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[摘要] 目的 探讨上皮性卵巢癌紫杉醇耐药细胞（A2780/Taxol）中UTP23基因表达水平及其对紫杉醇化疗耐药的影响。 方法 利用Real-Time PCR与Western blot分别从基因与蛋白表达水平检测A2780/Taxol 细胞中UTP23的表达水平，通过脂质体在A2780/Taxol 细胞中特异性瞬时过表达UTP23基因，利用MTT细胞增殖法观察过表达UTP23基因对A2780/Taxol 细胞药物敏感性的影响；通过Real-Time PCR检测A2780/Taxol 细胞过表达UTP23后抗凋亡基因Bcl-2蛋白表达水平。 结果 A2780/Taxol中UTP23的mRNA表达水平降低，约为A2780细胞的50%，UTP23蛋白表达水平下降，约为A2780细胞的48%（P<0.01）；相对于阴性转染组，UTP23基因过表达可显著提高A2780/Taxol 细胞中UTP23基因表达水平（P<0.05）；相对于阴性转染组，UTP23基因过表达A2780/Taxol细胞对紫杉醇的敏感性显著提高（P<0.01）；与阴性转染组相比，过表达UTP23基因后A2780/Taxol细胞Bcl-2基因表达水平显著下降（P<0.05）。 结论 UTP23基因在A2780/Taxol细胞中低表达，可能通过促进Bcl-2基因表达，从而参与A2780/Taxol细胞的耐藥作用。
[关键词] UTP23基因；紫杉醇；A2780/Taxol细胞；Bcl-2
[中图分类号] R737.31 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）08-0086-04
[Abstract] Objective To investigate the expression of UTP23 gene in paclitaxel-resistant epithelial ovarian cancer cells（A2780/Taxol） and its effect on drug resistance of paclitaxel chemotherapy. Methods Real-Time PCR and Western blot were used to detect the expression level of UTP23 in A2780/Taxol cells from the level of gene and protein expression. The UTP23 gene was transiently over-expressed in A2780/Taxol cells via liposomes. The effect of the over-expressed UTP23 gene on the drug sensitivity of A2780/Taxol cells was observed by MTT cell proliferation method. The expression of anti-apoptotic gene Bcl-2 protein after over-expression of UTP23 gene in A2780/Taxol cells was detected by Real-Time PCR. Results The expression level of UTP23 mRNA in A2780/Taxol decreased，which was about 50% of A2780 cells. And the UTP23 protein expression level decreased，which was 48% in A2780 cells（P<0.01）. Compared with negative transfection group， UTP23 gene over-expression could significantly increase the expression level of UTP23 gene in A2780/Taxol cells（P<0.05）. Compared with that in negative transfection group， the sensitivity of A2780/Taxol cells with over-expression of UTP23 gene to paclitaxel was significantly increased（P<0.01）. The expression of Bcl-2 gene after the over-expression of UTP23 gene in A2780/Taxol cells was significantly lower than that in negative transfection group（P<0.05）. Conclusion The expression of UTP23 gene is low in A2780/Taxol cells and may be involved in the drug resistance of A2780/Taxol cells by promoting the expression of Bcl-2 gene.
[Key words] UTP23 gene； Paclitaxel； A2780/Taxol cells； Bcl-2
上皮性卵巢癌是最常見的卵巢癌，位居女性生殖系统癌症死亡率榜首，由于缺乏早期临床症状及特异的早期诊断标志物，大部分患者确诊时已是肿瘤晚期阶段，严重威胁着女性患者的生存[1]。目前，临床手术及术后紫杉醇等化疗药物的联合治疗，一部分患者初步有效，然而，大部分患者往往由于化疗药物耐药性的产生，最终死亡[2]。大量研究表明，逆转化疗药物耐药将有助于改善患者预后[3]。UTP23是一种核仁蛋白，与90S前核糖体颗粒相互连接，参与18S rRNA的A0、A1及A2早期位点修饰，核糖体是蛋白质合成的重要组成部分，rRNA直接调控蛋白合成的过程[4]。近年来，研究发现UTP23在多重耐药的肿瘤中呈现异常表达，并且与肿瘤的耐药密切相关[5]。本研究旨在探讨UTP23在上皮性卵巢癌耐紫杉醇细胞中的表达及其与耐药的关系。 1 材料与方法
1.1 细胞株及培养
上皮性卵巢癌细胞株A2780与上皮性卵巢癌紫杉醇耐药细胞株A2780/Taxol均购于中国科学院细胞库，均使用含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液，在37℃、5%CO2条件下恒温培养，取对数生长期细胞进行实验。
1.2 实验材料
胎牛血清购自Gibco公司，噻唑蓝（MTT）、RPMI1640培养液、紫杉醇均购自Sigma公司，BCA蛋白浓度测定盒购自碧云天生物技术公司，兔抗人UTP23抗体、兔抗人Bcl-2抗体、抗GAPDH抗体及相对应的二抗均购自美国Abcam公司，脂质体转染试剂、阴性对照转染试剂购自Santa Cruz公司，qRT-PCR试剂盒购自Takara公司。
1.3 RT-PCR测定UTP23基因表达
取对数生长期的A2780细胞与A2780/Taxol细胞，使用Trazol裂解液提取细胞总RNA，按照Takara公司提供的逆转录试剂盒说明书合成cDNA。以GAPDH作为内参，进行UTP23基因扩增。反应条件为：95℃预变性30 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s 40个循环。应用2-ΔΔCt方法分别计算A2780细胞与A2780/Taxol细胞UTP23基因的相对表达量，重复3次实验。
1.4 Western blot蛋白印迹法测定UTP23蛋白表达水平
取对数生长期的A2780细胞与A2780/Taxol细胞，弃去细胞上清培养液，使用蛋白裂解液提取细胞蛋白后，BCA法进行蛋白定量检测蛋白浓度，以相同的作蛋白上样总量，进行凝胶蛋白电泳，电泳后将蛋白转移至预处理的硝酸纤维素膜，用5%浓度的脱脂牛奶封闭60 min，一抗孵育UTP23抗体（1∶100）、GAPDH抗体（1∶1000）4℃过夜。TBST溶液洗涤5次，每次3 min，加入相对应的二抗（1∶1000）室温孵育60 min。洗涤后加入化学发光液，进行曝光成像。
1.5 脂质体过表达UTP23基因与阴性对照
将A2780/Taxol细胞以3×105/孔接种于六孔板，含有10%胎牛血清完全培养液，在37℃、5%CO2恒温培养箱孵育至大约融合状态，参照脂质体转染试剂说明书，分别将阴性对照转染试剂及UTP23基因与脂质体混合后，加入A2780/Taxol細胞中，在37℃、5%CO2恒温箱继续孵育48 h。
1.6 MTT细胞增殖法观察UTP23基因对A2780/Taxol细胞耐药的影响
空白对照组（A2780/Taxol细胞）、阴性转染组（阴性转染A2780/Taxol细胞）与UTP23过表达组（过表达UTP23 基因A2780/Taxol细胞），以相同的细胞密度接种于96孔板，每组五个复孔，于37℃、5%CO2恒温培养24 h。分别加入紫杉醇（分别加入10、50、250、1250 nmol/L），继续培养48 h后，加入5 mg/mL的MTT培养液恒温孵育6 h，吸取上层细胞培养液弃去，加入100 μL DMSO完全溶解结晶，570 nm波长处测定吸光度值（A）。
1.7 RT-PCR法检测UTP23基因对A2780/Taxol细胞Bcl-2基因表达的影响
提取空白对照组、阴性转染组及过表达组细胞RNA，选取对数生长期A2780/Taxol细胞、阴性转染A2780/Taxol细胞与过表达UTP23 基因A2780/Taxol细胞，如方法1.3提取RNA、合成cDNA，进行Bcl-2基因扩增，以GAPDH作为内参，Bcl-2引物上游5’-CATGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3’下游5’- GCCGGTTCAGGTACTCAGTCA-3’。实验条件为：95℃预变性30 s，95℃ 5 s，60℃ 1 min，进行40个循环。应用2-ΔΔCt方法分别计算三组细胞UTP23基因的相对表达量，重复3次实验。
1.8 统计学方法
应用SPSS 16.0统计学软件进行数据统计与分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 A2780/Taxol细胞中UTP23基因的mRNA表达水平
通过RT-PCR检测A2780/Taxol细胞与A2780细胞中UTP23基因的mRNA表达水平，结果显示，A2780/Taxol细胞中UTP23的mRNA表达水平显著减少，约为A2780细胞的50%，差异具有统计学意义（P<0.01）（图1）。
2.2 A2780/Taxol细胞中UTP23基因的蛋白表达水平
如图2所示，Western blot检测A2780/Taxol细胞与A2780细胞中UTP23基因的蛋白表达水平，如图2A所示，UTP23蛋白在A2780/Taxol细胞中表达水平显著下调，约为A2780细胞的48%，A2780/Taxol細胞与A2780细胞UTP23蛋白表达水平比较，差异具有统计学意义（P<0.01）（图2B）。
2.3 A2780/Taxol细胞过表达UTP23基因
通过RT-PCR分别检测空白对照组、阴性转染组与UTP23过表达组的A2780/Taxol细胞UTP23基因mRNA表达水平，如图3所示，UTP23过表达的A2780/Taxol细胞UTP23 mRNA表达水平显著提高，约为阴性转染组的3.5倍，差异具有统计学意义（P<0.05），而空白对照组与阴性转染组的A2780/Taxol细胞UTP23的mRNA表达水平相比较，差异无统计学意义（P>0.05），说明UTP23基因过表达转染有效。
2.4 UTP23基因对A2780/Taxol细胞耐药的影响
[关键词] UTP23基因；紫杉醇；A2780/Taxol细胞；Bcl-2
[中图分类号] R737.31 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）08-0086-04
[Abstract] Objective To investigate the expression of UTP23 gene in paclitaxel-resistant epithelial ovarian cancer cells（A2780/Taxol） and its effect on drug resistance of paclitaxel chemotherapy. Methods Real-Time PCR and Western blot were used to detect the expression level of UTP23 in A2780/Taxol cells from the level of gene and protein expression. The UTP23 gene was transiently over-expressed in A2780/Taxol cells via liposomes. The effect of the over-expressed UTP23 gene on the drug sensitivity of A2780/Taxol cells was observed by MTT cell proliferation method. The expression of anti-apoptotic gene Bcl-2 protein after over-expression of UTP23 gene in A2780/Taxol cells was detected by Real-Time PCR. Results The expression level of UTP23 mRNA in A2780/Taxol decreased，which was about 50% of A2780 cells. And the UTP23 protein expression level decreased，which was 48% in A2780 cells（P<0.01）. Compared with negative transfection group， UTP23 gene over-expression could significantly increase the expression level of UTP23 gene in A2780/Taxol cells（P<0.05）. Compared with that in negative transfection group， the sensitivity of A2780/Taxol cells with over-expression of UTP23 gene to paclitaxel was significantly increased（P<0.01）. The expression of Bcl-2 gene after the over-expression of UTP23 gene in A2780/Taxol cells was significantly lower than that in negative transfection group（P<0.05）. Conclusion The expression of UTP23 gene is low in A2780/Taxol cells and may be involved in the drug resistance of A2780/Taxol cells by promoting the expression of Bcl-2 gene.
[Key words] UTP23 gene； Paclitaxel； A2780/Taxol cells； Bcl-2
上皮性卵巢癌是最常見的卵巢癌，位居女性生殖系统癌症死亡率榜首，由于缺乏早期临床症状及特异的早期诊断标志物，大部分患者确诊时已是肿瘤晚期阶段，严重威胁着女性患者的生存[1]。目前，临床手术及术后紫杉醇等化疗药物的联合治疗，一部分患者初步有效，然而，大部分患者往往由于化疗药物耐药性的产生，最终死亡[2]。大量研究表明，逆转化疗药物耐药将有助于改善患者预后[3]。UTP23是一种核仁蛋白，与90S前核糖体颗粒相互连接，参与18S rRNA的A0、A1及A2早期位点修饰，核糖体是蛋白质合成的重要组成部分，rRNA直接调控蛋白合成的过程[4]。近年来，研究发现UTP23在多重耐药的肿瘤中呈现异常表达，并且与肿瘤的耐药密切相关[5]。本研究旨在探讨UTP23在上皮性卵巢癌耐紫杉醇细胞中的表达及其与耐药的关系。 1 材料与方法
1.1 细胞株及培养
上皮性卵巢癌细胞株A2780与上皮性卵巢癌紫杉醇耐药细胞株A2780/Taxol均购于中国科学院细胞库，均使用含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液，在37℃、5%CO2条件下恒温培养，取对数生长期细胞进行实验。
1.2 实验材料
胎牛血清购自Gibco公司，噻唑蓝（MTT）、RPMI1640培养液、紫杉醇均购自Sigma公司，BCA蛋白浓度测定盒购自碧云天生物技术公司，兔抗人UTP23抗体、兔抗人Bcl-2抗体、抗GAPDH抗体及相对应的二抗均购自美国Abcam公司，脂质体转染试剂、阴性对照转染试剂购自Santa Cruz公司，qRT-PCR试剂盒购自Takara公司。
1.3 RT-PCR测定UTP23基因表达
取对数生长期的A2780细胞与A2780/Taxol细胞，使用Trazol裂解液提取细胞总RNA，按照Takara公司提供的逆转录试剂盒说明书合成cDNA。以GAPDH作为内参，进行UTP23基因扩增。反应条件为：95℃预变性30 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s 40个循环。应用2-ΔΔCt方法分别计算A2780细胞与A2780/Taxol细胞UTP23基因的相对表达量，重复3次实验。
1.4 Western blot蛋白印迹法测定UTP23蛋白表达水平
取对数生长期的A2780细胞与A2780/Taxol细胞，弃去细胞上清培养液，使用蛋白裂解液提取细胞蛋白后，BCA法进行蛋白定量检测蛋白浓度，以相同的作蛋白上样总量，进行凝胶蛋白电泳，电泳后将蛋白转移至预处理的硝酸纤维素膜，用5%浓度的脱脂牛奶封闭60 min，一抗孵育UTP23抗体（1∶100）、GAPDH抗体（1∶1000）4℃过夜。TBST溶液洗涤5次，每次3 min，加入相对应的二抗（1∶1000）室温孵育60 min。洗涤后加入化学发光液，进行曝光成像。
1.5 脂质体过表达UTP23基因与阴性对照
将A2780/Taxol细胞以3×105/孔接种于六孔板，含有10%胎牛血清完全培养液，在37℃、5%CO2恒温培养箱孵育至大约融合状态，参照脂质体转染试剂说明书，分别将阴性对照转染试剂及UTP23基因与脂质体混合后，加入A2780/Taxol細胞中，在37℃、5%CO2恒温箱继续孵育48 h。
1.6 MTT细胞增殖法观察UTP23基因对A2780/Taxol细胞耐药的影响
空白对照组（A2780/Taxol细胞）、阴性转染组（阴性转染A2780/Taxol细胞）与UTP23过表达组（过表达UTP23 基因A2780/Taxol细胞），以相同的细胞密度接种于96孔板，每组五个复孔，于37℃、5%CO2恒温培养24 h。分别加入紫杉醇（分别加入10、50、250、1250 nmol/L），继续培养48 h后，加入5 mg/mL的MTT培养液恒温孵育6 h，吸取上层细胞培养液弃去，加入100 μL DMSO完全溶解结晶，570 nm波长处测定吸光度值（A）。
1.7 RT-PCR法检测UTP23基因对A2780/Taxol细胞Bcl-2基因表达的影响
提取空白对照组、阴性转染组及过表达组细胞RNA，选取对数生长期A2780/Taxol细胞、阴性转染A2780/Taxol细胞与过表达UTP23 基因A2780/Taxol细胞，如方法1.3提取RNA、合成cDNA，进行Bcl-2基因扩增，以GAPDH作为内参，Bcl-2引物上游5’-CATGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3’下游5’- GCCGGTTCAGGTACTCAGTCA-3’。实验条件为：95℃预变性30 s，95℃ 5 s，60℃ 1 min，进行40个循环。应用2-ΔΔCt方法分别计算三组细胞UTP23基因的相对表达量，重复3次实验。
1.8 统计学方法
应用SPSS 16.0统计学软件进行数据统计与分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 A2780/Taxol细胞中UTP23基因的mRNA表达水平
通过RT-PCR检测A2780/Taxol细胞与A2780细胞中UTP23基因的mRNA表达水平，结果显示，A2780/Taxol细胞中UTP23的mRNA表达水平显著减少，约为A2780细胞的50%，差异具有统计学意义（P<0.01）（图1）。
2.2 A2780/Taxol细胞中UTP23基因的蛋白表达水平
如图2所示，Western blot检测A2780/Taxol细胞与A2780细胞中UTP23基因的蛋白表达水平，如图2A所示，UTP23蛋白在A2780/Taxol细胞中表达水平显著下调，约为A2780细胞的48%，A2780/Taxol細胞与A2780细胞UTP23蛋白表达水平比较，差异具有统计学意义（P<0.01）（图2B）。
2.3 A2780/Taxol细胞过表达UTP23基因
通过RT-PCR分别检测空白对照组、阴性转染组与UTP23过表达组的A2780/Taxol细胞UTP23基因mRNA表达水平，如图3所示，UTP23过表达的A2780/Taxol细胞UTP23 mRNA表达水平显著提高，约为阴性转染组的3.5倍，差异具有统计学意义（P<0.05），而空白对照组与阴性转染组的A2780/Taxol细胞UTP23的mRNA表达水平相比较，差异无统计学意义（P>0.05），说明UTP23基因过表达转染有效。
2.4 UTP23基因对A2780/Taxol细胞耐药的影响