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摘要
[目的]为了对光合细菌培养条件进行优化。[方法]通过单因素试验方法。[结果]在实验室条件下，光照强度为60 W，接种量为10%，培养基初始pH 6.5，培养温度 32 ℃，培养时间为72 h。优化后，辅酶Q10产量达到112.7 mg/L，比优化前增加提高了63.57%。[结论] 按照优化之后的培养条件进行发酵，辅酶Q10的产量得到大幅提高。
关键词 辅酶 Q10；光合细菌；培养条件
中图分类号 S188 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2015）15-001-02
Optimization of Cultivation Condition in Photosynthetic Bacteria that Produced Coenzyme Q10
WANG Xiaoli， XIA Wei， ZHANG Hao et al
（Qingdao Zhongren Animal Pharmaceutical Co.，Ltd.， Qingdao， Shandong 266329）
Abstract [Objective] The research aimed to optimize the cultivation condition of the photosynthetic bacteria.[Method] The single factor method was adopted.[Result] In lab condition， light intensity was 60 W， inoculation was 10%， initial pH of culture medium was 6.5， temperature was 32 ℃， and incubation time was 72 h.Coenzyme Q10 production reached 112.7 mg/L after optimization，and increased by 63.57% compared with preoptimization.[Conclusion] The yield of coenzyme Q10 increased sharply by fermentation according to the optimized cultivation condition.
Key words Coenzyme Q10；Photosynthetic bacteria；Cultivation condition
辅酶 Q10（CoQ10）又称泛醌，是一种存在于自然界的脂溶性醌类化合物，在原核细胞内存在于细胞质膜中，在真核细胞内主要存在于线粒体内，是呼吸链中NADH脱氢酶、琥珀酸脱氢酶和bc复合物之间的重要递氢体[1-2]。辅酶 Q10作为呼吸链组分之一，参与细胞能量物质——三磷酸腺苷的合成，能抑制线粒体的氧化，维护膜结构的完整性，提高机体免疫力，在抗肿瘤、高血压、心脏病及提高免疫系统等方面有重要功能，是临床价值颇高的生化药物[3-5]。
辅酶 Q10的生产方法有4种，分别是动植物组织提取法、化学合成法、植物细胞培养法和微生物发酵法，其中微生物发酵法因具有广泛的来源、相对简单的提取过程、良好的产物活性、相对高的产量等优点而日益受到社会的关注[6]。在众多微生物中，光合细菌菌体中CoQ10的含量相对较高。国外的微生物发酵技术较成熟，通过培养光合细菌提取CoQ10已实现产业化，而国内的微生物发酵技术比较薄弱，生产技术还不成熟，目前主要从动物组织中提取[7]。笔者在培养光照强度、接种量、培养基初始pH、培养温度和培养时间5个方面对光合细菌培养条件进行了优化，为CoQ10相关产品的研发奠定良好的基础。
1 材料与方法
1.1 菌种 供试光合细菌菌种由青岛中仁动物药品有限公司提供。
1.2 培养基 种子培养基组成为：葡萄糖 20.5 g/L、蛋白胨 2.0 g/L、氯化钠10.0 g/L、硫酸铵3.5 g/L、醋酸钠6.5 g/L、硫酸镁8.5 g /L、硫代硫酸钠4.8 g/L、硫酸亚铁1.5 g/L、磷酸氫二钾2.8 g/L、磷酸二氢钾3.5 g/L，pH 7.0，121 ℃ 灭菌 30 min。
1.3 液体培养条件
向250 ml三角瓶中加入100 ml培养基，按2%（V∶V）的初始接种量将种子液接入培养基中，培养温度为 30 ℃，60 W白炽灯充当光源，150 r/min 振荡培养 48 h，辅酶Q10的产量达 68.9 mg/L。
1.4 辅酶 Q10的提取和测定
量取5 ml发酵液，在转速为5 000 r/min 条件下离心 10 min，弃上清，用蒸馏水洗涤1 次，再于转速为5 000 r/min条件下离心10 min，弃上清，加入0.5 ml浓度30% H2O2和2 ml丙酮，用无水乙醇定容至 10 ml，35 ℃下超声 50.0 min，用孔径为0.22 μm 有机过滤器过滤，即可获得辅酶 Q10样品。通过高效液相色谱仪进行测定，检测波长 275 nm，BEH C181.7 μm 色谱柱（2.1 mm×50.0 mm） ，流动相V（甲醇）∶V（乙醇） 1∶4，柱温 35℃，流速0.4 ml/min[8-10]。
1.5 辅酶 Q10培养条件的优化
1.5.1 不同光照强度对辅酶 Q10合成的影响。
在光合细菌培养过程中，分别以15、40、60、100和200 W的白炽灯充当光源对其进行照射，考察辅酶 Q10产量受光照强度的影响。
1.5.2 不同接种量对辅酶 Q10合成的影响。在光合细菌接种时，其接种量分别为2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%（V∶V），考察辅酶 Q10产量受接种量的影响。 1.5.3 不同初始 pH 对辅酶 Q10合成的影响。
在光合细菌培养基配制后，分别将其初始 pH 调至 5.5、6.0、6.5、7.0、75，8.0，考察辅酶 Q10产量受初始 pH 的影响。
1.5.4 不同培养温度对辅酶 Q10合成的影响。
在光合细菌培养过程中，分别将其置于 26、28、30、32、34、36 ℃振荡培养箱中，考察辅酶 Q10产量受培养温度的影响。
1.5.5 不同培养时间对辅酶 Q10合成的影响。
在光合细菌培养过程中，分别在24、48、72、96、120 h不同的发酵时间，取发酵液进行检测，考察辅酶 Q10产量受培养时间的影响。
2 结果与分析
2.1 培养条件的优化
2.1.1 光照强度对辅酶 Q10合成的影响。
由图1可知，当以60 W白炽灯充当光源时，辅酶 Q10产量最高，达到68.9 mg/L。随着光照强度的增强，辅酶 Q10产量下降。原因可能是当光源为60 W白炽灯时，此条件下光的波长易被光合细菌吸收。所以，选择60 W白炽灯为培养光源。
2.1.2 接种量对辅酶 Q10合成的影响。由图2可知，当接种量为10%时，辅酶 Q10产量最高，达到 86.3 mg/L。过低的接种量（如2%）导致菌体生长缓慢，辅酶 Q10合成量偏低；而当接种量高于10%时，光合细菌虽然繁殖迅速，但有限的营养成分抑制菌体生长，辅酶 Q10的合成也随之降低。
2.1.3 初始 pH对辅酶 Q10合成的影响。
由图3可知，当 pH 值为6.5时，辅酶 Q10的合成量最高，达到 108.4 mg/L，偏低或偏高的pH均会影响辅酶 Q10的合成。这可能是由于培养基初始 pH会影响光合细菌的细胞状态，进而影响菌体对培养基的利用率，影响辅酶 Q10的合成。
2.1.4 培养温度对辅酶 Q10产量的影响。
由图4可知，在 32 ℃，辅酶Q10的产量达到最大值（109.0 mg/L），因此发酵生产的最适温度为32 ℃。过低或过高的培养温度都不利于辅酶 Q10的合成。
2.1.5 培养时间对辅酶 Q10产量的影响。由图5可知，在24～72 h，辅酶 Q10累积量迅速升高，达到112.7 mg/L；在72～120 h，辅酶 Q10的累积量仍然不断升高，但速度非常缓慢。所以，光合细菌的最佳培养时间为72 h。
2.2 中试发酵罐试验对比
向5 L中试发酵罐中加入3.5 L培养基，按优化之前的培养条件培养，辅酶Q10产量为66.4 mg/L；按优化之后的培养条件培养，即初始培养基pH调为6.5，60 W白炽灯充当光源，10%（V∶V）的初始接种量，培养温度为 32 ℃，培养 72 h，提取辅酶Q10，并进行检测，其产量为100.9 mg/L，比优化之前提高52.0%。由5 L中试发酵罐扩大到生产大罐进行发酵，还需要根据具体的生产情况对发酵工艺进行调整。
3 结论
光合细菌在自然界中普遍存在，是地球上出现最早且具有原始光能合成体系的原核生物。光合细菌富含辅酶Q10。辅酶Q10是人类生命不可缺少的重要元素之一，具有增强抗氧化、延缓衰老、增强心肌功能、改善细胞内呼吸等多种生理功能，能够促进动物的生长，提高免疫力[11]。光合细菌的培养条件是影响辅酶 Q10生产的关键因素[12]。研究表明，在实验室条件下，当光照强度为60 W，接种量为10%，培养基初始pH为6.5，培养温度为32 ℃，培养时间为72 h时，辅酶Q10产量由优化前的68.9 mg/L达到112.7 mg/L，增长了6357%。5 L中试发酵罐的试验结果显示，按照优化之后的培养条件进行发酵，辅酶Q10产量比优化之前提高了52.0%。
参考文献
[1]
钱雪，王祖巧，韩国平，等.辅酶 Q10的药理及应用[J].食品与药品，2006，8（1）：16-18.
[2] 汪多仁 .辅酶 Q10的开发与应用进展 [J].饮料工业，2010，13（8）：8-16.
[3] 王淑英，邵忠富.辅酶Q10的生物学功能及临床应用[J].齐齐哈尔医学院学报，1994，15（1）：47-50.
[4] 陈炳志，赵瑾，王超杰，等 .辅酶 Q10的应用概况与合成进展[J]. 化学研究，1999，10（1）：29-33.
[5] 何兆雄.动物生化制药基础[M].北京：中国商业出版社，1985：299-308.
[6] 吴向华，杨启银，刘五星.光合细菌的研究进展及其应用[J].中国农业科技导报， 2004， 6（2）： 35-38.
[7] 吴祖芳，翁佩芳，李寅，等.辅酶 Q10发酵生产的育种思路及发酵条件优化策略 [J]. 食品与发酵工业，2001，27（7）：49-53.
[8] YOSHIDA H，KOTANI Y，OCHIAI K，et al.Production of ubiquinone10 using bacteria [J]. Journal of General and Applied Microbiology，1998，44（1）：19-26.
[9] NOHL H，STANIEDK K，GILLE L，et al.The multiple functions of Coenzyme Q [J]. Bioorganic Chemistry，2001，29（1）：1-13.
[10] 佘晓雷，王根华.辅酶Q10的纯化和鉴定方法研究[J].食品研究与开发，2004，4（9）：129-130.
[11] FORKERS K.Biomedical and clinical aspects of coenzyme Q[M].Amsterdam：Elsevier/NorthHolland Press，1977：316.
[12] FLORKIN M M，STOTZ E H.In comprensive biochemistry[M].Amsterdam：Elesiver，1996.
[目的]为了对光合细菌培养条件进行优化。[方法]通过单因素试验方法。[结果]在实验室条件下，光照强度为60 W，接种量为10%，培养基初始pH 6.5，培养温度 32 ℃，培养时间为72 h。优化后，辅酶Q10产量达到112.7 mg/L，比优化前增加提高了63.57%。[结论] 按照优化之后的培养条件进行发酵，辅酶Q10的产量得到大幅提高。
关键词 辅酶 Q10；光合细菌；培养条件
中图分类号 S188 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2015）15-001-02
Optimization of Cultivation Condition in Photosynthetic Bacteria that Produced Coenzyme Q10
WANG Xiaoli， XIA Wei， ZHANG Hao et al
（Qingdao Zhongren Animal Pharmaceutical Co.，Ltd.， Qingdao， Shandong 266329）
Abstract [Objective] The research aimed to optimize the cultivation condition of the photosynthetic bacteria.[Method] The single factor method was adopted.[Result] In lab condition， light intensity was 60 W， inoculation was 10%， initial pH of culture medium was 6.5， temperature was 32 ℃， and incubation time was 72 h.Coenzyme Q10 production reached 112.7 mg/L after optimization，and increased by 63.57% compared with preoptimization.[Conclusion] The yield of coenzyme Q10 increased sharply by fermentation according to the optimized cultivation condition.
Key words Coenzyme Q10；Photosynthetic bacteria；Cultivation condition
辅酶 Q10（CoQ10）又称泛醌，是一种存在于自然界的脂溶性醌类化合物，在原核细胞内存在于细胞质膜中，在真核细胞内主要存在于线粒体内，是呼吸链中NADH脱氢酶、琥珀酸脱氢酶和bc复合物之间的重要递氢体[1-2]。辅酶 Q10作为呼吸链组分之一，参与细胞能量物质——三磷酸腺苷的合成，能抑制线粒体的氧化，维护膜结构的完整性，提高机体免疫力，在抗肿瘤、高血压、心脏病及提高免疫系统等方面有重要功能，是临床价值颇高的生化药物[3-5]。
辅酶 Q10的生产方法有4种，分别是动植物组织提取法、化学合成法、植物细胞培养法和微生物发酵法，其中微生物发酵法因具有广泛的来源、相对简单的提取过程、良好的产物活性、相对高的产量等优点而日益受到社会的关注[6]。在众多微生物中，光合细菌菌体中CoQ10的含量相对较高。国外的微生物发酵技术较成熟，通过培养光合细菌提取CoQ10已实现产业化，而国内的微生物发酵技术比较薄弱，生产技术还不成熟，目前主要从动物组织中提取[7]。笔者在培养光照强度、接种量、培养基初始pH、培养温度和培养时间5个方面对光合细菌培养条件进行了优化，为CoQ10相关产品的研发奠定良好的基础。
1 材料与方法
1.1 菌种 供试光合细菌菌种由青岛中仁动物药品有限公司提供。
1.2 培养基 种子培养基组成为：葡萄糖 20.5 g/L、蛋白胨 2.0 g/L、氯化钠10.0 g/L、硫酸铵3.5 g/L、醋酸钠6.5 g/L、硫酸镁8.5 g /L、硫代硫酸钠4.8 g/L、硫酸亚铁1.5 g/L、磷酸氫二钾2.8 g/L、磷酸二氢钾3.5 g/L，pH 7.0，121 ℃ 灭菌 30 min。
1.3 液体培养条件
向250 ml三角瓶中加入100 ml培养基，按2%（V∶V）的初始接种量将种子液接入培养基中，培养温度为 30 ℃，60 W白炽灯充当光源，150 r/min 振荡培养 48 h，辅酶Q10的产量达 68.9 mg/L。
1.4 辅酶 Q10的提取和测定
量取5 ml发酵液，在转速为5 000 r/min 条件下离心 10 min，弃上清，用蒸馏水洗涤1 次，再于转速为5 000 r/min条件下离心10 min，弃上清，加入0.5 ml浓度30% H2O2和2 ml丙酮，用无水乙醇定容至 10 ml，35 ℃下超声 50.0 min，用孔径为0.22 μm 有机过滤器过滤，即可获得辅酶 Q10样品。通过高效液相色谱仪进行测定，检测波长 275 nm，BEH C181.7 μm 色谱柱（2.1 mm×50.0 mm） ，流动相V（甲醇）∶V（乙醇） 1∶4，柱温 35℃，流速0.4 ml/min[8-10]。
1.5 辅酶 Q10培养条件的优化
1.5.1 不同光照强度对辅酶 Q10合成的影响。
在光合细菌培养过程中，分别以15、40、60、100和200 W的白炽灯充当光源对其进行照射，考察辅酶 Q10产量受光照强度的影响。
1.5.2 不同接种量对辅酶 Q10合成的影响。在光合细菌接种时，其接种量分别为2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%（V∶V），考察辅酶 Q10产量受接种量的影响。 1.5.3 不同初始 pH 对辅酶 Q10合成的影响。
在光合细菌培养基配制后，分别将其初始 pH 调至 5.5、6.0、6.5、7.0、75，8.0，考察辅酶 Q10产量受初始 pH 的影响。
1.5.4 不同培养温度对辅酶 Q10合成的影响。
在光合细菌培养过程中，分别将其置于 26、28、30、32、34、36 ℃振荡培养箱中，考察辅酶 Q10产量受培养温度的影响。
1.5.5 不同培养时间对辅酶 Q10合成的影响。
在光合细菌培养过程中，分别在24、48、72、96、120 h不同的发酵时间，取发酵液进行检测，考察辅酶 Q10产量受培养时间的影响。
2 结果与分析
2.1 培养条件的优化
2.1.1 光照强度对辅酶 Q10合成的影响。
由图1可知，当以60 W白炽灯充当光源时，辅酶 Q10产量最高，达到68.9 mg/L。随着光照强度的增强，辅酶 Q10产量下降。原因可能是当光源为60 W白炽灯时，此条件下光的波长易被光合细菌吸收。所以，选择60 W白炽灯为培养光源。
2.1.2 接种量对辅酶 Q10合成的影响。由图2可知，当接种量为10%时，辅酶 Q10产量最高，达到 86.3 mg/L。过低的接种量（如2%）导致菌体生长缓慢，辅酶 Q10合成量偏低；而当接种量高于10%时，光合细菌虽然繁殖迅速，但有限的营养成分抑制菌体生长，辅酶 Q10的合成也随之降低。
2.1.3 初始 pH对辅酶 Q10合成的影响。
由图3可知，当 pH 值为6.5时，辅酶 Q10的合成量最高，达到 108.4 mg/L，偏低或偏高的pH均会影响辅酶 Q10的合成。这可能是由于培养基初始 pH会影响光合细菌的细胞状态，进而影响菌体对培养基的利用率，影响辅酶 Q10的合成。
2.1.4 培养温度对辅酶 Q10产量的影响。
由图4可知，在 32 ℃，辅酶Q10的产量达到最大值（109.0 mg/L），因此发酵生产的最适温度为32 ℃。过低或过高的培养温度都不利于辅酶 Q10的合成。
2.1.5 培养时间对辅酶 Q10产量的影响。由图5可知，在24～72 h，辅酶 Q10累积量迅速升高，达到112.7 mg/L；在72～120 h，辅酶 Q10的累积量仍然不断升高，但速度非常缓慢。所以，光合细菌的最佳培养时间为72 h。
2.2 中试发酵罐试验对比
向5 L中试发酵罐中加入3.5 L培养基，按优化之前的培养条件培养，辅酶Q10产量为66.4 mg/L；按优化之后的培养条件培养，即初始培养基pH调为6.5，60 W白炽灯充当光源，10%（V∶V）的初始接种量，培养温度为 32 ℃，培养 72 h，提取辅酶Q10，并进行检测，其产量为100.9 mg/L，比优化之前提高52.0%。由5 L中试发酵罐扩大到生产大罐进行发酵，还需要根据具体的生产情况对发酵工艺进行调整。
3 结论
光合细菌在自然界中普遍存在，是地球上出现最早且具有原始光能合成体系的原核生物。光合细菌富含辅酶Q10。辅酶Q10是人类生命不可缺少的重要元素之一，具有增强抗氧化、延缓衰老、增强心肌功能、改善细胞内呼吸等多种生理功能，能够促进动物的生长，提高免疫力[11]。光合细菌的培养条件是影响辅酶 Q10生产的关键因素[12]。研究表明，在实验室条件下，当光照强度为60 W，接种量为10%，培养基初始pH为6.5，培养温度为32 ℃，培养时间为72 h时，辅酶Q10产量由优化前的68.9 mg/L达到112.7 mg/L，增长了6357%。5 L中试发酵罐的试验结果显示，按照优化之后的培养条件进行发酵，辅酶Q10产量比优化之前提高了52.0%。
参考文献
[1]
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[5] 何兆雄.动物生化制药基础[M].北京：中国商业出版社，1985：299-308.
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[8] YOSHIDA H，KOTANI Y，OCHIAI K，et al.Production of ubiquinone10 using bacteria [J]. Journal of General and Applied Microbiology，1998，44（1）：19-26.
[9] NOHL H，STANIEDK K，GILLE L，et al.The multiple functions of Coenzyme Q [J]. Bioorganic Chemistry，2001，29（1）：1-13.
[10] 佘晓雷，王根华.辅酶Q10的纯化和鉴定方法研究[J].食品研究与开发，2004，4（9）：129-130.
[11] FORKERS K.Biomedical and clinical aspects of coenzyme Q[M].Amsterdam：Elsevier/NorthHolland Press，1977：316.
[12] FLORKIN M M，STOTZ E H.In comprensive biochemistry[M].Amsterdam：Elesiver，1996.