeSO4 0.2 pH=6.5～7.0于121℃下灭菌20min
1.4筛选方法
1.4.1富集培养
将从公园中采集到的月季、马兰、竹、美人蕉、菊、迎春、松的培养土分别称取5g土样溶于45ml去离子水中,吸取5ml菌悬液加入到45ml(用250ml锥形瓶配制,121℃灭菌20min)的富集培养基中,作摇床培养,培养温度为37℃,转速为100rpm,培养24h。
1.4.2初筛
将富集培养的样品稀释分离后涂布在筛选培养基中,放入37℃倒置培养24h观察,并在平板倒入少量(1%)十六烷基三甲溴化铵,静置10min观察并测量菌落周围出现透明圈的直径(d/cm)和菌落直径(d/cm),有透明圈者则为有果胶酶活性的菌株。将产果胶酶的菌种接种于斜面培养基贮藏于4℃下。
1.4.3复筛
将初筛得到的51株菌接种到斜面,37℃,培养24h后,接种到摇瓶进行一级发酵,200r/min,24h后对发酵液进行酶活测定。
1.5培养方法
再挑取单菌落接入种子培养液中。(种子培养液按25ml/250ml的量于锥形瓶中分装,并单独灭菌),作摇床培养,转速为200rpm,在37℃下培养24h。然后种子液按8%的接菌量接入发酵培养基中,(发酵培养基按50ml/500ml的量分装于500ml的锥形瓶中,并单独灭菌),作摇床培养,转速为200rpm,在37℃下培养24h后测酶活。
1.6菌种鉴定
1.6.1菌体形态特征
将菌种接种于平板LB培养基上,培养24h后,用双目生物显微镜在油镜下观察菌体形态。
1.6.2菌落形态特征
将菌种接种于平板LB培养基上,培养24h后,按常规方法观察菌落形态。
1.6.3生理生化鉴定
按照伯杰氏细菌鉴定手册方法进行
1.6.416SrDNA测序鉴定
这部分工作由天津科技大学生物工程学院菌种鉴定中心完成
1.7碱性果胶酶酶活测定方法
取20μl发酵液稀释酶液加入到2ml含0.2%聚半乳糖醛酸的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.0),45℃反应15min,用3ml0.03 mol/L的磷酸溶液终止酶反应,在235nm处测定其吸光值。
一个标准酶活单位(1U)定义为:每分钟使聚半乳糖醛酸裂解产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸的酶量。不饱和聚半乳糖醛酸在235nm处的摩尔吸光系数为4600L/mol·cm[9].
1.8酶液的分离纯化
1.8.1果胶酶粗酶液的制备
分别挑一环521菌接种于2个250ml锥形瓶中,每瓶分装25ml种子培养基(灭菌),作37℃摇床培养,200r/min,培养24h后,以8%的接菌量接入10个500ml锥形瓶中,每瓶分装50ml优化发酵培养基中(灭菌),作37℃摇床培养,200r/min,培养24h后,于4000r/min,4℃下离心10min,取上清液。分别测定其酶活力和蛋白含量。
1.8.2硫酸铵梯度盐析提纯
将以上酶液中酶活力在0.3～0.8μg/ml的锥形瓶中的酶液混合得310ml酶液。取70ml的酶液分装于7个250ml的锥形瓶中,以如下的比例浓度加入硫酸铵沉淀过夜。
分别将7个瓶中的酶液在4000r/min,4℃下离心10min,分别收集上清液测酶活力及蛋白含量;将每个样的离心后的沉淀溶于等体积的PH9.0的甘氨酸-NaOH-CaCl2缓冲溶液中,测定酶活力和蛋白含量,并与相对应的酶液的酶活力作对照。取分离效果显著的浓度作为其余240ml酶液处理的最适浓度,并分别测定上清与沉淀的酶活力与蛋白含量。
1.8.3透析和浓缩
将上清液分装于透析袋中静置于去离子水中,4℃下透析过夜,然后,取出透析袋,在周围洒上分子量为20000的PEG,静置于4℃下浓缩过夜。
1.8.4 Sephadex G-75柱层析
20×1000mm的玻璃柱装好Sephadex G-75萄聚糖凝胶,先用0.02mol/L PH 8.0NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液平衡,上样,以0.02mol/L pH 8.0 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液洗脱,流速30ml/h,收集各组分,用于酶活和蛋白含量测定
2.结果和讨论
2.1菌体形态特征
521枯草芽孢杆菌的形态特征:单个细胞0.7～0.8×2～3微米,着色均匀。无荚膜,无鞭毛。最适生长温度为37℃,在保藏培养基上37℃培养10h后菌体呈杆状。产芽孢,芽孢0.6～0.9×1.0～1.5(μm),椭圆到柱状,位于菌体中央或稍偏,芽孢形成后菌体膨大。
2.2菌落形态特征
菌株521的菌落呈不规则形,由无色变淡粉红再时间长变为黑色,腊状,光滑,不透明,边缘较整齐。
2.3 16SrDNA测序鉴定
经16SrDNA测序鉴定521菌株为枯草芽孢杆菌
2.4碱性果胶酶的一般酶学性质研究
2.4.1生长曲线和产酶曲线
521菌株的纯无机盐发酵培养基发酵生长情况及产酶情况如下图3-2所示。可以看出,521菌在5h～18h为对数生长期,菌量生长快速。同时在11h～17h时开始大量产酶,并在13h和17h出现两个明显的酶活峰,以13h出现的酶活峰为最高。表明果胶酶出现在细胞代谢和生长旺盛时期,与细胞生长增殖有关。因而加大菌体含量可大大提高酶活力。
2.4.2碱性果胶酶的动力学曲线
酶反应动力学常数Km和Kcat可表达酶反应性质、反应条件和酶反应速度之间的关系。对于特定的反应、特定的反应条件来说,米氏常数Km(Michaelis constant)是一个特征常数,米氏常数(Michaelis constant)(Km)它的意义如下:它的数值等于酶促反应达到其最大速度Vm一半时的底物浓度[S],单位为mol/L。它可以表示酶和底物之间的亲和能力,Km值越大,亲和能力越弱,反之亦然。其中Km值最小的那个反应的底物就是酶的最适底物。Km是一种酶的特征常数,只与酶的种类有关而与酶的浓度无关,与底物的浓度也无关,这一点与Vm是不同的,因此,我们可以通过Km值来鉴别酶的种类。但是它会随着反应条件(T、pH)的改变而改变。竞争性抑制剂米氏常数不变,最大反应速度减小;反竞争性抑制剂米氏常数减小,最大反应速度减小。
影响酶促动力学常数的主要有以下五点:底物浓度,酶的量,pH值,温度,抑制剂和激活剂。
底物浓度:主要应由酶的Km值决定。当[S]>>Km,反应成0级反应;当[S]<
酶的浓度:酶的浓度越大,反应速度越快。酶的浓度太大,会导致反应速度太快,吸光度无法测量;酶的浓度太小,又会导致反应速度太慢,时间扫描时形成的时间-吸光度曲线趋于平缓,效果不明显。所以,酶浓度应控制在使反应在3~5min内到平衡的范围内,一般在10-12~10-7mol/L之间。
图中的横轴截距为-Km,纵轴截距为Km/Vmax,斜率为1/Vmax,求得
Km=0.4123(g/L)
Vmax=0.252(g/s)
即当果胶酶的酶促反应速度达到最大速度的一半时(0.127g/s)时,底物浓度为0.4123g/L。
2.4.3 pH对果胶酶酶活力的影响
2.4.3.1碱性果胶酶最适作用pH的确定
pH通过改变酶和底物分子解离状态影响反应速率,酶催化活性最高时反应体系pH称为酶促反应的最适pH。如图2-4所示,最适作用pH是8.0。
2.4.3.2碱性果胶酶的pH稳定性
从图2-5可以看出,当酶液在不同pH缓冲液范围内耐受30min后,碱性果胶酶在pH8.0～12均具有酶活性。在pH9.5时酶活达到最高,最高耐受范围在pH12,从图的整体趋势可以看出,果胶酶中聚半乳糖醛酸裂解酶的碱性稳定范围在pH9.5～12。这种特性很适合工业生产中耐碱性的条件。
2.4.4温度对碱性果胶酶酶活力的影响
2.4.4.1碱性果胶栈酶的最适作用温度
温度对果胶酶的酶促反应速率具有双重影响。当温度下降时,酶活力也呈下降趋势,当温度升高时酶活力又呈上升趋势,但当温度太高时,则由于酶蛋白的热变性而会使酶活降低,所以,酶促反应的最适温度就是这两种作用综合的结果,即使酶促反应速率表现最快时反应体系的温度。如图2-6所示,果胶酶的最适作用温度为45℃。
2.4.4.2果胶酶酶促反应的温度稳定性
如图2-7所示,酶促反应在45℃作用30min时,具有最大酶活,随着温度的升高酶活呈下降的趋势,在65℃还具有酶活性;
2.4.5金属对碱性果胶酶酶活力的影响
将等体积的酶液与浓度为1mmol/L的Co2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+、Fe2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、K+、Ba2+溶液混合,充分作用30min,然后测定酶活。以空白水为对照,结果如表2-8所示,Ca2+和Cu2+具有明显的激活作用,Mg2+对酶促反应没有影响作用,而Co2+、Mn2+、Fe3+、Fe2+、Zn2+、K+、Ba2+对酶具有抑制作用。
2.4.6碳源种类对产酶的影响
碳源一菌体合成自身骨架的主要物质来源,是影响菌体生长和代谢产物合成的关键因素。本实验以原始发酵培养基中乳糖、果胶、酵母膏为碳源作为对照,分别取总碳摩尔数相同(以10g/L的葡萄糖为基准)的豆饼粉+玉米粉、乳糖、葡萄糖、糊精、淀粉、蔗糖、果胶、淀粉+果胶作为替换的碳源,对照相对比活率。结果如图2-9,521菌对于豆饼粉+玉米粉的利用率比较高,酶活相对提高50%,同时对淀粉+果胶的利用率也比较高,酶活相对提高了44%。考虑到,在实际工业生产中,淀粉+果胶的水溶解度均比豆饼粉+玉米粉要好,而且成本低,因而成为优化培养基的首选。
2.4.7氮源种类对产酶的影响
氮源是菌体合成自身蛋白和遗传物质的主要来源,也是代谢产物中氮元素的来源之一。本实验以原始发酵培养基中以蛋白胨为氮源作为对照,分别称取总氮摩尔数相同(以10g/L为基准)的酵母浸粉、尿素、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钠作为替换的氮源,对照相对比活率。结果如图2-10,521菌对于硫酸铵的利用最好,相对酶活提高了8%。说明521菌对于无机NH4+具有高利用率,可以考虑在大规模发酵生产中使用富含铵根离子的物质。
通过不同离子、碳源、氮源对产酶的影响结果,确定521菌的优化培养基为(g/L):果胶20、淀粉20、NH4NO3 15、MgCl2 0.2、MgSO4 2、CaCl2 3、K2HPO4 4、pH=8.0。在这个优化培养基条件下,经过发酵,以8%的接种量,250ml三角瓶装25ml培养基,在37℃,200r/min回转式摇床上培养24h后测酶活达到28μ/ml,比目前国内报道的最高酶活34U/ml略低,但比原始酶活提高了30%。
2.5酶的分离纯化
2.5.1果胶酶粗酶液的制备、盐析
用优化培养基作为521菌的发酵培养基,经发酵后获得的粗酶液首先用硫酸铵盐析。由于中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此谓盐溶;当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO42-和NH4+)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。在一般文献报道中,大多分离纯化蛋白酶均使用50%～70%的硫酸铵,本实验采用30%的硫酸铵盐析,结果收集的上清液中,提纯总收率达到了141。
2.5.2 Sephadex G-75柱层析
粗酶液在经过盐析、透析和浓缩后,经过SephadexG-75柱层析,进一步除盐,并根据组分中蛋白分子量大小的不同,依次洗脱,从而分离蛋白组分。以时间为横坐标,以收集的每管液体的酶活为纵坐标,绘出其洗脱曲线如图2-11。
可以看出,在洗脱曲线中,在20min和100min处明显有两个酶活峰,均具有聚半乳糖醛酸裂解酶。
最后酶液的分离提纯结果如下表2-1所示。
3.结论
本研究从公园的不同花土中分离得到一株相对高产碱性果胶酶的产生菌并进行了鉴定,鉴定为枯草芽孢杆菌,编号为TCCCC11286。
菌株TCCCC11286所产碱性果胶酶的温度稳定性在45℃～60℃,最适作用温度为45℃,PH稳定性为9.5～12,最适作用PH为8.0,这些耐高温和耐碱性的特点很适合在实际纺织工业中碱性环境下处理织物的特点,因而具有很好的开发前景。
通过产酶条件的初步优化,该菌株的产酶能力相对提高30%。从氮源和碳源的考察中可知,菌株TCCCC11286对于铵根离子和淀粉的利用能力较强,可以考虑在大规模发酵生产中使用廉价的富含铵根离子的化学物质和低成本的淀粉。
在菌株TCCCC11286所产碱性果胶酶的分离纯化中,本实验采用了30%的硫酸铵盐析、SephadexG-75柱层析等方法,由于酶液中含杂离子浓度小,得到很好的纯化分离酶的效果。这种处理方式在实际生产中由于所需盐量少,也节约了酶提纯的成本。本实验的方法为进一步开发工业用菌提供了很好的理论和数据依据。
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作者单位:河北省廊坊市大厂高级实验中学