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摘 要 为了同时检测橡胶树转基因胚状体和叶片中含有的多个目标基因序列，并排除扩增结果的假阴性，利用正交试验首次建立了橡胶树管家基因（HbActin）、目标基因新霉素磷酸转移酶II（NptII）基因和β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因的多重PCR检测体系。利用2种酶（PCR Mix酶和Taq酶）对18个转基因胚状体和叶片进行单一引物PCR扩增和多重PCR检测。结果表明：多重PCR检测结果与单一PCR结果完全一致，且多重PCR体系带型清晰，无非特异性扩增，更易读取。多重PCR检测系统具有简单、准确并且高效等特点，只需要进行一个反应就可以检测多个目标基因序列，因而在转基因分子鉴定上具有非常重要的应用价值与潜力。
关键词 多重PCR；橡胶树；转基因胚状体；转基因叶片；分子鉴定
中图分类号 Q781 文献标识码 A
聚合酶链式反应（PCR）是转基因分子检测中最普遍的方法之一，其检测多为单一靶位点的扩增，对多目标基因而言，需要进行多次的PCR反应，不仅耗时耗力，成本也较高。多重PCR技术最初由Chamberlain等[1]提出，是指在一个反应体系中进行多个靶位点扩增的PCR技术。因其具操作简单、特异性强、灵敏度高、实验成本低、可加速实验进程等优点，该技术被广泛应用于人类及家禽疾病的诊断[1-4]、植物纯度及品种鉴定[5-8]、转基因成分与定量检测[9-19]等。不过，多重PCR要求多个不同的引物能在同一反应体系中进行特异性扩增，因此需要对影响其扩增效果的因素进行优化，主要优化因素有循环参数、反应体积、反应体系、引物间的碱基配对等[20]。
本研究以转基因橡胶树胚状体和叶片为材料，对多重PCR反应体系中的退火温度、引物浓度比例及PCR反应体系的组分进行正交实验优化，首次建立了橡胶树管家基因引物HbActin-P1/P2与载体特异基因引物Npt-f/r和Gus-f/r的PCR Mix酶以及Taq酶的多重PCR检测体系，并与单一引物扩增的结果对比，验证了优化后的多重PCR反应体系的准确性及灵敏性，为后续外源基因的快速检测工作提供了便利。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 转基因材料与质粒材料 携带有外源NptII基因和GUS报告基因的橡胶树转基因胚状体及转基因稳定期叶片由本实验室提供。表达载体pCAMBIA2301质粒由本实验室留存。
1.1.2 试剂 Taq酶，dNTPs，RNaseA等购自Fermentas公司，PCR Mix酶[2×Eco Taq PCR SuperMix（+dye）]购自北京全式金生物技术有限公司，DL 2 000 Marker购自大连Takara公司，NptII、GUS基因以及橡胶树管家基因HbActin的引物由深圳华大基因合成。
1.2 方法
1.2.1 单一引物PCR扩增 来源于NptII和GUS基因的引物Npt-f/r和Gus-f/r序列及扩增产物大小见李季等[21]报道，橡胶树管家基因HbActin的引物HbActin-P1/P2序列HbActin-P1：CACCACTCAGCA
CAATGTTACC；HbActin-P2：GATTCCGTTGCCCAG
AAGTC，片段大小为154 bp。PCR扩增采用15 μL 反应体系，PCR Mix酶扩增体系为2×PCR Mix 7.5 μL，上下引物各0.3μL。Taq酶扩增体系：10×Taq Buffer 1.5 μL，25 mmol/L Mg2+ 1.2 μL，10 mmol/L dNTPs 0.2 μL，5 U/μL Taq酶0.15 μL，10 μmol/L正反向引物各0.3 μL，2 μL上述DNA溶液，用灭菌水补足至15 μL。模板参照李季等[21-22]报道的方法，提取18个转基因胚状体和转基因植株叶片DNA。HbActin-P1/P2引物最佳复性温度为60 ℃，复性40 s，72 ℃延伸时间为30 s，其余2对引物的最佳复性温度、延伸时间及PCR反应过程中的所用对照组与李季等[22]报道相同。HbActin-P1/P2引物的PCR扩增产物采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，其余引物用1%的琼脂糖凝胶检测。
1.2.2 多重PCR最佳退火温度的确定 PCR Mix酶和Taq酶的多重PCR检测体系同单一引物PCR扩增反应体系，3对正反向引物各加0.3 μL，模板为转基因阳性植株Tj200863-2的叶片DNA[22]。根据引物的Tm值，选择中间温度为58 ℃，上下波动3 ℃，PCR反应在eppendorf Mastercycler gradient PCR仪器中进行，PCR仪自动生成12个梯度退火温度，分别是55.0、55.1、55.4、56.0、56.7、57.4、58.3、59.1、59.9、60.5、61.0、61.3 ℃。
1.2.3 多重PCR最佳引物浓度的确定 根据1.2.2确定的最佳退火温度，2种酶15 μL的反应体系中，其余成分浓度保持不变，采用L4（23）正交设计试验，确定PCR反应体系中3对引物浓度比例。
1.2.4 多重PCR最佳组分浓度的确定 根据1.2.2和1.2.3中确定的最佳退火温度以及3对引物最适宜的浓度，对Taq酶PCR体系中各组分（Mg2+，dNTPs和Taq酶）浓度进行优化筛选，同样设计L4（23）正交试验。
1.2.5 多重PCR体系的验证 分别选取18株橡胶树转基因胚状体和转基因叶片DNA为材料，利用上述优化后的条件进行PCR Mix酶和Taq酶的多重PCR检测，检测方法同单一PCR，多重PCR扩增产物采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。
2 结果与分析
2.1 不同退火温度对多重PCR的影响
2.2 不同引物浓度对多重PCR的影响 2.3 不同PCR组分对多重PCR的影响
2.4 单一PCR扩增与多重PCR扩增结果比较
2.4.2 单一PCR与多重PCR（Taq酶）的扩增结果比较 根据上述优化的Taq酶的多重PCR扩增体系，结合单一PCR扩增对随机挑选的18个转基因胚状体和转基因植株叶片DNA进行检测，结果如图5所示。Taq酶的多重PCR扩增结果带型清晰，3对引物所扩增条带亮度一致并与单一PCR的扩增结果相同，且无非特异性扩增条带，结果比单引物PCR扩增更易读取且准确。
3 讨论与结论
多重PCR可以同时检测多个目的基因的片段，操作简单，速度快，费用低，同时也大大降低了产物污染的可能性[23-24]。但成功的多重PCR试验与周密的试验设计是分不开的，因为在一个反应体系中，不同目的片段的扩增是相互竞争的，引物组合、引物浓度、退火温度等都会影响多重PCR的结果[25]，而反应体积、不同延伸温度、循环次数对其扩增效果影响较小[20]。因此在建立多重PCR体系时，针对影响较大的因素进行优化十分必要[23，26]。本研究认为利用PCR或多重PCR方法检测转基因植株外源基因的存在时，要确保已提取到的DNA质量及DNA提取物中不含抑制PCR反应的物质，因此有必要进行内源基因的PCR扩增[13]。但单独进行DNA质量的检测或者PCR扩增费时费力，因此，本研究创建的多重PCR体系中引入了橡胶树管家基因HbActin，以评估模板DNA质量以及PCR扩增反应的效果，同时以宿主内部的特异基因作为对照，有效避免了由于DNA提取质量或试验操作失误所造成的假阴性问题，提高检测效率[27]。转基因外源基因成分检测时，NptII基因和GUS基因是常见的检测项目。在多重PCR体系中，引物设计至关重要，一般要注意引物长度不宜过长；引物之间应减少同源性；引物间最好有相近的退火温度；通过调整引物浓度确保不同目标基因的扩增效率一致等[26]。此前，笔者针对这2个基因均设计了相应引物，单一引物扩增时两者扩增效果较好，扩增片段大小差异较大，分别是453 bp和1 203 bp，而橡胶树管家基因HbActin基因片段大小仅为154 bp，三者通过琼脂糖凝胶电泳很容易区分，为此，本研究将这3对引物同时放在多重PCR体系中，PCR扩增结果显示三者存在竞争，扩增条带清晰，可有效避免检测过程中假阳性的出现，进而提高检测效率。根据郝玉芹等[28]和李政利等[29]的正交试验针对引物退火温度、引物浓度比例及PCR组分等进行优化，由实验结果可以看出，引物浓度比例在2种酶体系中不同，而PCR组分在Taq酶体系中与单一PCR相同。王凤格等[30]在建立玉米高通量多重PCR扩增体系时，选择与稳定有效的单一PCR反应相同的条件，并遵循引物组合的一般原则，直接应用到多重PCR体系中，无需进行繁琐的优化，同样可以得到正常的扩增结果。Ma等[31]和刘正斌等[23]也提出这样的方法能取得令人满意的结果。但本研究中2个酶的多重PCR体系中最佳退火温度均与单一引物PCR体系不同，且Taq酶体系中的引物浓度比例与单一PCR有所差别。因此，从本研究的结果可以得知，即便比较成熟的多重PCR反应体系，也要根据不同的模板、酶以及引物对实验条件加以调整优化，以保证结果的特异性和可靠性，这与吴 影等[15]、胡毅玲等[32]、邵碧英等[11，33]报道的结果一致。而对于其他目的基因的检测，由于在多重PCR体系中各引物的交叉结合使得非特异性扩增产生的可能性十分小，因此，理论上只要不同引物之间互补的碱基不多，片段大小不太接近，退火温度相近，单一PCR检测时稳定性好，引物对的数量可以不限[6， 23， 26]。
在进行大规模的转基因检测过程中，PCR Mix酶的扩增优越性要高于Taq酶，而且操作更为简便，但在扩增过程中存在的非特异性扩增可能会造成假阳性现象的出现，故在前期大规模检测时可以采取PCR Mix酶扩增，挑选出可能的阳性胚状体或者单株，而后利用保真度更高的Taq酶加以验证。因此，本研究针对早期的胚状体和转基因植株叶片均进行了2种酶的多重PCR体系的优化，并取得较好的效果，同单一引物PCR扩增结果比较，其检测效率明显提高，结果也更可靠。
综上所述，本研究通过比较多重PCR扩增与单一引物PCR扩增可知，两者结果完全一致，且多重PCR结果更为清晰，无非特异性扩增，结果更准确。因此将多重PCR方法应用于转基因橡胶树外源基因的检测是完全可行的。
参考文献
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责任编辑：林海妹
关键词 多重PCR；橡胶树；转基因胚状体；转基因叶片；分子鉴定
中图分类号 Q781 文献标识码 A
聚合酶链式反应（PCR）是转基因分子检测中最普遍的方法之一，其检测多为单一靶位点的扩增，对多目标基因而言，需要进行多次的PCR反应，不仅耗时耗力，成本也较高。多重PCR技术最初由Chamberlain等[1]提出，是指在一个反应体系中进行多个靶位点扩增的PCR技术。因其具操作简单、特异性强、灵敏度高、实验成本低、可加速实验进程等优点，该技术被广泛应用于人类及家禽疾病的诊断[1-4]、植物纯度及品种鉴定[5-8]、转基因成分与定量检测[9-19]等。不过，多重PCR要求多个不同的引物能在同一反应体系中进行特异性扩增，因此需要对影响其扩增效果的因素进行优化，主要优化因素有循环参数、反应体积、反应体系、引物间的碱基配对等[20]。
本研究以转基因橡胶树胚状体和叶片为材料，对多重PCR反应体系中的退火温度、引物浓度比例及PCR反应体系的组分进行正交实验优化，首次建立了橡胶树管家基因引物HbActin-P1/P2与载体特异基因引物Npt-f/r和Gus-f/r的PCR Mix酶以及Taq酶的多重PCR检测体系，并与单一引物扩增的结果对比，验证了优化后的多重PCR反应体系的准确性及灵敏性，为后续外源基因的快速检测工作提供了便利。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 转基因材料与质粒材料 携带有外源NptII基因和GUS报告基因的橡胶树转基因胚状体及转基因稳定期叶片由本实验室提供。表达载体pCAMBIA2301质粒由本实验室留存。
1.1.2 试剂 Taq酶，dNTPs，RNaseA等购自Fermentas公司，PCR Mix酶[2×Eco Taq PCR SuperMix（+dye）]购自北京全式金生物技术有限公司，DL 2 000 Marker购自大连Takara公司，NptII、GUS基因以及橡胶树管家基因HbActin的引物由深圳华大基因合成。
1.2 方法
1.2.1 单一引物PCR扩增 来源于NptII和GUS基因的引物Npt-f/r和Gus-f/r序列及扩增产物大小见李季等[21]报道，橡胶树管家基因HbActin的引物HbActin-P1/P2序列HbActin-P1：CACCACTCAGCA
CAATGTTACC；HbActin-P2：GATTCCGTTGCCCAG
AAGTC，片段大小为154 bp。PCR扩增采用15 μL 反应体系，PCR Mix酶扩增体系为2×PCR Mix 7.5 μL，上下引物各0.3μL。Taq酶扩增体系：10×Taq Buffer 1.5 μL，25 mmol/L Mg2+ 1.2 μL，10 mmol/L dNTPs 0.2 μL，5 U/μL Taq酶0.15 μL，10 μmol/L正反向引物各0.3 μL，2 μL上述DNA溶液，用灭菌水补足至15 μL。模板参照李季等[21-22]报道的方法，提取18个转基因胚状体和转基因植株叶片DNA。HbActin-P1/P2引物最佳复性温度为60 ℃，复性40 s，72 ℃延伸时间为30 s，其余2对引物的最佳复性温度、延伸时间及PCR反应过程中的所用对照组与李季等[22]报道相同。HbActin-P1/P2引物的PCR扩增产物采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，其余引物用1%的琼脂糖凝胶检测。
1.2.2 多重PCR最佳退火温度的确定 PCR Mix酶和Taq酶的多重PCR检测体系同单一引物PCR扩增反应体系，3对正反向引物各加0.3 μL，模板为转基因阳性植株Tj200863-2的叶片DNA[22]。根据引物的Tm值，选择中间温度为58 ℃，上下波动3 ℃，PCR反应在eppendorf Mastercycler gradient PCR仪器中进行，PCR仪自动生成12个梯度退火温度，分别是55.0、55.1、55.4、56.0、56.7、57.4、58.3、59.1、59.9、60.5、61.0、61.3 ℃。
1.2.3 多重PCR最佳引物浓度的确定 根据1.2.2确定的最佳退火温度，2种酶15 μL的反应体系中，其余成分浓度保持不变，采用L4（23）正交设计试验，确定PCR反应体系中3对引物浓度比例。
1.2.4 多重PCR最佳组分浓度的确定 根据1.2.2和1.2.3中确定的最佳退火温度以及3对引物最适宜的浓度，对Taq酶PCR体系中各组分（Mg2+，dNTPs和Taq酶）浓度进行优化筛选，同样设计L4（23）正交试验。
1.2.5 多重PCR体系的验证 分别选取18株橡胶树转基因胚状体和转基因叶片DNA为材料，利用上述优化后的条件进行PCR Mix酶和Taq酶的多重PCR检测，检测方法同单一PCR，多重PCR扩增产物采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。
2 结果与分析
2.1 不同退火温度对多重PCR的影响
2.2 不同引物浓度对多重PCR的影响 2.3 不同PCR组分对多重PCR的影响
2.4 单一PCR扩增与多重PCR扩增结果比较
2.4.2 单一PCR与多重PCR（Taq酶）的扩增结果比较 根据上述优化的Taq酶的多重PCR扩增体系，结合单一PCR扩增对随机挑选的18个转基因胚状体和转基因植株叶片DNA进行检测，结果如图5所示。Taq酶的多重PCR扩增结果带型清晰，3对引物所扩增条带亮度一致并与单一PCR的扩增结果相同，且无非特异性扩增条带，结果比单引物PCR扩增更易读取且准确。
3 讨论与结论
多重PCR可以同时检测多个目的基因的片段，操作简单，速度快，费用低，同时也大大降低了产物污染的可能性[23-24]。但成功的多重PCR试验与周密的试验设计是分不开的，因为在一个反应体系中，不同目的片段的扩增是相互竞争的，引物组合、引物浓度、退火温度等都会影响多重PCR的结果[25]，而反应体积、不同延伸温度、循环次数对其扩增效果影响较小[20]。因此在建立多重PCR体系时，针对影响较大的因素进行优化十分必要[23，26]。本研究认为利用PCR或多重PCR方法检测转基因植株外源基因的存在时，要确保已提取到的DNA质量及DNA提取物中不含抑制PCR反应的物质，因此有必要进行内源基因的PCR扩增[13]。但单独进行DNA质量的检测或者PCR扩增费时费力，因此，本研究创建的多重PCR体系中引入了橡胶树管家基因HbActin，以评估模板DNA质量以及PCR扩增反应的效果，同时以宿主内部的特异基因作为对照，有效避免了由于DNA提取质量或试验操作失误所造成的假阴性问题，提高检测效率[27]。转基因外源基因成分检测时，NptII基因和GUS基因是常见的检测项目。在多重PCR体系中，引物设计至关重要，一般要注意引物长度不宜过长；引物之间应减少同源性；引物间最好有相近的退火温度；通过调整引物浓度确保不同目标基因的扩增效率一致等[26]。此前，笔者针对这2个基因均设计了相应引物，单一引物扩增时两者扩增效果较好，扩增片段大小差异较大，分别是453 bp和1 203 bp，而橡胶树管家基因HbActin基因片段大小仅为154 bp，三者通过琼脂糖凝胶电泳很容易区分，为此，本研究将这3对引物同时放在多重PCR体系中，PCR扩增结果显示三者存在竞争，扩增条带清晰，可有效避免检测过程中假阳性的出现，进而提高检测效率。根据郝玉芹等[28]和李政利等[29]的正交试验针对引物退火温度、引物浓度比例及PCR组分等进行优化，由实验结果可以看出，引物浓度比例在2种酶体系中不同，而PCR组分在Taq酶体系中与单一PCR相同。王凤格等[30]在建立玉米高通量多重PCR扩增体系时，选择与稳定有效的单一PCR反应相同的条件，并遵循引物组合的一般原则，直接应用到多重PCR体系中，无需进行繁琐的优化，同样可以得到正常的扩增结果。Ma等[31]和刘正斌等[23]也提出这样的方法能取得令人满意的结果。但本研究中2个酶的多重PCR体系中最佳退火温度均与单一引物PCR体系不同，且Taq酶体系中的引物浓度比例与单一PCR有所差别。因此，从本研究的结果可以得知，即便比较成熟的多重PCR反应体系，也要根据不同的模板、酶以及引物对实验条件加以调整优化，以保证结果的特异性和可靠性，这与吴 影等[15]、胡毅玲等[32]、邵碧英等[11，33]报道的结果一致。而对于其他目的基因的检测，由于在多重PCR体系中各引物的交叉结合使得非特异性扩增产生的可能性十分小，因此，理论上只要不同引物之间互补的碱基不多，片段大小不太接近，退火温度相近，单一PCR检测时稳定性好，引物对的数量可以不限[6， 23， 26]。
在进行大规模的转基因检测过程中，PCR Mix酶的扩增优越性要高于Taq酶，而且操作更为简便，但在扩增过程中存在的非特异性扩增可能会造成假阳性现象的出现，故在前期大规模检测时可以采取PCR Mix酶扩增，挑选出可能的阳性胚状体或者单株，而后利用保真度更高的Taq酶加以验证。因此，本研究针对早期的胚状体和转基因植株叶片均进行了2种酶的多重PCR体系的优化，并取得较好的效果，同单一引物PCR扩增结果比较，其检测效率明显提高，结果也更可靠。
综上所述，本研究通过比较多重PCR扩增与单一引物PCR扩增可知，两者结果完全一致，且多重PCR结果更为清晰，无非特异性扩增，结果更准确。因此将多重PCR方法应用于转基因橡胶树外源基因的检测是完全可行的。
参考文献
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责任编辑：林海妹