论文部分内容阅读
【摘要】 目的 用实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者HBVDNA结果进行分析,以探讨其临床诊疗意义。方法 对850例临床标本用时间分辨荧光免疫技术定量测定乙肝病毒血清学指标,用荧光定量PCR法检测血标本中的HBVDNA,并依据乙肝两对半结果进行归类分组。结果 302份HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)标本中有261份HBVDNA为阳性,阳性率为86.4%,其PCR定量拷贝数为(2.21±0.76)×107/ml;321份HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)标本有96份HBVDNA阳性,阳性率达到29.91%,PCR定量拷贝数为(1.69±0.98)×106/ml;32份HBsAg(+)、HBcAb(+)标本中有9份HBVDNA为阳性,阳性率为28.13%,28份HBeAb(+)、HBcAb(+)标本有4份PCR HBVDNA阳性,阳性率14.29%;11份HBcAb(+)标本有6份PCR HBVDNA阳性,阳性率为42.9%;74份HBsAb(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)标本有5份HBVDNA阳性,阳性率6.75%;13份HBsAb(+)、HBeAb(+)阳性标本有2份PCR HBVDNA阳性,阳性率为14.3%;12份HBsAb(+)、HBcAb(+)标本有1份HBVDNA阳性,阳性率7.69%;4份HBsAb(+)的标本HBVDNA均为阴性,PCR定量拷贝数为<1.00E×103;24份HBsAg(+)、HBsAb(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)标本中有21份HBVDNA为阳性,阳性率为87.50%;1份HBsAg(+)标本HBVDNA均为阳性,阳性率为100%;10份HBsAg(+)、HBsAb(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)标本有3份HBVDNA均为阳性,阳性率30.00%,其余38例全阴性结果和各少见模式基本见有HBVDNA的检出。结论 PCR定量测定HBVDNA可以真实反映体内乙肝病毒感染和复制及病毒载量情况,更有利于临床治疗和疗效观察。
【关键词】
乙肝血清標志物;时间分辨荧光免疫技术;荧光定量PCR技术;临床应用
Clinical Significance of the detection of HBVDNA by the Realtime Fluorescence quantitative PCR
YU Anqing,CHEN Xiaoqing,SU Liping,et al. Central Hospital of Guangyuan,Guangyuan 628000,Sichuan China
【Abstract】 Objective To analyze HBVDNA results of hepatitis B patients using realtime fluorescence quantitative PCR detection and to explore the significance of their clinical treatment.Methods 850 cases of clinical specimens were detected by timeresolved fluorescence immunoassay quantitative determination and fluorescent quantitative PCR assay detected HBVDNA of blood samples and the results were divided groups.Results There were 261 positive in group that the HBsAg(+),HBeAg(+)and HBcAb(+)were positive and positive rate was 86.4%(261/302)and its quantitative PCR for copy number was(2.21 ± 0.76)× 107/ml.There were 96 positive in group that the HBsAg(+),HBeAb(+)and HBcAb(+)were positive and the positive rate was 29.91%(96/321)and its quantitative PCR for copy number was(1.69 ± 0.98)× 106/ml.There were 9 were positive in group that the HBsAg(+)and HBcAb(+)were positive and positive rate was 28.13%(9/32).There were 4 positive in group that the HBeAb(+)and HBcAb(+)were positive and positive rate was 14.29%(4/28).There were 6 positive in group that the HBcAb(+)was positive and the positive rate was 42.9%(6/11).There were 5 positive in group that the HBsAb(+),HBeAb(+)and HBcAb(+)were positive and the positive rate was 6.75%(5/74).There were 2 positive in group that HBsAb(+)and HBeAb(+)positive and the positive rate was 14.3%(2/13).There were 1 positive in group that HBsAb(+)and HBcAb(+)were positive and a positive rate was 7.69%(1/12).4 were negative in group of HBsAb(+).There were 21 positive in the group that were HBsAg(+),HBsAb(+),HBeAg(+)and HBcAb(+)were positive and the positive rate was 87.50%(21/24).The positive rate was 100%1 in group of HBsAg(+).There were 3 positive in group that HBsAg(+),HBsAb(+),HBeAb(+)and HBcAb(+)were positive and the positive rate was 30.00%(3/10).The remaining 38 patients were negative results.Conclusion PCR quantitative determination of HBVDNA can be a true reflection of hepatitis B virus infection and replication in vivo and more conducive to clinical treatment and efficacy.
【Key words】
Hepatitis B Serum Markers;Timeresolved Fluorescence Immunoassay;Fluorescence Quantitative PCR Technique;Clinical Application
DOI:10.3760/cma.j.issn 16738799.2010.01.48
作者单位:628000广元市中心医院
本文用荧光定量PCR法研究乙型肝炎患者HBVDNA定量检测与血清学免疫标志物水平之间的关系。并就其测定的临床价值报告如下。
1 资料与方法
1.1 血清标本来源 850份血清标本均取自2009年1月至2009年6月本院门诊及住院的患者。其中,男385例,女465例,平均年龄37.2岁。
1.2 血清标本的采集 采用一次性真空采血管,清晨空腹抽取静脉血5 ml,离心分离血清,20 ℃冻存备用,集中检测。
1.3 试剂 乙肝血清标志物HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb定量采用上海新波公司生产的时间分辨乙肝两对半试剂盒。荧光定量HBVDNA采用深圳达安公司HBVDNA扩增试剂盒。
1.4 仪器 乙肝定量使用ANYTEST 2000时间分辨仪及配套洗板机和混匀仪,荧光定量PCR用罗氏LightCycle实时荧光定量检测系统检测。
1.5 方法 乙肝标志物检测采用时间分辨法,HBVDNA采用实时荧光定量PCR法。
1.6 统计学方法 配对卡方检验。
2 讨论
血中HBVDNA的存在是HBV感染最为直接,最为灵敏和最为特异的指标。实时荧光定量PCR是目前临床检测血清HBVDNA常用的分子生物学方法。检测重复性好,而且实时荧光定量PCR还解決了抗病毒药物疗效观察的一大难题。850例标本,大三阳302例标本中有261份HBVDNA为阳性,阳性率为86.4%,其PCR定量拷贝数为(2.21±0.76)×107/ml;小三阳321例中有96份HBVDNA阳性,阳性率达到29.91%,PCR定量拷贝数为(1.69±0.98)×106/ml;32份HBsAg(+)、HBcAb(+)标本中有9份HBVDNA为阳性,阳性率为28.13%,28份HBeAb(+)、HBcAb(+)标本有4份PCR HBVDNA阳性,阳性率14.29%;11份HBcAb(+)标本有6份PCR HBVDNA阳性,阳性率为42.9%;74份HBsAb(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)标本有5份HBVDNA阳性,阳性率45.45%;13份HBsAb(+)、HBeAb(+)阳性标本有2份PCR HBVDNA阳性,阳性率为14.3%;12份HBsAb(+)、HBcAb(+)标本有1份HBVDNA阳性,阳性率7.69%;4份HBsAb(+)的标本HBVDNA均为阴性,PCR定量拷贝数为<1.00E×103;24份HBsAg(+)、HBsAb(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)标本中有21份HBVDNA为阳性,阳性率为87.50%;1份HBsAg(+)标本HBVDNA均为阳性,阳性率为100%;10份HBsAg(+)、HBsAb(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)标本有3份HBVDNA均为阳性,阳性率30.00%,其余38例全阴性结果和各少见模式基本见有HBVDNA的检出。文献报道有些出入[1];168份HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)标本有118份HBVDNA阳性,阳性率为70.2%,PCR定量拷贝数为(4.65±2.10)×105/ml。血清HBVDNA荧光定量PCR测定可以直接反映病毒复制状态,具有很多临床价值,但检测费用较高[2,3],而且不能完全反映病毒复制静息期肝细胞内HBV病毒状态,HBVDNA检测低于检测线下限并不代表体内HBVDNA已被完全清除,结合其他血清学免疫指标和生化学指标更能客观反映体内HBV病毒状态,正确判断预后和治疗。在实践中,常遇到的问题是乙肝标志物测定结果与HBVDNA检测结果之间的不一致,有两种情况:一是HBsAg阴性而HBVDNA PCR测定阳性;二是HBsAg阳性但HBVDNA阴性。前者可能是因为HBsAg标志物测定敏感性低,对极低浓度的HBsAg测不出,而PCR具有极高的灵敏度,HBVDNA含量即使很低(甚至低至数个分子),亦可检测出来;或HBsAg确已消失,但HBVDNA仍持续存在,病毒仍处于低水平复制状态;此外,在HBV初期感染时,也可能是有HBVDNA而无HBsAg。HBVDNA阴性才是HBV消除的明确指标。HBsAg阳性而HBVDNA阴性其原因一为血中HBVDNA虽然存在,但是在特定的PCR检测方法的下限以下,如有的PCR试剂灵敏度差,检测HBVDNA的下限仅至1 000个拷贝。第二种可能为血中存在的HBsAg是由HBVDNA整合到人染色体与宿主基因共同表达所致,所以测不到血清中病毒DNA。通常,HBsAg阳性血清,PCR检测HBVDNA的阳性率约为96%。HBV感染后至恢复期抗HBs阳性,血清HBVDNA PCR检测一般为阴性,少部分亦可为阳性。HBeAg阳性血清,HBVDNAPCR检测几乎全为阳性,并且大部分(超过60%)含量大于107拷贝/m1;HBeAg阴性而抗HBe阳性者,绝大部分HBVDNA含量小于103拷贝/ml,但仍有少部分(约10%)大于107拷贝/ml;在HBsAg阳性和抗HBc阳性者中,有将近一半其血清HBVDNA含量大于103拷贝/ml,约1/3大于107拷贝/m1。上述表明,血清HBeAg阴性和抗HBe阳性,说明病毒复制减弱,血中HBVDNA减少,但并未完全消失,并且少部分患者的HBVDNA含量还可能较高,因此,仅依靠抗原抗体检测,难以判断病毒复制的程度及传染性强弱,PCR检测HBVDNA应是评价传染性的最可靠的方法。
综上所述,大部分乙肝患者定量PCR检测HBVDNA的结果与HBV血清学标志物检测结果一致,但由于受到HBV基因包括S区、前C区等部X发生变异的影响,可引起HBV呈低水平复制,血清中HBsAg未能被检出或HBsAb不能有效清除血清中的HBV,血清中HBVDNA载量处于很低水平等,造成少数患者两种检测结果的不一致。本文检测结果表明,定量PCR检测HBVDNA在判断体内HBV是否在复制、复制的程度、HBV是否被清除,以及对HBV血清学标志阴性肝炎患者的诊断等方面,均优于HBV血清学标志物的检测,值得临床应用。
参考文献
[1] 赖宏芳,付晓野,董玉琳,等.荧光探针定量PCR检测HBVDNA.上海医学检验学杂志,2000,15(1):1819.
[2] 曹红卫,卫国,冯文曦,等.乙肝病毒DNA荧光定量PCR检测及其意义.第三军医大学学报,2001,23:866867.
[3] 张立国,张琚.实时定量PCR技术的介绍.生物技术,2003,13:39.
【关键词】
乙肝血清標志物;时间分辨荧光免疫技术;荧光定量PCR技术;临床应用
Clinical Significance of the detection of HBVDNA by the Realtime Fluorescence quantitative PCR
YU Anqing,CHEN Xiaoqing,SU Liping,et al. Central Hospital of Guangyuan,Guangyuan 628000,Sichuan China
【Abstract】 Objective To analyze HBVDNA results of hepatitis B patients using realtime fluorescence quantitative PCR detection and to explore the significance of their clinical treatment.Methods 850 cases of clinical specimens were detected by timeresolved fluorescence immunoassay quantitative determination and fluorescent quantitative PCR assay detected HBVDNA of blood samples and the results were divided groups.Results There were 261 positive in group that the HBsAg(+),HBeAg(+)and HBcAb(+)were positive and positive rate was 86.4%(261/302)and its quantitative PCR for copy number was(2.21 ± 0.76)× 107/ml.There were 96 positive in group that the HBsAg(+),HBeAb(+)and HBcAb(+)were positive and the positive rate was 29.91%(96/321)and its quantitative PCR for copy number was(1.69 ± 0.98)× 106/ml.There were 9 were positive in group that the HBsAg(+)and HBcAb(+)were positive and positive rate was 28.13%(9/32).There were 4 positive in group that the HBeAb(+)and HBcAb(+)were positive and positive rate was 14.29%(4/28).There were 6 positive in group that the HBcAb(+)was positive and the positive rate was 42.9%(6/11).There were 5 positive in group that the HBsAb(+),HBeAb(+)and HBcAb(+)were positive and the positive rate was 6.75%(5/74).There were 2 positive in group that HBsAb(+)and HBeAb(+)positive and the positive rate was 14.3%(2/13).There were 1 positive in group that HBsAb(+)and HBcAb(+)were positive and a positive rate was 7.69%(1/12).4 were negative in group of HBsAb(+).There were 21 positive in the group that were HBsAg(+),HBsAb(+),HBeAg(+)and HBcAb(+)were positive and the positive rate was 87.50%(21/24).The positive rate was 100%1 in group of HBsAg(+).There were 3 positive in group that HBsAg(+),HBsAb(+),HBeAb(+)and HBcAb(+)were positive and the positive rate was 30.00%(3/10).The remaining 38 patients were negative results.Conclusion PCR quantitative determination of HBVDNA can be a true reflection of hepatitis B virus infection and replication in vivo and more conducive to clinical treatment and efficacy.
【Key words】
Hepatitis B Serum Markers;Timeresolved Fluorescence Immunoassay;Fluorescence Quantitative PCR Technique;Clinical Application
DOI:10.3760/cma.j.issn 16738799.2010.01.48
作者单位:628000广元市中心医院
本文用荧光定量PCR法研究乙型肝炎患者HBVDNA定量检测与血清学免疫标志物水平之间的关系。并就其测定的临床价值报告如下。
1 资料与方法
1.1 血清标本来源 850份血清标本均取自2009年1月至2009年6月本院门诊及住院的患者。其中,男385例,女465例,平均年龄37.2岁。
1.2 血清标本的采集 采用一次性真空采血管,清晨空腹抽取静脉血5 ml,离心分离血清,20 ℃冻存备用,集中检测。
1.3 试剂 乙肝血清标志物HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb定量采用上海新波公司生产的时间分辨乙肝两对半试剂盒。荧光定量HBVDNA采用深圳达安公司HBVDNA扩增试剂盒。
1.4 仪器 乙肝定量使用ANYTEST 2000时间分辨仪及配套洗板机和混匀仪,荧光定量PCR用罗氏LightCycle实时荧光定量检测系统检测。
1.5 方法 乙肝标志物检测采用时间分辨法,HBVDNA采用实时荧光定量PCR法。
1.6 统计学方法 配对卡方检验。
2 讨论
血中HBVDNA的存在是HBV感染最为直接,最为灵敏和最为特异的指标。实时荧光定量PCR是目前临床检测血清HBVDNA常用的分子生物学方法。检测重复性好,而且实时荧光定量PCR还解決了抗病毒药物疗效观察的一大难题。850例标本,大三阳302例标本中有261份HBVDNA为阳性,阳性率为86.4%,其PCR定量拷贝数为(2.21±0.76)×107/ml;小三阳321例中有96份HBVDNA阳性,阳性率达到29.91%,PCR定量拷贝数为(1.69±0.98)×106/ml;32份HBsAg(+)、HBcAb(+)标本中有9份HBVDNA为阳性,阳性率为28.13%,28份HBeAb(+)、HBcAb(+)标本有4份PCR HBVDNA阳性,阳性率14.29%;11份HBcAb(+)标本有6份PCR HBVDNA阳性,阳性率为42.9%;74份HBsAb(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)标本有5份HBVDNA阳性,阳性率45.45%;13份HBsAb(+)、HBeAb(+)阳性标本有2份PCR HBVDNA阳性,阳性率为14.3%;12份HBsAb(+)、HBcAb(+)标本有1份HBVDNA阳性,阳性率7.69%;4份HBsAb(+)的标本HBVDNA均为阴性,PCR定量拷贝数为<1.00E×103;24份HBsAg(+)、HBsAb(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)标本中有21份HBVDNA为阳性,阳性率为87.50%;1份HBsAg(+)标本HBVDNA均为阳性,阳性率为100%;10份HBsAg(+)、HBsAb(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)标本有3份HBVDNA均为阳性,阳性率30.00%,其余38例全阴性结果和各少见模式基本见有HBVDNA的检出。文献报道有些出入[1];168份HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)标本有118份HBVDNA阳性,阳性率为70.2%,PCR定量拷贝数为(4.65±2.10)×105/ml。血清HBVDNA荧光定量PCR测定可以直接反映病毒复制状态,具有很多临床价值,但检测费用较高[2,3],而且不能完全反映病毒复制静息期肝细胞内HBV病毒状态,HBVDNA检测低于检测线下限并不代表体内HBVDNA已被完全清除,结合其他血清学免疫指标和生化学指标更能客观反映体内HBV病毒状态,正确判断预后和治疗。在实践中,常遇到的问题是乙肝标志物测定结果与HBVDNA检测结果之间的不一致,有两种情况:一是HBsAg阴性而HBVDNA PCR测定阳性;二是HBsAg阳性但HBVDNA阴性。前者可能是因为HBsAg标志物测定敏感性低,对极低浓度的HBsAg测不出,而PCR具有极高的灵敏度,HBVDNA含量即使很低(甚至低至数个分子),亦可检测出来;或HBsAg确已消失,但HBVDNA仍持续存在,病毒仍处于低水平复制状态;此外,在HBV初期感染时,也可能是有HBVDNA而无HBsAg。HBVDNA阴性才是HBV消除的明确指标。HBsAg阳性而HBVDNA阴性其原因一为血中HBVDNA虽然存在,但是在特定的PCR检测方法的下限以下,如有的PCR试剂灵敏度差,检测HBVDNA的下限仅至1 000个拷贝。第二种可能为血中存在的HBsAg是由HBVDNA整合到人染色体与宿主基因共同表达所致,所以测不到血清中病毒DNA。通常,HBsAg阳性血清,PCR检测HBVDNA的阳性率约为96%。HBV感染后至恢复期抗HBs阳性,血清HBVDNA PCR检测一般为阴性,少部分亦可为阳性。HBeAg阳性血清,HBVDNAPCR检测几乎全为阳性,并且大部分(超过60%)含量大于107拷贝/m1;HBeAg阴性而抗HBe阳性者,绝大部分HBVDNA含量小于103拷贝/ml,但仍有少部分(约10%)大于107拷贝/ml;在HBsAg阳性和抗HBc阳性者中,有将近一半其血清HBVDNA含量大于103拷贝/ml,约1/3大于107拷贝/m1。上述表明,血清HBeAg阴性和抗HBe阳性,说明病毒复制减弱,血中HBVDNA减少,但并未完全消失,并且少部分患者的HBVDNA含量还可能较高,因此,仅依靠抗原抗体检测,难以判断病毒复制的程度及传染性强弱,PCR检测HBVDNA应是评价传染性的最可靠的方法。
综上所述,大部分乙肝患者定量PCR检测HBVDNA的结果与HBV血清学标志物检测结果一致,但由于受到HBV基因包括S区、前C区等部X发生变异的影响,可引起HBV呈低水平复制,血清中HBsAg未能被检出或HBsAb不能有效清除血清中的HBV,血清中HBVDNA载量处于很低水平等,造成少数患者两种检测结果的不一致。本文检测结果表明,定量PCR检测HBVDNA在判断体内HBV是否在复制、复制的程度、HBV是否被清除,以及对HBV血清学标志阴性肝炎患者的诊断等方面,均优于HBV血清学标志物的检测,值得临床应用。
参考文献
[1] 赖宏芳,付晓野,董玉琳,等.荧光探针定量PCR检测HBVDNA.上海医学检验学杂志,2000,15(1):1819.
[2] 曹红卫,卫国,冯文曦,等.乙肝病毒DNA荧光定量PCR检测及其意义.第三军医大学学报,2001,23:866867.
[3] 张立国,张琚.实时定量PCR技术的介绍.生物技术,2003,13:39.