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摘 要 目的：采用免疫组化技术检测肝纤维化组织标本中PCNA和C-erbB-2预测肿瘤的发生等生物学行为，预测并分析肝纤维化继发肝肿瘤的危险性。方法：四氯化碳复合法制备肝纤维化模型，对纤维化肝组织进行病理分期，并用免疫组织化学方法检测纤维化肝组织内细胞增殖相关因子增殖细胞核抗原PCNA、癌基因C-erbB-2的表达。结果：研究表明，各实验组间PCNA、C-erbB-2阳性表达数随病理分期而增加，组间比较差异有显著性（P＜0.05）。结论：肝纤维化存在肝细胞异常增生及基因突变，在此基础上有肝恶性肿瘤发生之潜在危险性。
关键词 肝纤维化 肝肿瘤 病理检查 免疫组化
资料与方法
肝纤维化模型准备：①实验动物：健康雄性Sprague-Dawley大鼠，购自包头医学院实验动物中心。②实验试剂：四氯化碳，上海化学试剂厂生产；99.9%分析纯；10%乙醇，上海化学试剂厂生产。
四氯化碳复合肝纤维化模型制备方法：健康清洁级雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠（购自包头医学院实验动物中心）38只，体重150～220g，平均180g，随机分5组，根据文献报道方法采用复合因子致肝纤维化模型方法，建立鼠肝纤维化模型。
造模方法：①以79.5%纯玉米粉加20%猪油、0.5%胆固醇制成低蛋白高脂肪高胆固醇混合饲料喂饲实验大鼠；②以10%乙醇为惟一饮用水喂饲实验大鼠；③第1次皮下注射40%四氯化碳石蜡油液0.5ml/100g，以后每隔3天0.3ml/100g重复皮下注射，为期6周。
各期造模结束后处死实验动物，取肝组织以10%甲醛固定，标本大小约1cm×1cm×1cm。常规石蜡连续切片，分别进行苏木精-伊红（HE）及Masson三色染色进行病理观察。
染色结果：Masson染色胶原纤维呈蓝绿色，细胞核呈蓝黑色。HE染色细胞浆、结缔组织等呈不同程度的红色。采用2000年［１］西安全国会议通过的纤维化分期分类标准（S 0～4），至少在光学显微镜下显示包括6个以上汇管区，由两位有经验的病理科医生分别观察做出最终纤维化诊断。
纤维化程度分期诊断标准为：①S0期：无纤维化；②S1期：汇管区纤维化扩大，限局窦周及小叶内纤维化；③S2期：汇管区周围纤维化，纤维间隔形成，小叶结构保留；④S3期：小叶间隔伴小叶结构紊乱，无肝硬化；⑤S4期：早期肝硬化。
免疫组织化学：用免疫组织化学方法检测肝组织内细胞增殖相关因子增殖细胞核抗原PCNA、癌基因C-erbB-2的表达。
材料：①鼠抗人PCNA及C-erbB-2单克隆抗体，武汉博士德生物公司提供。②羊抗鼠IgG，美国Sigma公司提供。③SABC免疫组化检测试剂盒，武汉博士德生物公司提供。
方法步骤：①4μm厚的石蜡切片于APES处理过的载玻片上，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，PBS液冲洗1次。②采用微波修复法修复约20分钟，PBS液冲洗3分钟3次。③室温下，新鲜配制0.3%的过氧化氢-甲醇液阻断剂，浸泡切片10分钟，以阻断内源性过氧化酶的活性，取出后PBS液振洗5分钟×3次。④滴加复合消化液，37℃培育20分钟，充分暴露组织抗原。滴加10%正常鼠血清10分钟封闭非特异性抗原。室温下封闭10分钟,甩去多余液体，不洗。⑤分别滴加适当稀释的一抗，4℃湿盒孵育16小时，37℃复温1小时。取出后PBS液振洗5分钟×3次。⑥滴加生物素标记的二抗（鼠抗鼠IgG）,37℃湿盒内反应20分钟。取出后PBS振洗3分钟×3次。⑦滴加SABC复合物溶液（链霉素抗生素-过氧化酶），37℃濕盒内反应20分钟。取出后PBS振洗5分钟×4次。⑧苏木精复染，盐酸酒精分化数秒，氨水返蓝。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察结果。
实验对照：阳性对照由博士德生物工程有限公司提供阳性对照片，染色后均呈阳性。在免疫组化步骤中，以PBS液代替一抗作阴性对照，结果均为阴性。
阳性判定标准：PCNA阳性为胞核染色呈棕黄色，高倍镜下观察呈颗粒状。以空白切片为标准对照，高倍镜下（×400）随机选取10个视野，选择阳性细胞区域计数，根据计数多少判断PCNA表达量，计数高倍视野1000个细胞中的着色细胞，视野中PCNA阳性肝细胞数/1000×100%为PCNA阳性细胞标记指数（LI）计数高倍视野1000个细胞中的着色细胞，＞25%为（﹢），25%～50%为（﹢﹢），50%～75%为（﹢﹢﹢），＞75%为（﹢﹢﹢﹢）；C-erbB-2阳性为胞膜染色呈棕黄色，高倍镜下观察呈颗粒状，以空白切片为标准对照，高倍镜下（×400）随机选取10个视野，选择阳性细胞区域计数，根据计数多少判断C-erbB-2表达量，计数高倍视野1000个细胞中的着色细胞，视野中C-erbB-2阳性肝细胞数/1000×100%为C-erbB-2阳性细胞标记指数（LI）计数高倍视野1000个细胞中的着色细胞，＞25%为（﹢），25%～50%为（﹢﹢）， 50%～75%为（﹢﹢﹢），＞75%为（﹢﹢﹢﹢）。
统计学分析：所有计量资料均采用平均数±标准差表示并代入统计，应用SPSS10.0统计软件，不同组分析采用多组间方差统计分析，单因素相关分析采用spearson相关分析法，多因素分析采用逐步判别分析。
结 果
肝纤维化实验模型的建立：本实验中采用复合方法制备鼠肝纤维化模型，用药后实验动物表现进食减少、体重减轻、活动减少，38只实验鼠除3只因耐受不良死亡外，存活35只纳入最终统计，存活率为92.1%。表明尽管复合法制做肝纤维化模型制作方法较复杂，但与其他方法相比较，较为安全有效，周期短、成模率高，是鼠肝纤维化制备的理想模型，也更接近人类慢性肝病肝纤维化的病程。
实验病理结果：对照组为造模前经肝脏病理组织学检查证实为S0期，实验组分别于造模1周时经病理检查证实获得不同程度的肝纤维化。肝脏病理组织学检查证实，随着造模时间的延长，肝纤维化程度逐渐加重。1周时判断为S1～S2 期；2周时判断为S2～S3 期；4周时除肝细胞脂肪变性，气球样变性仍明显外，胶原纤维沿肝板延伸呈纤维隔状，但无完整分界形成，判断为S3～S4 期；6周时小叶间隔形成完整纤维隔，部分假小叶形成，判断为早期肝硬化，S4 期及以上。Masson三色染色显示汇管区纤维组织沉积明显，汇管区变大，纤维间隔增粗，重度时纤维组织向肝小叶内部延伸分隔肝组织，呈现出早期假小叶的病理结构特征形成。
肝组织内PCNA、C-erbB-2免疫组化表达结果：对照组肝细胞核未见PCNA表达，实验组各期肝细胞核PCNA表达阳性，胞核内显示棕褐色颗粒。对照组肝细胞膜未见C-erbB-2表达，实验组各期肝细胞膜C-erbB-2表达阳性，胞膜内显示棕褐色颗粒。高倍镜下（×400）随机选择10个高倍视野，对PCNA,C-erbB-2表达阳性的细胞计数。结果表明，各实验组间PCNA、C-erbB-2阳性表达数随病理分期而增加，组间比较差异有显著性（P＜0.05）。结果同时表明，各实验组间PCNA、C-erbB-2阳性表达数随超声积分而增加，组间比较有显著性差异（P＜0.05）。
讨 论
大鼠肝脏约占体重4.2%，分叶明显，通过肝裂可分为左外叶、左中叶、中叶、右叶、尾状叶和两个盘状的乳头状突，其超微结构与人相似，肝脏间质组织较少，肝小叶分叶不明显，相邻肝小叶常互相连接，只能依据中央静脉、小叶间血管和胆管的部位来区分肝小叶。门静脉为营养血管，供血约占3/4，肝静脉为肝脏血流惟一流出通道。
本实验中我们观察到，正常肝组织中PCNA 和C-erbB-2无阳性表达，肝纤维化过程中，PCNA和C-erbB-2呈阳性表达，PCNA和C-erbB-2阳性表达率均因病理分级和超声积分呈规律性变化，表明肝纤维化存在肝细胞异常增生及基因突变，在此基础上有肝恶性肿瘤发生之潜在危险性。
C-erbB-2是与癌症有关的典型的受体酪氨酸激酶，正常情况下在器官发生过程中介导细胞间相互作用，可与特异性配体结合促进细胞分裂，并可促使细胞发生恶性转化［2］。C-erbB-2家族中的成员在许多生理过程和肿瘤的发生或凋亡中起决定性作用。C-erbB-2是其重要成员，是许多基质配基的共同受体，它也是C-erbB-2家族中最有可能转变为原癌蛋白的成员，是细胞生长、分化和存活的重要调节因子。在上皮组织中，C-erbB-2介导细胞生长过程中间充质和上皮组织的信号转导，间充质中含有可以与C-erbB-2结合的NGR等受体。阻断C-erbB-2 途径可以抑制肿瘤细胞中无数条影响C-erbB-2表达的途径，对抑制肿瘤的发生发展有重要意义。
增殖细胞核抗原(PCNA)亦称周期素，与细胞周期紧密相关。PCNA是在细胞周期S期广泛表达的一种核蛋白，是一种仅在增殖细胞中合成和表达的36Kd多肽，PCNA 阳性表达说明该细胞正处于增殖状态。增殖细胞核抗原PCNA是一种了解细胞周期在特定时间细胞内表达的一种特异抗原的相关蛋白，在S期合成达到高峰，可较好的预示肿瘤的生物学行为。因此，PCNA作为一项评估细胞增殖状态的指标在肿瘤研究中的应用日渐增多。PCNA从分子水平可客观地反应肝细胞增殖状态，PCNA与肝纤维化程度具有相关性，其含量和表达强弱的变化与DNA合成及DNA复制的活跃程度一致，可作为病理组织分级的有益补充，是预测继发肝细胞癌潜在危险性的一个客观指标。
肿瘤的发生发展是一个多基因參与的多阶段过程。慢性肝病可出现肝细胞不典型增生、腺瘤样增生、再生结节、小管样化生、卵圆细胞增生和变异肝细胞灶等，均与肝细胞癌变的演化过程关系密切［3，4］。某一基因的异常变化可能影响组织生物学特性，肝脏过度或异常的纤维结缔组织增生，可导致肝小叶结构紊乱，引起肝细胞基因突变，在肝纤维化基础上发生原发性肝细胞癌。C-erbB-2是与细胞增殖相关的癌基因，PCNA标记细胞增殖的活性。本研究肝纤维化PCNA，C-erbB-2两者表达均为阳性，表明肝纤维化存在异常增生，同时在一个侧面解释肝纤维化基础上肝癌发病率缘何明显高于正常人。
本实验采用免疫组化法对大鼠肝纤维化过程中PCNA和 C-erbB-2的表达进行动态观察，评价肝细胞增殖状态，认为PCNA和C-erbB-2 高表达是继发肝肿瘤高危险性的预测指标。同时，我们发现PCNA和C-erbB-2表达呈正相关。因此，联合检测PCNA和C-erbB-2 在纤维化肝组织中的表达对评价肝纤维化继发肝肿瘤之潜在危险性评估方面有一定意义，提示临床上对PCNA和C-erbB-2 高表达的肝纤维化患者应加强随访。
参考文献
1 中华医学会传染病与寄生虫病学分会，肝病学分会，联合修订.病毒性肝炎防治方案.中华传染病杂志，2001，19:56-62
2 曹骥，赵荫农，吴飞翔，等.C-erbB-2受体家族在肝细胞癌中的表达及其意义.中华肝脏病杂志，2005，13（2）：146-147
3 姚登福.细胞因子在肝细胞癌变中的作用与机制.中华肝脏病杂志，2005，13（5）：378-379
4 Crowe PJ，Yang JL，Berney CR，et al.Genetic markers of survival and liver recurrence after resection of liver metastases from colorectal cancer.World J Surg，2001，25(8):996-1001
关键词 肝纤维化 肝肿瘤 病理检查 免疫组化
资料与方法
肝纤维化模型准备：①实验动物：健康雄性Sprague-Dawley大鼠，购自包头医学院实验动物中心。②实验试剂：四氯化碳，上海化学试剂厂生产；99.9%分析纯；10%乙醇，上海化学试剂厂生产。
四氯化碳复合肝纤维化模型制备方法：健康清洁级雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠（购自包头医学院实验动物中心）38只，体重150～220g，平均180g，随机分5组，根据文献报道方法采用复合因子致肝纤维化模型方法，建立鼠肝纤维化模型。
造模方法：①以79.5%纯玉米粉加20%猪油、0.5%胆固醇制成低蛋白高脂肪高胆固醇混合饲料喂饲实验大鼠；②以10%乙醇为惟一饮用水喂饲实验大鼠；③第1次皮下注射40%四氯化碳石蜡油液0.5ml/100g，以后每隔3天0.3ml/100g重复皮下注射，为期6周。
各期造模结束后处死实验动物，取肝组织以10%甲醛固定，标本大小约1cm×1cm×1cm。常规石蜡连续切片，分别进行苏木精-伊红（HE）及Masson三色染色进行病理观察。
染色结果：Masson染色胶原纤维呈蓝绿色，细胞核呈蓝黑色。HE染色细胞浆、结缔组织等呈不同程度的红色。采用2000年［１］西安全国会议通过的纤维化分期分类标准（S 0～4），至少在光学显微镜下显示包括6个以上汇管区，由两位有经验的病理科医生分别观察做出最终纤维化诊断。
纤维化程度分期诊断标准为：①S0期：无纤维化；②S1期：汇管区纤维化扩大，限局窦周及小叶内纤维化；③S2期：汇管区周围纤维化，纤维间隔形成，小叶结构保留；④S3期：小叶间隔伴小叶结构紊乱，无肝硬化；⑤S4期：早期肝硬化。
免疫组织化学：用免疫组织化学方法检测肝组织内细胞增殖相关因子增殖细胞核抗原PCNA、癌基因C-erbB-2的表达。
材料：①鼠抗人PCNA及C-erbB-2单克隆抗体，武汉博士德生物公司提供。②羊抗鼠IgG，美国Sigma公司提供。③SABC免疫组化检测试剂盒，武汉博士德生物公司提供。
方法步骤：①4μm厚的石蜡切片于APES处理过的载玻片上，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，PBS液冲洗1次。②采用微波修复法修复约20分钟，PBS液冲洗3分钟3次。③室温下，新鲜配制0.3%的过氧化氢-甲醇液阻断剂，浸泡切片10分钟，以阻断内源性过氧化酶的活性，取出后PBS液振洗5分钟×3次。④滴加复合消化液，37℃培育20分钟，充分暴露组织抗原。滴加10%正常鼠血清10分钟封闭非特异性抗原。室温下封闭10分钟,甩去多余液体，不洗。⑤分别滴加适当稀释的一抗，4℃湿盒孵育16小时，37℃复温1小时。取出后PBS液振洗5分钟×3次。⑥滴加生物素标记的二抗（鼠抗鼠IgG）,37℃湿盒内反应20分钟。取出后PBS振洗3分钟×3次。⑦滴加SABC复合物溶液（链霉素抗生素-过氧化酶），37℃濕盒内反应20分钟。取出后PBS振洗5分钟×4次。⑧苏木精复染，盐酸酒精分化数秒，氨水返蓝。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察结果。
实验对照：阳性对照由博士德生物工程有限公司提供阳性对照片，染色后均呈阳性。在免疫组化步骤中，以PBS液代替一抗作阴性对照，结果均为阴性。
阳性判定标准：PCNA阳性为胞核染色呈棕黄色，高倍镜下观察呈颗粒状。以空白切片为标准对照，高倍镜下（×400）随机选取10个视野，选择阳性细胞区域计数，根据计数多少判断PCNA表达量，计数高倍视野1000个细胞中的着色细胞，视野中PCNA阳性肝细胞数/1000×100%为PCNA阳性细胞标记指数（LI）计数高倍视野1000个细胞中的着色细胞，＞25%为（﹢），25%～50%为（﹢﹢），50%～75%为（﹢﹢﹢），＞75%为（﹢﹢﹢﹢）；C-erbB-2阳性为胞膜染色呈棕黄色，高倍镜下观察呈颗粒状，以空白切片为标准对照，高倍镜下（×400）随机选取10个视野，选择阳性细胞区域计数，根据计数多少判断C-erbB-2表达量，计数高倍视野1000个细胞中的着色细胞，视野中C-erbB-2阳性肝细胞数/1000×100%为C-erbB-2阳性细胞标记指数（LI）计数高倍视野1000个细胞中的着色细胞，＞25%为（﹢），25%～50%为（﹢﹢）， 50%～75%为（﹢﹢﹢），＞75%为（﹢﹢﹢﹢）。
统计学分析：所有计量资料均采用平均数±标准差表示并代入统计，应用SPSS10.0统计软件，不同组分析采用多组间方差统计分析，单因素相关分析采用spearson相关分析法，多因素分析采用逐步判别分析。
结 果
肝纤维化实验模型的建立：本实验中采用复合方法制备鼠肝纤维化模型，用药后实验动物表现进食减少、体重减轻、活动减少，38只实验鼠除3只因耐受不良死亡外，存活35只纳入最终统计，存活率为92.1%。表明尽管复合法制做肝纤维化模型制作方法较复杂，但与其他方法相比较，较为安全有效，周期短、成模率高，是鼠肝纤维化制备的理想模型，也更接近人类慢性肝病肝纤维化的病程。
实验病理结果：对照组为造模前经肝脏病理组织学检查证实为S0期，实验组分别于造模1周时经病理检查证实获得不同程度的肝纤维化。肝脏病理组织学检查证实，随着造模时间的延长，肝纤维化程度逐渐加重。1周时判断为S1～S2 期；2周时判断为S2～S3 期；4周时除肝细胞脂肪变性，气球样变性仍明显外，胶原纤维沿肝板延伸呈纤维隔状，但无完整分界形成，判断为S3～S4 期；6周时小叶间隔形成完整纤维隔，部分假小叶形成，判断为早期肝硬化，S4 期及以上。Masson三色染色显示汇管区纤维组织沉积明显，汇管区变大，纤维间隔增粗，重度时纤维组织向肝小叶内部延伸分隔肝组织，呈现出早期假小叶的病理结构特征形成。
肝组织内PCNA、C-erbB-2免疫组化表达结果：对照组肝细胞核未见PCNA表达，实验组各期肝细胞核PCNA表达阳性，胞核内显示棕褐色颗粒。对照组肝细胞膜未见C-erbB-2表达，实验组各期肝细胞膜C-erbB-2表达阳性，胞膜内显示棕褐色颗粒。高倍镜下（×400）随机选择10个高倍视野，对PCNA,C-erbB-2表达阳性的细胞计数。结果表明，各实验组间PCNA、C-erbB-2阳性表达数随病理分期而增加，组间比较差异有显著性（P＜0.05）。结果同时表明，各实验组间PCNA、C-erbB-2阳性表达数随超声积分而增加，组间比较有显著性差异（P＜0.05）。
讨 论
大鼠肝脏约占体重4.2%，分叶明显，通过肝裂可分为左外叶、左中叶、中叶、右叶、尾状叶和两个盘状的乳头状突，其超微结构与人相似，肝脏间质组织较少，肝小叶分叶不明显，相邻肝小叶常互相连接，只能依据中央静脉、小叶间血管和胆管的部位来区分肝小叶。门静脉为营养血管，供血约占3/4，肝静脉为肝脏血流惟一流出通道。
本实验中我们观察到，正常肝组织中PCNA 和C-erbB-2无阳性表达，肝纤维化过程中，PCNA和C-erbB-2呈阳性表达，PCNA和C-erbB-2阳性表达率均因病理分级和超声积分呈规律性变化，表明肝纤维化存在肝细胞异常增生及基因突变，在此基础上有肝恶性肿瘤发生之潜在危险性。
C-erbB-2是与癌症有关的典型的受体酪氨酸激酶，正常情况下在器官发生过程中介导细胞间相互作用，可与特异性配体结合促进细胞分裂，并可促使细胞发生恶性转化［2］。C-erbB-2家族中的成员在许多生理过程和肿瘤的发生或凋亡中起决定性作用。C-erbB-2是其重要成员，是许多基质配基的共同受体，它也是C-erbB-2家族中最有可能转变为原癌蛋白的成员，是细胞生长、分化和存活的重要调节因子。在上皮组织中，C-erbB-2介导细胞生长过程中间充质和上皮组织的信号转导，间充质中含有可以与C-erbB-2结合的NGR等受体。阻断C-erbB-2 途径可以抑制肿瘤细胞中无数条影响C-erbB-2表达的途径，对抑制肿瘤的发生发展有重要意义。
增殖细胞核抗原(PCNA)亦称周期素，与细胞周期紧密相关。PCNA是在细胞周期S期广泛表达的一种核蛋白，是一种仅在增殖细胞中合成和表达的36Kd多肽，PCNA 阳性表达说明该细胞正处于增殖状态。增殖细胞核抗原PCNA是一种了解细胞周期在特定时间细胞内表达的一种特异抗原的相关蛋白，在S期合成达到高峰，可较好的预示肿瘤的生物学行为。因此，PCNA作为一项评估细胞增殖状态的指标在肿瘤研究中的应用日渐增多。PCNA从分子水平可客观地反应肝细胞增殖状态，PCNA与肝纤维化程度具有相关性，其含量和表达强弱的变化与DNA合成及DNA复制的活跃程度一致，可作为病理组织分级的有益补充，是预测继发肝细胞癌潜在危险性的一个客观指标。
肿瘤的发生发展是一个多基因參与的多阶段过程。慢性肝病可出现肝细胞不典型增生、腺瘤样增生、再生结节、小管样化生、卵圆细胞增生和变异肝细胞灶等，均与肝细胞癌变的演化过程关系密切［3，4］。某一基因的异常变化可能影响组织生物学特性，肝脏过度或异常的纤维结缔组织增生，可导致肝小叶结构紊乱，引起肝细胞基因突变，在肝纤维化基础上发生原发性肝细胞癌。C-erbB-2是与细胞增殖相关的癌基因，PCNA标记细胞增殖的活性。本研究肝纤维化PCNA，C-erbB-2两者表达均为阳性，表明肝纤维化存在异常增生，同时在一个侧面解释肝纤维化基础上肝癌发病率缘何明显高于正常人。
本实验采用免疫组化法对大鼠肝纤维化过程中PCNA和 C-erbB-2的表达进行动态观察，评价肝细胞增殖状态，认为PCNA和C-erbB-2 高表达是继发肝肿瘤高危险性的预测指标。同时，我们发现PCNA和C-erbB-2表达呈正相关。因此，联合检测PCNA和C-erbB-2 在纤维化肝组织中的表达对评价肝纤维化继发肝肿瘤之潜在危险性评估方面有一定意义，提示临床上对PCNA和C-erbB-2 高表达的肝纤维化患者应加强随访。
参考文献
1 中华医学会传染病与寄生虫病学分会，肝病学分会，联合修订.病毒性肝炎防治方案.中华传染病杂志，2001，19:56-62
2 曹骥，赵荫农，吴飞翔，等.C-erbB-2受体家族在肝细胞癌中的表达及其意义.中华肝脏病杂志，2005，13（2）：146-147
3 姚登福.细胞因子在肝细胞癌变中的作用与机制.中华肝脏病杂志，2005，13（5）：378-379
4 Crowe PJ，Yang JL，Berney CR，et al.Genetic markers of survival and liver recurrence after resection of liver metastases from colorectal cancer.World J Surg，2001，25(8):996-1001