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摘要 [目的]建立芜菁子中黄酮类成分的TLC鉴别方法和采用薄层色谱分离和生物活性检测相结合的薄层色谱-自显影技术，初步筛选芜菁子药材中的抗氧化活性成分。[方法]以槲皮素和山奈酚为对照品，采用3种薄层展开系统，选出最佳薄层展开系统；喷以二苯代苦味肼自由基 （DPPH）溶剂（1 ml含0.08 mg的甲醇溶液）显色，筛选抗氧化活性。[结果]芜菁子中黄酮类物质的TLC鉴别的最佳展开系统为甲苯-乙酸乙酯-甲酸（22∶14∶1.2）；TLC-生物自显影抗氧化活性筛选中，黄酮类成分的薄层板呈紫色背景白色斑点。[结论]芜菁子药材中黄酮类成分的TLC鉴别方法可行，重复性好，可作为芜菁子药材的薄层鉴别方法；芜菁子药材中的黄酮类成分具有抗氧化活性。
关键词 芜菁子；黄酮；TLC；TLC-生物自显影
中图分类号 S567 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）26-08944-02
Using TLC-DPPH to Screen Antioxidant Component in Brassica rapa L. Seeds
DAI Wen-jie， SUN Lian （College of Pharmacy， Xinjiang Medical University， Urumqi， Xinjiang 830011）
Abstract [Objective] To establish the thin-layer chromatography for identifying flavonoids and using TLC-DPPH preliminarily screen antioxidant components in Brassica rapa L. seeds. [Method] Quercetin and kaempferol as reference substance， using three ordinary organic deployable system to chose the best one， using TLC-DPPH to screen antioxidant active. [Result] The best deployable system is methylbenzene-ethyl acetate-formic acid （22∶14∶1.2）； the thin-layer board of flavonoids ingredients shows purple background white spots. [Conclusion] This TLC method is simple with good reproducibility. It can be utilized as TLC method for Brassica rapa L. seeds， the flavonoids ingredients of Brassica rapa L. seeds have antioxidant activity.
Key words Brassica rapa L. seeds； Flavonoids； TLC； TLC-DPPH
蕪菁子为十字花科植物芜菁（Brassica rapa L.）干燥成熟的种子[1]，为种子植物门、双子叶植物纲、十字花科、芸苔属，二年生草本植物，是维吾尔医药常用药材[2-3]。芜菁子具有清肝明目、破积通淋、利湿退黄的功效，主治下气消积、黄疸、利湿解毒、乳痈、消渴、瘰疬、目暗积聚、风热毒肿、青盲、癃闭[4]。芜菁子中有挥发油、脂肪酸、黄酮、氨基酸、微量元素、糖类化合物等众多成分[5]。黄酮类化合物作为一种功能成分，具有许多有益的生理效应与药理作用，越来越受到重视[6]。现代研究表明，黄酮类化合物在体内具有改善微循环、改变体内酶活性、降血脂、降胆固醇、抗自由基、抗氧化、增强免疫功能、抑菌、抗病毒和抗炎症等药理作用[7]。孙莲等采用硅胶、凝胶柱色谱及重结晶等方法从芜菁子中分离出槲皮素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、5-羟基-3′，4′，6，7-四甲氧基黄酮等黄酮类单体[8]。从天然产物中得到的成分往往要进行生物活性测定，传统的活性测定方法在使用过程中有一定的局限性[9]。薄层色谱（thin—layer chromatography，TLC）-自显影技术（autography）就是利用薄层层析和生物活性测定相结合的活性物质筛选方法，是一种集分离、活性成分测定及鉴定于一体的药物筛选的“化合物+生物活性”的测定方法[10]。可弥补传统活性测定方法的不足，其操作简单、耗费低、灵敏度和专属性高，是一种快速测定生物活性的方法。笔者首先建立了芜菁子中黄酮类物质的TLC鉴别方法，并采用TLC-生物自显影法对芜菁子的黄酮类物质进行抗氧化活性成分的初步筛选。
1 材料与方法
1.1 仪器 半自动点样仪（CAMAG LINOMAT5），薄层色谱数码成像系统（CAMAG REPROSTAR3），100 μl微量进样针，KQ5200DE型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），HWS26型电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司），双槽展开缸（20 cm×20 cm），分析天平（Mettler-Teledo，AL204-S，d=0.01/0.1mg）。
1.2 试剂与药材 槲皮素对照品（中国药品生物制品检定所）；山奈酚对照品（中国药品生物制品检定所）；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）；高效G板（青岛海洋化工厂）；芜菁子由新疆医科大学中医学院中药教研室乌莉娅·沙依提副教授鉴定为芜菁Brassica rapa L. 的种子，粉碎后过60目筛，于密闭容器置于冰箱冷藏保存。其余试剂均为分析纯。 1.3 试验方法
1.3.1 供试品溶液的制备。精密称取芜菁子药材粉末5 g，置于250 ml锥形瓶中，加入石油醚30 ml，超声30 min（20 ℃水浴），过滤，滤渣挥干石油醚，滤渣转移至100 ml锥形瓶中，加甲醇30 ml，超声提取30 min∕回流提取1 h（70 ℃水浴），离心，取上清液至加25%的HCl 8 ml，超声30 min（65 ℃水浴）/回流提取1 h（80 ℃水浴），迅速冷至室温后转移至蒸发皿中于水浴锅上蒸发至干，残渣用20 ml蒸馏水润洗，过滤，滤液转移至已加入10 ml乙酸乙酯的分液漏斗中，萃取3次，合并乙酸乙酯层于水浴锅上浓缩至约5 ml，即得供试品溶液。
1.3.2 对照品溶液的制备。取槲皮素、山奈酚对照品各适量，加甲醇溶解并定容，制成每1 ml各含0.5 mg的对照品溶液。
1.3.3 显色剂溶液的制备。称取1 g的三氯化铝用100 ml的乙醇溶解制成1%的三氯化铝乙醇溶液。
1.3.4 薄层色谱鉴别。
1.3.4.1 展开系统的选择。分别吸取槲皮素与山奈酚对照品溶液各3 μl以及芜菁子供试品溶液6 μl，点于同一高效G硅胶薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（22∶14∶1.2）、甲苯-氯仿-丙酮（8∶5∶7）、正己烷-乙酸乙酯-甲酸（7∶5∶0.8）3种不同展开系统展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铝乙醇溶液显色，105 ℃加热5 min至斑点清晰，紫外光366 nm下检视，通过图中斑点数目、分离度和拖尾情况确定最佳展开系统。
1.3.4.2 样品不同提取方法的考察。分别吸取用超声提取方法的芜菁子供试品溶液以及用回流提取的芜菁子供试品溶液各6 μl点于同一薄层板上，以最佳展开系统展开，取出，晾干，喷以1%三氯
化铝乙醇溶液显色，105 ℃加热5 min至斑点清晰，紫外光366 nm下检视。
1.3.5 TLC-生物自显影法。分别吸取槲皮素与山奈酚对照品溶液各3 μl以及芜菁子供试品溶液6 μl，点于同一高效G硅胶薄层板上，以最佳展开系统展开，取出，晾干，喷以二苯代苦味肼自由基 （DPPH）溶剂（1 ml含0.08 mg的甲醇液）显色，105 ℃加热5 min至斑点清晰，可见光下检视。
3 讨论
（1）芜菁子中黄酮类物质的TLC鉴别的最佳展开系统为甲苯-乙酸乙酯-甲酸（22∶14∶1.2），样品最佳提取方法为回流。該研究过程中还考察了不同检视方法（白光、紫外366 nm、254 nm）以及不同薄层板（GF254板、G板、H板、高效G板、自铺板）等因素对试验的影响，结果发现斑点在紫外366 nm条件下检视效果最佳，自铺板因厚度大及铺板不均匀
等因素使斑点显现不清晰，其他薄层板结果差异不大，但高效G板相对来说分离度更好些且有利于TLC-生物自显影的斑点观察。
（2）该研究将TLC-薄层生物自显影法引入到芜菁子的抗氧化活性研究中，初步筛选出芜菁子的黄酮类成分具有抗氧化活性，从筛选结果发现芜菁子中的槲皮素及山奈酚均具有抗氧化活性，由样品展开斑点可初步推断，山奈酚的抗氧化能力大于槲皮素，但进一步确定还需要进行定量分析。此外， TLC-生物自显影薄层板上芜菁子样品除槲皮素和山奈酚外还显现出4个较清晰的抗氧化斑点，对这4种斑点的确认也将是接下来对芜菁子抗氧化成分进一步研究的重点。
参考文献
[1]马合木提·买买提明， 赛力慢·哈得尔， 玛尔哈巴·吾斯满. 芜菁种籽的研究进展[J]. 种子，2013，32（10）：54-55.
[2] 万文韬.芜菁[J].食品与生活，2005（5）：46-47.
[3] 李雅双，连路宁，阿西娜，等. 芜菁化学成分及生物活性的研究进展[J]. 时珍国医国药，2013，24（9）：2247-2249.
[4] 新疆维吾尔自治区卫生厅维吾尔药材标准 上册[M].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1993：8，123.
[5] 马彦玲.芜菁子化学成分研究[D].乌鲁木齐：新疆医科大学，2011：18.
[6] 华辉，郭用.黄酮类化合物药理研究进展[J].食品科学，1999，9（4）：9-12.
[7] 翟金兰，刘忆冬，马菁，等.恰玛古中类黄酮的微波萃取工艺研究[J].食品与发酵科技，2010，46（3）：94-97.
[8] 孙莲，马彦玲，巴图尔，等.芜菁子化学成分的研究[J].华西药学杂志，2012，27（1）：54-56.
[9] 曲建博，娄红祥，范培红. TLC生物自显影技术在药物筛选中的应用[J]. 中草药，2005，36（1）：132.
[10] 杨成，熊延靖，刘辉. 薄层色谱一自显影技术分离检测石榴皮清除自由基活性成分[J]. 皖南医学院学报，2011，30（4）：270.
关键词 芜菁子；黄酮；TLC；TLC-生物自显影
中图分类号 S567 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）26-08944-02
Using TLC-DPPH to Screen Antioxidant Component in Brassica rapa L. Seeds
DAI Wen-jie， SUN Lian （College of Pharmacy， Xinjiang Medical University， Urumqi， Xinjiang 830011）
Abstract [Objective] To establish the thin-layer chromatography for identifying flavonoids and using TLC-DPPH preliminarily screen antioxidant components in Brassica rapa L. seeds. [Method] Quercetin and kaempferol as reference substance， using three ordinary organic deployable system to chose the best one， using TLC-DPPH to screen antioxidant active. [Result] The best deployable system is methylbenzene-ethyl acetate-formic acid （22∶14∶1.2）； the thin-layer board of flavonoids ingredients shows purple background white spots. [Conclusion] This TLC method is simple with good reproducibility. It can be utilized as TLC method for Brassica rapa L. seeds， the flavonoids ingredients of Brassica rapa L. seeds have antioxidant activity.
Key words Brassica rapa L. seeds； Flavonoids； TLC； TLC-DPPH
蕪菁子为十字花科植物芜菁（Brassica rapa L.）干燥成熟的种子[1]，为种子植物门、双子叶植物纲、十字花科、芸苔属，二年生草本植物，是维吾尔医药常用药材[2-3]。芜菁子具有清肝明目、破积通淋、利湿退黄的功效，主治下气消积、黄疸、利湿解毒、乳痈、消渴、瘰疬、目暗积聚、风热毒肿、青盲、癃闭[4]。芜菁子中有挥发油、脂肪酸、黄酮、氨基酸、微量元素、糖类化合物等众多成分[5]。黄酮类化合物作为一种功能成分，具有许多有益的生理效应与药理作用，越来越受到重视[6]。现代研究表明，黄酮类化合物在体内具有改善微循环、改变体内酶活性、降血脂、降胆固醇、抗自由基、抗氧化、增强免疫功能、抑菌、抗病毒和抗炎症等药理作用[7]。孙莲等采用硅胶、凝胶柱色谱及重结晶等方法从芜菁子中分离出槲皮素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、5-羟基-3′，4′，6，7-四甲氧基黄酮等黄酮类单体[8]。从天然产物中得到的成分往往要进行生物活性测定，传统的活性测定方法在使用过程中有一定的局限性[9]。薄层色谱（thin—layer chromatography，TLC）-自显影技术（autography）就是利用薄层层析和生物活性测定相结合的活性物质筛选方法，是一种集分离、活性成分测定及鉴定于一体的药物筛选的“化合物+生物活性”的测定方法[10]。可弥补传统活性测定方法的不足，其操作简单、耗费低、灵敏度和专属性高，是一种快速测定生物活性的方法。笔者首先建立了芜菁子中黄酮类物质的TLC鉴别方法，并采用TLC-生物自显影法对芜菁子的黄酮类物质进行抗氧化活性成分的初步筛选。
1 材料与方法
1.1 仪器 半自动点样仪（CAMAG LINOMAT5），薄层色谱数码成像系统（CAMAG REPROSTAR3），100 μl微量进样针，KQ5200DE型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），HWS26型电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司），双槽展开缸（20 cm×20 cm），分析天平（Mettler-Teledo，AL204-S，d=0.01/0.1mg）。
1.2 试剂与药材 槲皮素对照品（中国药品生物制品检定所）；山奈酚对照品（中国药品生物制品检定所）；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）；高效G板（青岛海洋化工厂）；芜菁子由新疆医科大学中医学院中药教研室乌莉娅·沙依提副教授鉴定为芜菁Brassica rapa L. 的种子，粉碎后过60目筛，于密闭容器置于冰箱冷藏保存。其余试剂均为分析纯。 1.3 试验方法
1.3.1 供试品溶液的制备。精密称取芜菁子药材粉末5 g，置于250 ml锥形瓶中，加入石油醚30 ml，超声30 min（20 ℃水浴），过滤，滤渣挥干石油醚，滤渣转移至100 ml锥形瓶中，加甲醇30 ml，超声提取30 min∕回流提取1 h（70 ℃水浴），离心，取上清液至加25%的HCl 8 ml，超声30 min（65 ℃水浴）/回流提取1 h（80 ℃水浴），迅速冷至室温后转移至蒸发皿中于水浴锅上蒸发至干，残渣用20 ml蒸馏水润洗，过滤，滤液转移至已加入10 ml乙酸乙酯的分液漏斗中，萃取3次，合并乙酸乙酯层于水浴锅上浓缩至约5 ml，即得供试品溶液。
1.3.2 对照品溶液的制备。取槲皮素、山奈酚对照品各适量，加甲醇溶解并定容，制成每1 ml各含0.5 mg的对照品溶液。
1.3.3 显色剂溶液的制备。称取1 g的三氯化铝用100 ml的乙醇溶解制成1%的三氯化铝乙醇溶液。
1.3.4 薄层色谱鉴别。
1.3.4.1 展开系统的选择。分别吸取槲皮素与山奈酚对照品溶液各3 μl以及芜菁子供试品溶液6 μl，点于同一高效G硅胶薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（22∶14∶1.2）、甲苯-氯仿-丙酮（8∶5∶7）、正己烷-乙酸乙酯-甲酸（7∶5∶0.8）3种不同展开系统展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铝乙醇溶液显色，105 ℃加热5 min至斑点清晰，紫外光366 nm下检视，通过图中斑点数目、分离度和拖尾情况确定最佳展开系统。
1.3.4.2 样品不同提取方法的考察。分别吸取用超声提取方法的芜菁子供试品溶液以及用回流提取的芜菁子供试品溶液各6 μl点于同一薄层板上，以最佳展开系统展开，取出，晾干，喷以1%三氯
化铝乙醇溶液显色，105 ℃加热5 min至斑点清晰，紫外光366 nm下检视。
1.3.5 TLC-生物自显影法。分别吸取槲皮素与山奈酚对照品溶液各3 μl以及芜菁子供试品溶液6 μl，点于同一高效G硅胶薄层板上，以最佳展开系统展开，取出，晾干，喷以二苯代苦味肼自由基 （DPPH）溶剂（1 ml含0.08 mg的甲醇液）显色，105 ℃加热5 min至斑点清晰，可见光下检视。
3 讨论
（1）芜菁子中黄酮类物质的TLC鉴别的最佳展开系统为甲苯-乙酸乙酯-甲酸（22∶14∶1.2），样品最佳提取方法为回流。該研究过程中还考察了不同检视方法（白光、紫外366 nm、254 nm）以及不同薄层板（GF254板、G板、H板、高效G板、自铺板）等因素对试验的影响，结果发现斑点在紫外366 nm条件下检视效果最佳，自铺板因厚度大及铺板不均匀
等因素使斑点显现不清晰，其他薄层板结果差异不大，但高效G板相对来说分离度更好些且有利于TLC-生物自显影的斑点观察。
（2）该研究将TLC-薄层生物自显影法引入到芜菁子的抗氧化活性研究中，初步筛选出芜菁子的黄酮类成分具有抗氧化活性，从筛选结果发现芜菁子中的槲皮素及山奈酚均具有抗氧化活性，由样品展开斑点可初步推断，山奈酚的抗氧化能力大于槲皮素，但进一步确定还需要进行定量分析。此外， TLC-生物自显影薄层板上芜菁子样品除槲皮素和山奈酚外还显现出4个较清晰的抗氧化斑点，对这4种斑点的确认也将是接下来对芜菁子抗氧化成分进一步研究的重点。
参考文献
[1]马合木提·买买提明， 赛力慢·哈得尔， 玛尔哈巴·吾斯满. 芜菁种籽的研究进展[J]. 种子，2013，32（10）：54-55.
[2] 万文韬.芜菁[J].食品与生活，2005（5）：46-47.
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[8] 孙莲，马彦玲，巴图尔，等.芜菁子化学成分的研究[J].华西药学杂志，2012，27（1）：54-56.
[9] 曲建博，娄红祥，范培红. TLC生物自显影技术在药物筛选中的应用[J]. 中草药，2005，36（1）：132.
[10] 杨成，熊延靖，刘辉. 薄层色谱一自显影技术分离检测石榴皮清除自由基活性成分[J]. 皖南医学院学报，2011，30（4）：270.