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摘要：胚胎干细胞是具有无限增殖和全能分化潜力的全能干细胞。其特性为临床疾病的治疗提供了新思路，成为近年来生物医学领域研究的热点。本文从临床应用、诱导分化、细胞培养、细胞检测等方面对近几年胚胎干细胞的相关研究进行了综述。
关键词：胚胎干细胞；研究进展；干细胞应用；干细胞诱导分化；干细胞培养
*作者简介：张伟，女，1981年7月1日生，籍贯：山东菏泽，博士研究生，副教授，研究方向：基因工程与组织工程
【中图分类号】R-052【文献标识码】A【文章编号】1672-8602（2014）06-0112-01
1胚胎干细胞的概念
胚胎干细胞（embryonicstemcell，ESCs，简称ES或EK细胞。）胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团和原始生殖细胞中分离出来的全能干细胞，具有无限增殖和全能分化的潜力。
2胚胎干细胞的应用
无论在体外还是体内环境中，只要具备相应的诱导条件，ES细胞可分化为几乎所有类型的机体细胞。另外，在组织再生工程中，ES细胞的特性为临床疾病的治疗提供了一个全新的思路，应用价值巨大。这些都使胚胎干细胞成为生物医学领域近年来的研究热点[1]。
首先，在妇产生殖医学得到更广泛的应用。刘黎青等[2]研究发现，在体外环境下，通过对内、外源因素的调整，ES细胞可被诱导分化为精子和卵母细胞，这个模型可以用来进行哺乳动物的早期胚胎发育方面的研究；但小鼠胚胎干细胞注射入成年鼠皮下可形成畸胎瘤。
在多囊卵巢综合征（polycysticovariansyndrome，PCOS）的治疗方面的研究。李朋粉等[3]收集PCOS患者体外受精-胚胎移植周期中废弃的新鲜或冷冻胚胎，序贯培养至囊胚，机械分离内细胞团，接种于混合饲养层（小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞之比为1：1），传代培养，并对稳定传代的人胚胎干细胞（humanembryonicstemcells，hESCs）进行形态学观察、碱性磷酸酶染色、阶段特异性胚胎抗原-4、转录因子OCT-4的表达、核型分析、体内、外分化潜能鉴定。结果显示：①新鲜废胚59枚，培养后获得14枚囊胚，分离11个内细胞团，贴壁、传代后建立5株hESCs系，均具备hESC特性。②冷冻胚胎19枚，培养后获得6枚囊胚，分离5个内细胞团，形成5个原代克隆，已传至3～4代。这表明废弃的新鲜及冷冻胚胎均可作为hESCs建系的材料来源，为研究PCOS发病机理、筛选候选基因、基因定位及基因治疗等提供良好的生物学模型。
此外，还有对向成骨细胞分化的研究。骨移植是临床上用来修复骨缺损的重要手段，移植过程分为三个阶段：移植物的血管化、骨再生、骨端融合。其中移植物血管化的效果影响整个移植过程，决定了移植的成败，是三个阶段中最关键的环节。有研究将成骨细胞与血管内皮细胞联合培养，即促进成骨过程，又能促进血管形成。该结果对骨移植修复骨缺损有重要启示意义。
3胚胎干细胞分化的影响因素
刘黎青等[2]将影响胚胎干细胞体外分化的因素分为两类：一是内源性因素，主要是Oct-4，它是POU转录因子家族的一员，被认为是胚胎干细胞的标记物。二是外源性因素，包括①细胞间的相互作用，主要有对其有分化抑制，分化诱导等作用；②细胞外物质的介导作用，转化生长因子（TCF-21）、激活素IA（ACF-IA）对内胚层和外胚层的细胞分化产生抑制作用，但是对中胚层的细胞不起作用，维甲酸碱性成纤维细胞生长因子成骨蛋白（BMP24）和表皮生长因子可诱导分化内胚层和中胚层的细胞，神经生长因子和肝细胞生长因子可促使三个胚层细胞的发育。
苏肖英等研究了不同生长因子对神经干细胞（neuralstemcells，NSCs）定向分化的影响。他们以无血清培养法从孕小鼠（E13～14d）的大脑皮质分离培养获得NSCs后，分别加入50μg/L表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰岛素生长因子（IGF-1）、神经生长因子（NGF）和血小板衍生生长因子（PDGF）处理，分析他们对NSCs分化的影响。结果显示：几种生长因子均能促进NSCs分化，其中NGF诱导NSCs向神经元方向作用最强；而IGF-1、NGF和PDGF促进NSCs向星形胶质细胞分化的作用均较强。
4胚胎干细胞移植后的检测
胚胎干细胞移植后有很多检测途径，关云谦等[9]比较了小鼠胚胎干细胞移植入大鼠脑内后绿色荧光蛋白（GFP）质粒和Thy-1抗体在指示细胞及细胞分化方面的特点。结果显示：GFP质粒标记胚胎干细胞后移植可以较好地显示移植细胞，但不能观察细胞分化；而Thy-1抗体不仅在显示移植细胞上有较好的效果，还可以准确地标记分化细胞。而Thy-1对小鼠胚胎干细胞分化成为神经元和胶质细胞可以特异性地显示，但其对于分化成为神经细胞前的各个细胞阶段均不能有效示踪。
5胚胎干细胞的培养
细胞微环境是人胚胎干细胞自我更新及细胞命运的决定至关重要的影响因素。细胞外基质是细胞微环境的重要组成部分，人胚胎干细胞要想维持其未分化状态及全能性需要有适当的胞外基质。有研究显示，如果以Matrigel和层粘连蛋白作为胞外基质，人胚胎干细胞可在无血清无饲养层培养体系中、在保持其未分化状态下实现增殖（>20代）；如果将胞外基质换成纤粘连蛋白和Ⅳ型胶原，则不能支持其在无血清无饲养层培养体系的生长，且培养过程中细胞贴壁能力差，分化率高。
6.目前胚胎干细胞面临的问题
胚胎干细胞的相关研究成果使人欣喜，前景令人向往。但尚有不少难题有待解决：①胚胎干细胞治疗的安全隐患：动物实验中，小鼠胚胎干细胞注射入成年鼠皮下可形成畸胎瘤。②从实验成果到临床应用的转化：目前原始生殖细胞和配子的体外培养已经成功，但要将实验成果应用于临床，尚需进一步明确体外培养生殖细胞的特性和功能，并确定其有效性和安全性。
参考文献
[1]张荣环，赵菊，杨华强.干细胞临床研究现状及展望现代中西医结合杂志.2013，22（29）：3300-4.
[2]刘黎青，李娟，周盛年.胚胎干细胞及在生殖医学中的应用.中国组织工程研究与临床康复.2001，15（1）：113-5.
[3]李朋粉，孙莹璞，王芳，等.多囊卵巢综合征源性人胚胎干细胞系的建立.生殖与避孕.2011，31（5）：299-304.
关键词：胚胎干细胞；研究进展；干细胞应用；干细胞诱导分化；干细胞培养
*作者简介：张伟，女，1981年7月1日生，籍贯：山东菏泽，博士研究生，副教授，研究方向：基因工程与组织工程
【中图分类号】R-052【文献标识码】A【文章编号】1672-8602（2014）06-0112-01
1胚胎干细胞的概念
胚胎干细胞（embryonicstemcell，ESCs，简称ES或EK细胞。）胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团和原始生殖细胞中分离出来的全能干细胞，具有无限增殖和全能分化的潜力。
2胚胎干细胞的应用
无论在体外还是体内环境中，只要具备相应的诱导条件，ES细胞可分化为几乎所有类型的机体细胞。另外，在组织再生工程中，ES细胞的特性为临床疾病的治疗提供了一个全新的思路，应用价值巨大。这些都使胚胎干细胞成为生物医学领域近年来的研究热点[1]。
首先，在妇产生殖医学得到更广泛的应用。刘黎青等[2]研究发现，在体外环境下，通过对内、外源因素的调整，ES细胞可被诱导分化为精子和卵母细胞，这个模型可以用来进行哺乳动物的早期胚胎发育方面的研究；但小鼠胚胎干细胞注射入成年鼠皮下可形成畸胎瘤。
在多囊卵巢综合征（polycysticovariansyndrome，PCOS）的治疗方面的研究。李朋粉等[3]收集PCOS患者体外受精-胚胎移植周期中废弃的新鲜或冷冻胚胎，序贯培养至囊胚，机械分离内细胞团，接种于混合饲养层（小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞之比为1：1），传代培养，并对稳定传代的人胚胎干细胞（humanembryonicstemcells，hESCs）进行形态学观察、碱性磷酸酶染色、阶段特异性胚胎抗原-4、转录因子OCT-4的表达、核型分析、体内、外分化潜能鉴定。结果显示：①新鲜废胚59枚，培养后获得14枚囊胚，分离11个内细胞团，贴壁、传代后建立5株hESCs系，均具备hESC特性。②冷冻胚胎19枚，培养后获得6枚囊胚，分离5个内细胞团，形成5个原代克隆，已传至3～4代。这表明废弃的新鲜及冷冻胚胎均可作为hESCs建系的材料来源，为研究PCOS发病机理、筛选候选基因、基因定位及基因治疗等提供良好的生物学模型。
此外，还有对向成骨细胞分化的研究。骨移植是临床上用来修复骨缺损的重要手段，移植过程分为三个阶段：移植物的血管化、骨再生、骨端融合。其中移植物血管化的效果影响整个移植过程，决定了移植的成败，是三个阶段中最关键的环节。有研究将成骨细胞与血管内皮细胞联合培养，即促进成骨过程，又能促进血管形成。该结果对骨移植修复骨缺损有重要启示意义。
3胚胎干细胞分化的影响因素
刘黎青等[2]将影响胚胎干细胞体外分化的因素分为两类：一是内源性因素，主要是Oct-4，它是POU转录因子家族的一员，被认为是胚胎干细胞的标记物。二是外源性因素，包括①细胞间的相互作用，主要有对其有分化抑制，分化诱导等作用；②细胞外物质的介导作用，转化生长因子（TCF-21）、激活素IA（ACF-IA）对内胚层和外胚层的细胞分化产生抑制作用，但是对中胚层的细胞不起作用，维甲酸碱性成纤维细胞生长因子成骨蛋白（BMP24）和表皮生长因子可诱导分化内胚层和中胚层的细胞，神经生长因子和肝细胞生长因子可促使三个胚层细胞的发育。
苏肖英等研究了不同生长因子对神经干细胞（neuralstemcells，NSCs）定向分化的影响。他们以无血清培养法从孕小鼠（E13～14d）的大脑皮质分离培养获得NSCs后，分别加入50μg/L表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰岛素生长因子（IGF-1）、神经生长因子（NGF）和血小板衍生生长因子（PDGF）处理，分析他们对NSCs分化的影响。结果显示：几种生长因子均能促进NSCs分化，其中NGF诱导NSCs向神经元方向作用最强；而IGF-1、NGF和PDGF促进NSCs向星形胶质细胞分化的作用均较强。
4胚胎干细胞移植后的检测
胚胎干细胞移植后有很多检测途径，关云谦等[9]比较了小鼠胚胎干细胞移植入大鼠脑内后绿色荧光蛋白（GFP）质粒和Thy-1抗体在指示细胞及细胞分化方面的特点。结果显示：GFP质粒标记胚胎干细胞后移植可以较好地显示移植细胞，但不能观察细胞分化；而Thy-1抗体不仅在显示移植细胞上有较好的效果，还可以准确地标记分化细胞。而Thy-1对小鼠胚胎干细胞分化成为神经元和胶质细胞可以特异性地显示，但其对于分化成为神经细胞前的各个细胞阶段均不能有效示踪。
5胚胎干细胞的培养
细胞微环境是人胚胎干细胞自我更新及细胞命运的决定至关重要的影响因素。细胞外基质是细胞微环境的重要组成部分，人胚胎干细胞要想维持其未分化状态及全能性需要有适当的胞外基质。有研究显示，如果以Matrigel和层粘连蛋白作为胞外基质，人胚胎干细胞可在无血清无饲养层培养体系中、在保持其未分化状态下实现增殖（>20代）；如果将胞外基质换成纤粘连蛋白和Ⅳ型胶原，则不能支持其在无血清无饲养层培养体系的生长，且培养过程中细胞贴壁能力差，分化率高。
6.目前胚胎干细胞面临的问题
胚胎干细胞的相关研究成果使人欣喜，前景令人向往。但尚有不少难题有待解决：①胚胎干细胞治疗的安全隐患：动物实验中，小鼠胚胎干细胞注射入成年鼠皮下可形成畸胎瘤。②从实验成果到临床应用的转化：目前原始生殖细胞和配子的体外培养已经成功，但要将实验成果应用于临床，尚需进一步明确体外培养生殖细胞的特性和功能，并确定其有效性和安全性。
参考文献
[1]张荣环，赵菊，杨华强.干细胞临床研究现状及展望现代中西医结合杂志.2013，22（29）：3300-4.
[2]刘黎青，李娟，周盛年.胚胎干细胞及在生殖医学中的应用.中国组织工程研究与临床康复.2001，15（1）：113-5.
[3]李朋粉，孙莹璞，王芳，等.多囊卵巢综合征源性人胚胎干细胞系的建立.生殖与避孕.2011，31（5）：299-304.