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[摘要] 目的 为了充分利用功劳木资源，为生产各种食品，医药品等多糖产品提供重要原料，提取功劳木中的多糖，并进行含量的测定。 方法 采用热水浸提法充分提取功劳木多糖，绘制葡萄糖标准曲线，利用Sevag 法脱蛋白提纯功劳木粗多糖并采用苯酚-硫酸法进行功劳木多糖含量的测定。 结果 测得样品中多糖的含量为0.689%，回收率为96.66%，RSD=0.158%（n=5）。 结论 功劳木中含有一定量的多糖，且该方法可作为检测贵港功劳木含量的较方便的方法。
[关键词] 贵港功劳木；多糖；含量测定
[中图分类号] TQ461 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）21-57-02
越来越多的研究证明多糖具有复杂的多方面的生物活性和功能，特别是对机体免疫功能的作用。可以这么说：多糖的大多数生物活性和功能均与免疫系统有关[1]。功劳木为小檗科植物阔叶十大功劳[Mahonia bealei（Fort.）Carr].或细叶十大功劳[Mahoniafortunei（Lindl.）Fedde]的干燥茎或茎皮，含小檗碱、小檗胺、药根碱、异汉防己碱、巴马亭等生物碱类成分，具有清热燥湿，泻火解毒之功效，主治湿热泻痢、黄疸尿赤、目赤肿痛、胃火牙痛、疮疖痈肿、痢疾、黄疸型肝炎[2-3]。还可抑制肿瘤细胞凋亡、逆转肿瘤多药性及抑制微管蛋白聚合的作用。近年来对植物多糖的研究已经成为一个热点，对于多糖抗氧化活性的研究大多以粗多糖为主，但对功劳木多糖含量的测定研究方面尚未见报道，本研究将对广西功劳木多糖的提取及分离纯化方面展开研究，为天然药物的开发和应用提供参考依据。
1 材料与试剂
1.1 药品与试剂
功劳木（产于广西贵港）；无水乙醇AR；乙醚AR；氯仿AR；正丁醇AR；葡萄糖标准品（J&K CHEMICAL LTD）；苯酚AR；硫酸AR。
1.2 实验仪器设备
DHG-9070A型电热恒温旋风干燥箱（上海精密设备有限公司）；梨形分液漏斗；台式连续投料粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；722N可见分光光度计（上海精科科学仪器有限公司）；电热式恒温水浴锅（江苏金坛宏凯仪器厂）；循环水真空抽气泵（上海嘉鹏科技有限公司）。
2 实验方法
2.1 功劳木多糖的粗提取
将功劳木粉碎并精确称取9g，平均分成3等份，分别置入100mL烧杯中，加入蒸馏水至40mL处将原料浸没，随后将其置于电热恒温水浴锅中，温度控制在65℃左右，3h后，用循环水真空抽气泵进行抽滤，将滤液放在500mL大烧杯中，以同样的方法反复提取3次，合并3次滤液后用电热恒温水浴锅将其加热浓缩至10～20mL，待冷却至室温后，加入60mL乙醇，在背光处静置24h，抽滤，滤饼依次用乙醇和乙醚洗三次，得到棕黄色粉末状固体0.093g。
2.2 功劳木多糖粗品的提纯
Sevag 法脱蛋白[4]：将2.1中得到的功劳木多糖粗品置于烧杯中，加入40mL，50℃蒸馏水溶解，得到多糖水解溶液，加入10mL的氯仿，再加入2.5mL的正丁醇，将此混合物激烈震荡20～30min后静置分离，利用分液漏斗除去含有变性蛋白的溶剂层，保留水层，按此步骤重复3次，脱掉蛋白质。将脱蛋白质后的多糖溶液用电热恒温水浴锅加热浓缩成膏状后，烘干，得到样品多糖提纯物w1，称量w1=0.062g。
2.3 功劳木多糖含量测定
2.3.1 标准溶液的配制 （1）50mL/L苯酚溶液的配制：精密量取苯酚5.00mL，置于100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，即得5.0%的苯酚溶液。（2）葡萄糖对照品溶液的配制：精密量取葡萄糖0.010g，置于100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，即得0.1mg/mL的葡萄糖溶液。
2.3.2 标准曲线的测定[5] 依次精确量取葡萄糖对照品溶液5.00、10.00、20.00、30.00、35.00mL，置于50mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，即得10、20、40、60、70μg/mL的5个不同浓度的对照品溶液。从5个不同浓度的对照品溶液中分别精密量取1.00mL溶液并分别置于5支10mL的具塞比色管中，按顺序加入1.50mL5.0%苯酚溶液和7.50mL浓硫酸溶液，混匀后室温下放置25min，用可见分光光度计在486nm处测定其吸光度值，绘制标准曲线，建立线性回归方程，结果见图1。由以上数据得到葡萄糖标准曲线方程：A=0.0654C-0.0057，r=0.9996。
2.3.3 功劳木多糖含量的测定（苯酚-硫酸[6-7]） 精确称取功劳木多糖提纯品0.0100g置于10mL试管中，加入1mol/L H2SO4 2mL，加热水解2h，待冷却至室温后，移至100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。按照2.3.2的方法，分别精密量取1.0mL不同浓度的功劳木样品液5份，置于5支10mL具比色管中，按顺序加入1.5mL 5.0%苯酚溶液和7.5mL浓硫酸溶液，混匀后室温下放置25min，用可见分光光度计在波长为486nm处测其吸光度值，利用回归方程计算贵港功劳木多糖的含量，其结果见表1。
根据葡萄糖标准曲线方程可以计算出贵港功劳木多糖含量，即平均浓度C=1.5764μg/mL。
2.3.4 功劳木粗多糖提取率的测定[8] （1）功劳木多糖与葡萄糖之间的换算因子F，且F=W0/（C×D）。W0为称取粗多糖的质量（?g）（实验中W=0.0100×106μg），D为粗多糖稀释液倍数（D=1000），由公式求得F为6.3436。（2）粗多糖提取率（%）=[C×D×F×K/W×106]×100（%）式中：C为2.3.3步骤中利用苯酚-硫酸法及线性回归方程所计算出的功劳木多糖的含量；D为稀释倍数；F为换算因子（F=6.3466）；K为贵港功劳木制备的样品多糖W1与称量的0.010g贵港功劳木多糖的比值（K=6.20）；W为贵港功劳木干粉重量（9g）。 将数据带入公式计算，可得：功劳木粗多糖提取率（%）=0.689%。
2.3.5 回收率的测定 按2.3.2方法，将分别精密量取的5个不同浓度的葡萄糖对照品溶液1mL置于分别5支10mL具塞比色管中，按顺序加入1.5mL 5.0%苯酚溶液和7.50mL浓硫酸溶液，混匀后室温下放置25min，最后分别加入2.3.3中的粗多糖溶液0.10mL，利用可见分光光度计在测定波长在486nm处的吸光度值，计算得，回收率为96.66%，RSD=0.158%（n=5）。
3 讨论
功劳木多糖的含量为0.689%，回收率为96.66%，RSD=0.158%（n=5）。
多糖是强极性分子，利用其溶于水而不溶于有机溶剂的特点采用热水浸提法提取，以防止引起糖苷键的断裂。且苯酚-硫酸法简单，快速，灵敏，误差小，不失为广西贵港功劳木多糖提取的较好的方法。
近年来，随着多糖产品在人们的生活生产中被广泛的应用，多糖领域的研究也越来越深入。广西贵港功劳木资源丰富，本研究以功劳木为原料进行了多糖含量测定的研究，为广西贵港功劳木资源的开发利用提供了有利的科学依据。
[参考文献]
[1] Kimura Y，Sumiyoshi M，Suzuki T，et al.Antitumor and antimetastatic activity of novel water-soluble low molecular weight beta-1，3-D-glucan（branch beta-1，6）isolated form Aureobasidium pullulans 1A1 strain black yeast [J].Anticancer Res，2006，26（6B）：4131-4141.
[2] 阴健，刘云，吴禾，等.中药现代研究与临床研究[M].北京：中医古籍出版社，1997：51.
[3] 中国药典委员会. 中华人民共和国药典（一部）[S] . 中国医药科技出版社，2010：79.
[4] 刘成海，万菌，涂宗财，等.百合多糖脱蛋白方法的研究[J].食品科技，2002，23（1）：89-90.
[5] 李金花，农石生，黄锁义，等.芒果叶多糖的提取及含量测定[J].食品研究与开发，2012，33（3）：135-137.
[6] 赵云涛，国兴明，李付振.金樱子多糖的抗氧化作用[J].云南中医中药杂志，2003，24（4）：35-37.
[7] 钟岩，潘浦群，王艳红，等.苯酚-硫酸法测定鲜人参中多糖含量[J].时珍国医国药，2008，19（8）：57-58.
[8] 刘志成.艾叶中黄酮和多糖的提取及分析[D].长沙：湖南师范大学，2009：18-25.
（收稿日期：2013-09-22）
[关键词] 贵港功劳木；多糖；含量测定
[中图分类号] TQ461 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）21-57-02
越来越多的研究证明多糖具有复杂的多方面的生物活性和功能，特别是对机体免疫功能的作用。可以这么说：多糖的大多数生物活性和功能均与免疫系统有关[1]。功劳木为小檗科植物阔叶十大功劳[Mahonia bealei（Fort.）Carr].或细叶十大功劳[Mahoniafortunei（Lindl.）Fedde]的干燥茎或茎皮，含小檗碱、小檗胺、药根碱、异汉防己碱、巴马亭等生物碱类成分，具有清热燥湿，泻火解毒之功效，主治湿热泻痢、黄疸尿赤、目赤肿痛、胃火牙痛、疮疖痈肿、痢疾、黄疸型肝炎[2-3]。还可抑制肿瘤细胞凋亡、逆转肿瘤多药性及抑制微管蛋白聚合的作用。近年来对植物多糖的研究已经成为一个热点，对于多糖抗氧化活性的研究大多以粗多糖为主，但对功劳木多糖含量的测定研究方面尚未见报道，本研究将对广西功劳木多糖的提取及分离纯化方面展开研究，为天然药物的开发和应用提供参考依据。
1 材料与试剂
1.1 药品与试剂
功劳木（产于广西贵港）；无水乙醇AR；乙醚AR；氯仿AR；正丁醇AR；葡萄糖标准品（J&K CHEMICAL LTD）；苯酚AR；硫酸AR。
1.2 实验仪器设备
DHG-9070A型电热恒温旋风干燥箱（上海精密设备有限公司）；梨形分液漏斗；台式连续投料粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；722N可见分光光度计（上海精科科学仪器有限公司）；电热式恒温水浴锅（江苏金坛宏凯仪器厂）；循环水真空抽气泵（上海嘉鹏科技有限公司）。
2 实验方法
2.1 功劳木多糖的粗提取
将功劳木粉碎并精确称取9g，平均分成3等份，分别置入100mL烧杯中，加入蒸馏水至40mL处将原料浸没，随后将其置于电热恒温水浴锅中，温度控制在65℃左右，3h后，用循环水真空抽气泵进行抽滤，将滤液放在500mL大烧杯中，以同样的方法反复提取3次，合并3次滤液后用电热恒温水浴锅将其加热浓缩至10～20mL，待冷却至室温后，加入60mL乙醇，在背光处静置24h，抽滤，滤饼依次用乙醇和乙醚洗三次，得到棕黄色粉末状固体0.093g。
2.2 功劳木多糖粗品的提纯
Sevag 法脱蛋白[4]：将2.1中得到的功劳木多糖粗品置于烧杯中，加入40mL，50℃蒸馏水溶解，得到多糖水解溶液，加入10mL的氯仿，再加入2.5mL的正丁醇，将此混合物激烈震荡20～30min后静置分离，利用分液漏斗除去含有变性蛋白的溶剂层，保留水层，按此步骤重复3次，脱掉蛋白质。将脱蛋白质后的多糖溶液用电热恒温水浴锅加热浓缩成膏状后，烘干，得到样品多糖提纯物w1，称量w1=0.062g。
2.3 功劳木多糖含量测定
2.3.1 标准溶液的配制 （1）50mL/L苯酚溶液的配制：精密量取苯酚5.00mL，置于100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，即得5.0%的苯酚溶液。（2）葡萄糖对照品溶液的配制：精密量取葡萄糖0.010g，置于100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，即得0.1mg/mL的葡萄糖溶液。
2.3.2 标准曲线的测定[5] 依次精确量取葡萄糖对照品溶液5.00、10.00、20.00、30.00、35.00mL，置于50mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，即得10、20、40、60、70μg/mL的5个不同浓度的对照品溶液。从5个不同浓度的对照品溶液中分别精密量取1.00mL溶液并分别置于5支10mL的具塞比色管中，按顺序加入1.50mL5.0%苯酚溶液和7.50mL浓硫酸溶液，混匀后室温下放置25min，用可见分光光度计在486nm处测定其吸光度值，绘制标准曲线，建立线性回归方程，结果见图1。由以上数据得到葡萄糖标准曲线方程：A=0.0654C-0.0057，r=0.9996。
2.3.3 功劳木多糖含量的测定（苯酚-硫酸[6-7]） 精确称取功劳木多糖提纯品0.0100g置于10mL试管中，加入1mol/L H2SO4 2mL，加热水解2h，待冷却至室温后，移至100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。按照2.3.2的方法，分别精密量取1.0mL不同浓度的功劳木样品液5份，置于5支10mL具比色管中，按顺序加入1.5mL 5.0%苯酚溶液和7.5mL浓硫酸溶液，混匀后室温下放置25min，用可见分光光度计在波长为486nm处测其吸光度值，利用回归方程计算贵港功劳木多糖的含量，其结果见表1。
根据葡萄糖标准曲线方程可以计算出贵港功劳木多糖含量，即平均浓度C=1.5764μg/mL。
2.3.4 功劳木粗多糖提取率的测定[8] （1）功劳木多糖与葡萄糖之间的换算因子F，且F=W0/（C×D）。W0为称取粗多糖的质量（?g）（实验中W=0.0100×106μg），D为粗多糖稀释液倍数（D=1000），由公式求得F为6.3436。（2）粗多糖提取率（%）=[C×D×F×K/W×106]×100（%）式中：C为2.3.3步骤中利用苯酚-硫酸法及线性回归方程所计算出的功劳木多糖的含量；D为稀释倍数；F为换算因子（F=6.3466）；K为贵港功劳木制备的样品多糖W1与称量的0.010g贵港功劳木多糖的比值（K=6.20）；W为贵港功劳木干粉重量（9g）。 将数据带入公式计算，可得：功劳木粗多糖提取率（%）=0.689%。
2.3.5 回收率的测定 按2.3.2方法，将分别精密量取的5个不同浓度的葡萄糖对照品溶液1mL置于分别5支10mL具塞比色管中，按顺序加入1.5mL 5.0%苯酚溶液和7.50mL浓硫酸溶液，混匀后室温下放置25min，最后分别加入2.3.3中的粗多糖溶液0.10mL，利用可见分光光度计在测定波长在486nm处的吸光度值，计算得，回收率为96.66%，RSD=0.158%（n=5）。
3 讨论
功劳木多糖的含量为0.689%，回收率为96.66%，RSD=0.158%（n=5）。
多糖是强极性分子，利用其溶于水而不溶于有机溶剂的特点采用热水浸提法提取，以防止引起糖苷键的断裂。且苯酚-硫酸法简单，快速，灵敏，误差小，不失为广西贵港功劳木多糖提取的较好的方法。
近年来，随着多糖产品在人们的生活生产中被广泛的应用，多糖领域的研究也越来越深入。广西贵港功劳木资源丰富，本研究以功劳木为原料进行了多糖含量测定的研究，为广西贵港功劳木资源的开发利用提供了有利的科学依据。
[参考文献]
[1] Kimura Y，Sumiyoshi M，Suzuki T，et al.Antitumor and antimetastatic activity of novel water-soluble low molecular weight beta-1，3-D-glucan（branch beta-1，6）isolated form Aureobasidium pullulans 1A1 strain black yeast [J].Anticancer Res，2006，26（6B）：4131-4141.
[2] 阴健，刘云，吴禾，等.中药现代研究与临床研究[M].北京：中医古籍出版社，1997：51.
[3] 中国药典委员会. 中华人民共和国药典（一部）[S] . 中国医药科技出版社，2010：79.
[4] 刘成海，万菌，涂宗财，等.百合多糖脱蛋白方法的研究[J].食品科技，2002，23（1）：89-90.
[5] 李金花，农石生，黄锁义，等.芒果叶多糖的提取及含量测定[J].食品研究与开发，2012，33（3）：135-137.
[6] 赵云涛，国兴明，李付振.金樱子多糖的抗氧化作用[J].云南中医中药杂志，2003，24（4）：35-37.
[7] 钟岩，潘浦群，王艳红，等.苯酚-硫酸法测定鲜人参中多糖含量[J].时珍国医国药，2008，19（8）：57-58.
[8] 刘志成.艾叶中黄酮和多糖的提取及分析[D].长沙：湖南师范大学，2009：18-25.
（收稿日期：2013-09-22）