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[摘要] 目的 探讨老年性白内障晶状体上皮细胞凋亡及Fas、FasL表达的临床意义。 方法 采用免疫组化法检测25例老年性白内障患者（观察组）和10例成人尸体解剖非白内障眼球（对照组）的晶状体前囊膜组织中Fas、FasL的表达，并应用TUNEL方法检测两组LECs的凋亡情况。 结果 观察组LECs中凋亡细胞百分率为（30.4±3.7）%，对照组LECs中凋亡细胞百分率为（0.27±0.12）%。两组凋亡细胞百分率比较，观察组显著高于对照组，差异有统计学意义（t=11.59，P<0.01）。观察组LECs中Fas、FasL蛋白的阳性表达率为60.0%、68.0%，而对照组LECs中Fas、FasL蛋白的阳性表达率为10.0%、20.0%，两组Fas、FasL蛋白阳性表达率比较，观察组显著高于对照组，差异有统计学意义（t=8.95，7.68，P<0.01）。25例老年性白内障患者的LECs中Fas、FasL蛋白的表达与细胞凋亡数间均呈正相关（r=0.574，0.614，P<0.01）。 结论 老年性白内障形成过程可能与LECs的凋亡及Fas、FasL的调控有关。
[关键词] 细胞凋亡；Fas；FasL；晶状体上皮细胞；老年性白内障
[中图分类号] R776.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）03-
白内障发病机制十分复杂，其发生过程中最早发生的是晶状体上皮的损害，且晶状体上皮细胞凋亡是除先天性白内障以外的所有类型白内障形成的细胞学基础。凋亡导致晶状体上皮细胞密度降低，影响了晶状体纤维生长及生长质量，上皮细胞缺损使其下的晶状体纤维渗透压平衡失去控制，使这部分晶状体纤维的透明性和完整性受损。但晶状体上皮细胞凋亡及其凋亡相关基因在白内障发生发展过程中的具体生物学机制尚不清楚。目前研究认为凋亡的基本分子框架是由细胞表面和细胞内受体及其相应配体的信号转导所构成的复杂体系，其中促凋亡基因Fas与FasL的相互作用被认为参与多种细胞凋亡的发病机制[1-3]。本研究通过研究老年性白内障患者及正常人LECs的凋亡情况及相关调控基因Fas、FasL的表达，进一步探讨细胞凋亡参与老年性白内障发生的作用机制，为开发在控制细胞凋亡水平上对白内障进行预防及药物治疗提供实验依据和新的思路。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2007年9月～2012年2月笔者所在医院眼科收治的老年性白内障患者25例为观察组，其中男13例（13眼），女12例（12眼），年龄50～79岁，平均年龄（62.4±4.6）岁。所有患者均在常规白内障显微手术术中采用连续环形撕囊，获取其中央部的晶状体前囊膜（直径约5 mm）。另收集无白内障发生的成年人尸体解剖眼球的晶状体前囊膜标本10例（标本来自暨南大学附属第一医院）为对照组。两组取材标本均置入10%中性缓冲甲醛溶液中固定24～48 h，常规石蜡包埋，连续切片，厚度约3 μm。
1.2 主要试剂
EnVision试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，Fas、FasL山羊抗人多克隆抗体（工作浓度1︰50）均购自美国PTG公司。TUNEL检测细胞凋亡试剂盒购自Roche公司。
1.3 方法
1.3.1 TUNEL方法检测LECs的凋亡 切片常规脱蜡、水化、3%H2O2灭活处理、蛋白酶K消化，PBS液洗涤3次后加入TUNEL反应液（含TdT和Bio-21-dUTP），置37℃水浴箱1 h；终止后加入SA-AP反应液，置37℃水浴箱30 min；用DAB显色，苏木素衬染，脱水，透明，封片，光镜下观察。用无DNA末端转移酶的标记液代替TUNEL反应液设为阴性对照。结果判定：细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞，而正常细胞核被染为蓝色。每张切片随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞，计算凋亡细胞百分率：凋亡细胞与总细胞的比值即为上皮细胞凋亡率。
1.3.2 免疫组织化学染色 采用免疫组化EnVision法检测两组LECs中Fas、FasL的表达。操作程序按试剂盒说明书进行。PBS代替一抗为阴性对照，试剂盒提供的样本片为阳性对照。染色结果判断：LECs内见黄色或棕色颗粒为染色阳性。每张切片随机选择检查5个视野，计数100个细胞，计数阳性细胞数，计算阳性细胞率。0%～5%为（-）；6%～25%为（+）；26%～50%为（++），>50%为（+++）。（+）～（+++）记为阳性。
1.4 统计学处理
应用SPSS13.0版统计软件进行数据分析，计数资料采用χ2检验，指标之间的关系采用Spearson相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组LECs的凋亡情况比较
2.2 两组LECs中Fas、FasL蛋白的表达比较
2.3 Fas、FasL表达与细胞凋亡数之间的关系
3 讨论
Fas又称为Apo-1或CD95，是属于肿瘤坏死因子受体/神经生长因子受体（TNFR/NG-FR）家族的I型跨膜糖蛋白；FasL是Fas在体内的天然配体，属于TNF家族的Ⅱ型膜蛋白。Fas与FasL以膜分子或可溶性分子形式存在于哺乳类机体细胞株表面，两者在诱导细胞凋亡过程中的具有独特作用：Fas起抑制作用，FasL则起促进作用，二者结合后，可以诱导Fas阳性细胞凋亡，这是诱导细胞凋亡的重要途径之一。目前多数学者均认同Fas/FasL系统所诱导的细胞凋亡机制在机体与肿瘤细胞对抗中具有重要的生物学意义，而对Fas/FasL在白内障发生过程中的作用机制研究仍处于初步阶段。国外Okamura N等[6]比较了年龄相关性白内障和糖尿病性白内障LEC的免疫组化及RT-PCR表明有增殖性视网膜病变的白内障组Fas及其mRNA的表达明显增高。认为细胞凋亡在合并有增殖性视网膜病变的白内障组可能是通过Fas途径介导的。国内尹莉莉等[7-8]研究发现Fas蛋白介导的LECs的凋亡在年龄相关性白内障及糖尿病性白内障的形成中起重要的作用。 本研究应用免疫组织化学法比较了对照组与老年性白内障组LECs中Fas、FasL的表达情况，证实老年性白内障患者LECs中Fas、FasL的阳性表达率均明显高于正常人，且Fas、FasL在LECs中的表达与LECs凋亡百分率呈正相关（r=0.574，614，P<0.01）。提示老年性白内障形成过程可能与Fas、FasL的调控有关。推测这可能是正常人LECs中尽管也存在Fas与FasL的联合表达，但并不能够引发自身凋亡，LECs的凋亡可能需要足够数量的FasL-Fas结合来提供凋亡刺激信号。LECs一旦受到其他损害刺激时，可激活FasL-Fas系统，大量FasL-Fas表达并结合，从而提供凋亡的刺激信号，最后导致LECs发生自身凋亡，伴随出现的水电平衡失调及其他一些病理改变，最终形成白内障。相信随着LECs凋亡及Fas、FasL表达调控机制逐渐被人们所认识，抑制Fas、FasL表达的相关分子生物学药剂的研发，将为白内障的非手术治疗以及药物的开发提供新的思路。
[参考文献]
[1] Yoon JH，Gores GJ.Death receptor-mediated apoptosis and the liver[J].Hepatol，2006，37（6）：400-408.
[2] Jeremians I，Kupatt C，Martin-Villalba A，et al.Involvement of CD95/Apol/Fas in cell death after myocardial ischemia[J].Circulation，2004，174（1）：71-78.
[3] Nogae S，Miyazaki M，Kobayashi N，et al.Induction of apoptosis in ischemia-reperfusion mode1 of mouse kidney：Possible involvement of Fas[J].Soc Nephrol，2006，58（6）：620-625.
[4] Huang XR，Qi MX，Wang ZY，et al.Inhibition effects of compound leech eye drops on apoptosis of lens epithelial cells and expressions of Bcl-2 and Bax genesin rats[J].Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao，2007，5（6）：681-685.
[5] 李桂荣，苏冠方，周鸿雁.老年白内障晶状体上皮细胞凋亡及凋亡基因的表达.中国老年学杂志，2007，27（12）：1186.
[6]Okamura N，Ho Y，Shibata MA，et al.Fas-mediated apoptosis in human lens epithellal cells of cataracts associated with diabetic retinopathy[J].Med Electron Mierosc，2002，35（4）：234.
[7] 尹莉莉，管怀进，胡红莉，等.白内障手术摘出前囊下晶状体上皮细胞中整联蛋白、Fas蛋白的表达[J].眼外伤职业眼病杂志，2008，30（12）：918-920.
[8] 胡红莉，尹莉莉，管怀进.白内障患者晶状体上皮细胞中Fas蛋白的表达[J].国际眼科杂志，2008，8（2）：35-37.
（收稿日期：2012-11-26）
[基金项目] 广东省东莞市医疗卫生一般科技项目（201210515011085）。
[关键词] 细胞凋亡；Fas；FasL；晶状体上皮细胞；老年性白内障
[中图分类号] R776.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）03-
白内障发病机制十分复杂，其发生过程中最早发生的是晶状体上皮的损害，且晶状体上皮细胞凋亡是除先天性白内障以外的所有类型白内障形成的细胞学基础。凋亡导致晶状体上皮细胞密度降低，影响了晶状体纤维生长及生长质量，上皮细胞缺损使其下的晶状体纤维渗透压平衡失去控制，使这部分晶状体纤维的透明性和完整性受损。但晶状体上皮细胞凋亡及其凋亡相关基因在白内障发生发展过程中的具体生物学机制尚不清楚。目前研究认为凋亡的基本分子框架是由细胞表面和细胞内受体及其相应配体的信号转导所构成的复杂体系，其中促凋亡基因Fas与FasL的相互作用被认为参与多种细胞凋亡的发病机制[1-3]。本研究通过研究老年性白内障患者及正常人LECs的凋亡情况及相关调控基因Fas、FasL的表达，进一步探讨细胞凋亡参与老年性白内障发生的作用机制，为开发在控制细胞凋亡水平上对白内障进行预防及药物治疗提供实验依据和新的思路。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2007年9月～2012年2月笔者所在医院眼科收治的老年性白内障患者25例为观察组，其中男13例（13眼），女12例（12眼），年龄50～79岁，平均年龄（62.4±4.6）岁。所有患者均在常规白内障显微手术术中采用连续环形撕囊，获取其中央部的晶状体前囊膜（直径约5 mm）。另收集无白内障发生的成年人尸体解剖眼球的晶状体前囊膜标本10例（标本来自暨南大学附属第一医院）为对照组。两组取材标本均置入10%中性缓冲甲醛溶液中固定24～48 h，常规石蜡包埋，连续切片，厚度约3 μm。
1.2 主要试剂
EnVision试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，Fas、FasL山羊抗人多克隆抗体（工作浓度1︰50）均购自美国PTG公司。TUNEL检测细胞凋亡试剂盒购自Roche公司。
1.3 方法
1.3.1 TUNEL方法检测LECs的凋亡 切片常规脱蜡、水化、3%H2O2灭活处理、蛋白酶K消化，PBS液洗涤3次后加入TUNEL反应液（含TdT和Bio-21-dUTP），置37℃水浴箱1 h；终止后加入SA-AP反应液，置37℃水浴箱30 min；用DAB显色，苏木素衬染，脱水，透明，封片，光镜下观察。用无DNA末端转移酶的标记液代替TUNEL反应液设为阴性对照。结果判定：细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞，而正常细胞核被染为蓝色。每张切片随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞，计算凋亡细胞百分率：凋亡细胞与总细胞的比值即为上皮细胞凋亡率。
1.3.2 免疫组织化学染色 采用免疫组化EnVision法检测两组LECs中Fas、FasL的表达。操作程序按试剂盒说明书进行。PBS代替一抗为阴性对照，试剂盒提供的样本片为阳性对照。染色结果判断：LECs内见黄色或棕色颗粒为染色阳性。每张切片随机选择检查5个视野，计数100个细胞，计数阳性细胞数，计算阳性细胞率。0%～5%为（-）；6%～25%为（+）；26%～50%为（++），>50%为（+++）。（+）～（+++）记为阳性。
1.4 统计学处理
应用SPSS13.0版统计软件进行数据分析，计数资料采用χ2检验，指标之间的关系采用Spearson相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组LECs的凋亡情况比较
2.2 两组LECs中Fas、FasL蛋白的表达比较
2.3 Fas、FasL表达与细胞凋亡数之间的关系
3 讨论
Fas又称为Apo-1或CD95，是属于肿瘤坏死因子受体/神经生长因子受体（TNFR/NG-FR）家族的I型跨膜糖蛋白；FasL是Fas在体内的天然配体，属于TNF家族的Ⅱ型膜蛋白。Fas与FasL以膜分子或可溶性分子形式存在于哺乳类机体细胞株表面，两者在诱导细胞凋亡过程中的具有独特作用：Fas起抑制作用，FasL则起促进作用，二者结合后，可以诱导Fas阳性细胞凋亡，这是诱导细胞凋亡的重要途径之一。目前多数学者均认同Fas/FasL系统所诱导的细胞凋亡机制在机体与肿瘤细胞对抗中具有重要的生物学意义，而对Fas/FasL在白内障发生过程中的作用机制研究仍处于初步阶段。国外Okamura N等[6]比较了年龄相关性白内障和糖尿病性白内障LEC的免疫组化及RT-PCR表明有增殖性视网膜病变的白内障组Fas及其mRNA的表达明显增高。认为细胞凋亡在合并有增殖性视网膜病变的白内障组可能是通过Fas途径介导的。国内尹莉莉等[7-8]研究发现Fas蛋白介导的LECs的凋亡在年龄相关性白内障及糖尿病性白内障的形成中起重要的作用。 本研究应用免疫组织化学法比较了对照组与老年性白内障组LECs中Fas、FasL的表达情况，证实老年性白内障患者LECs中Fas、FasL的阳性表达率均明显高于正常人，且Fas、FasL在LECs中的表达与LECs凋亡百分率呈正相关（r=0.574，614，P<0.01）。提示老年性白内障形成过程可能与Fas、FasL的调控有关。推测这可能是正常人LECs中尽管也存在Fas与FasL的联合表达，但并不能够引发自身凋亡，LECs的凋亡可能需要足够数量的FasL-Fas结合来提供凋亡刺激信号。LECs一旦受到其他损害刺激时，可激活FasL-Fas系统，大量FasL-Fas表达并结合，从而提供凋亡的刺激信号，最后导致LECs发生自身凋亡，伴随出现的水电平衡失调及其他一些病理改变，最终形成白内障。相信随着LECs凋亡及Fas、FasL表达调控机制逐渐被人们所认识，抑制Fas、FasL表达的相关分子生物学药剂的研发，将为白内障的非手术治疗以及药物的开发提供新的思路。
[参考文献]
[1] Yoon JH，Gores GJ.Death receptor-mediated apoptosis and the liver[J].Hepatol，2006，37（6）：400-408.
[2] Jeremians I，Kupatt C，Martin-Villalba A，et al.Involvement of CD95/Apol/Fas in cell death after myocardial ischemia[J].Circulation，2004，174（1）：71-78.
[3] Nogae S，Miyazaki M，Kobayashi N，et al.Induction of apoptosis in ischemia-reperfusion mode1 of mouse kidney：Possible involvement of Fas[J].Soc Nephrol，2006，58（6）：620-625.
[4] Huang XR，Qi MX，Wang ZY，et al.Inhibition effects of compound leech eye drops on apoptosis of lens epithelial cells and expressions of Bcl-2 and Bax genesin rats[J].Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao，2007，5（6）：681-685.
[5] 李桂荣，苏冠方，周鸿雁.老年白内障晶状体上皮细胞凋亡及凋亡基因的表达.中国老年学杂志，2007，27（12）：1186.
[6]Okamura N，Ho Y，Shibata MA，et al.Fas-mediated apoptosis in human lens epithellal cells of cataracts associated with diabetic retinopathy[J].Med Electron Mierosc，2002，35（4）：234.
[7] 尹莉莉，管怀进，胡红莉，等.白内障手术摘出前囊下晶状体上皮细胞中整联蛋白、Fas蛋白的表达[J].眼外伤职业眼病杂志，2008，30（12）：918-920.
[8] 胡红莉，尹莉莉，管怀进.白内障患者晶状体上皮细胞中Fas蛋白的表达[J].国际眼科杂志，2008，8（2）：35-37.
（收稿日期：2012-11-26）
[基金项目] 广东省东莞市医疗卫生一般科技项目（201210515011085）。