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摘要：现阶段，食品安全问题受到各界高度重视，在食品安全问题中，蛔虫卵问题是主要问题之一。目前，对于食品内蛔虫卵的相关检测技术相对较为薄弱，如何在检测方法上取得创新突破对确保食品安全十分重要，且可使风险系数有效降低。基于此，本文剖析与探讨了如何利用PCR方法检测食品内蛔虫卵，为下一步工作的开展提供依据。
关键词：PCR;方法检测;食品;蛔虫卵
前言：当前我国食品安全面临诸多严重问题，如何消除食品内的寄生虫以提升食品安全和质量一直备受诸多学者和公众的关注。然而，现阶段我国关于如何利用PCR方法检测食品内蛔虫卵的研究相对较少，基于此现状，必须采用有效的PCR检测技术，了解掌握蛔虫卵具体特征、检测材料及检测方法等，确保实现对食品内蛔虫卵的精确检测，进而对食品质量问题进行有效控制。
1食品内蛔虫卵对身体的危害性
随着人们生活水平的不断提升，饮食也逐渐多元化，人们对食品卫生安全的重视日益提高。但部分食品中依然存在蛔虫卵，对人体身体健康影响颇大。蛔虫卵会在人体内部孵化，最终形成蛔虫。则会引发肠炎及肠痉挛。甚至还会导致肠梗阻的情况发生，一旦严重，则只能通过手术方式治疗，对患者的生活、工作和学习都会造成严重影响。
2 PCR检测方法概述
PCR检测方法最早起源于美国，由CETUS公司所发明[1-2]。可对一定微量标本的DNA片段进行百万倍扩增。其优势如下：第一、该检测方法敏感度较高;第二、该技术具有特异性强特征;第三、重复性较好与产率偏高也是主要特点[3]。同时检测方便、速度快。该技术目前已在微生物学和法医学等多个领域都有着广泛的应用。
3 PCR方法檢测蛔虫卵的具体步骤
3.1检测材料与试剂
检测材料主要以家禽蛔虫卵、牲畜蛔虫卵、人类蛔虫卵等为主。还包括旋毛虫、囊尾蚴、鞭虫、旋毛虫、囊尾蚴、钩虫、弓形虫、毛圆线虫等。具体检测试剂则包括蛋白酶K、且10@PCR的缓冲液（Mg3+）;dNTPc、EXTaqDNA相关聚合酶;DNA可抽取：l10mmol/LEDTA，220mmol/LNaC，30mmol/LTris-HCl（pH610），6g/LSDD。
3.2检测方法和步骤
3.2.1提取蛔虫DNA
在可能含有蛔虫卵的样品的PCR反应管中，加入4μL DNA抽提缓冲液和1μL蛋白酶K，将反应物充分混匀后，在55℃下进行消化处理3h，随后升温至90℃，再进行20min的消化处理，并加入0.4μL的吐温20溶液充分混匀，经紫外分光光度计检测浓度后，在低温条件下储藏待用。
3.2.2引物的设计与合成
蛔虫核糖体DNA在19S与29S二者中间的内转录间隔区域，即ITS2基因，在不同种间当中存在着明显的序列差异性。据此，设计一对特异性PCR引物，并将筛选出来的引物进行BLAST比较，以检测其特异性，最终引物则为特异性最好的引物。
3.2.3建立PCR反应条件和反应体系
反应体系，即60μL：10×PCR溶剂液（Mg1+）6μL;该引物主要对（10pmol/L）dNTP（2.5mmol/L）4μL模板DNA，即分别为1LL、dNTP（200mmol/L）6LL，该样板DNA2LL，要采取双蒸馏水进行定容，即到60μL。反应条件为：88℃下预变性为6min左右，预变性环节结束后，马上将反应体系放置于冰上，随后添加EXTaqDNA聚合酶，即6U/μL，2μL，同时以50μL的石蜡油进行遮盖，94℃条件下下变性30s，60℃条件下退火为30s，随后在72℃状态下延伸5min，按照该标准循环40次，最终定在72℃状态下延展6min，并在4℃状态下进行存储。待完成扩增工作后，再进行电泳实验。
3.2.4特异性试验
本环节进行特异性测试，主要包括：禽类蛔虫卵、牲畜蛔虫卵、人蛔虫卵等。测试方法主要采用蛔虫特异性引物，必须将测试反应条件进行统一化，在相同条件下开展PCR扩增，目的在于测试是否存在交叉反应等情况。
3.2.5灵敏性试验
最终进行灵敏性测验，利用显微镜进行精度观察，对人蛔虫、牲畜类蛔虫与相关虫卵进行计数，同时进行DNA分别获取，并采用PCR检测。
3.3实验结果与讨论
3.3.1 PCR检测结果
在PCR扩增完成后，对禽类蛔虫卵、牲畜蛔虫卵和人蛔虫卵的PCR产物分别进行15g/L的琼脂糖凝胶电泳检测，通过检测可发现，在980、1050和1070bp处，均发现清晰的条带，这证明引物的特异性较好，且PCR扩增条件符合要求。
3.3.2特异性检测
通过本次实验所建立的PCR方法，能够有效检测出禽类蛔虫卵、牲畜蛔虫卵、人蛔虫卵的DNA，而旋毛虫、囊尾蚴、鞭虫、旋毛虫、囊尾蚴、钩虫、弓形虫、毛圆线虫等的DNA以及蒸馏水的空白对照组均未出现特异性扩增现象，这说明，本次实验所建立的PCR方法对食品内蛔虫卵的检测具有特异性，该方法可用于后续的检测工作。
3.3.3灵敏度检测结果
显微镜下计数人蛔虫卵和猪蛔虫卵，抽提DNA，以特异性引物进行PCR检测灵敏度试验。结果表明，只要存在一个人蛔虫卵DNA即可扩增出特异性条带，表明用本方法灵敏度较高。
3.4对试验结果的讨论
为克服传统的病原学检测的方法的不足，在本次实验中，建立了一种新的检测方法，主要根据蛔虫核糖体DNA上介于19S和29S之间的内转录间隔区ITS1基因在不同种间的序列差异，通过设计特异性强的引物，直接检测蛔虫的基因，该方法有着更高的可靠性和准确度。
结束语：综上所述，通过对关于如何利用PCR方法检测食品内蛔虫卵进行分析，并结合实际情况及发展需求，对食品内蛔虫卵利用PCR检测方法的可行性进行提出。从未来我国食品安全角度出发，对PCR检测方法的进一步应用进行剖析，为下一步工作开展奠定坚实基础。
参考文献
[1]古丽米娜.实时荧光定量PCR在食品致病菌检测中的应用[J].临床检验杂志（电子版），2020（002）：246.
[2]许银叶，苏少霖，许佩勤，等.实时荧光PCR法测定婴幼儿辅助食品中过敏原鱼类成分[J].食品安全质量检测学报，2020，11（08）：141-145.
[3]冀国强，李颖，张爽，等.一起产气荚膜梭菌食物中毒事件的实验室检测分析[J].疾病监测，2020，35（6）：547-551.
（商南县疾病预防控制中心 陕西商洛 726300）
关键词：PCR;方法检测;食品;蛔虫卵
前言：当前我国食品安全面临诸多严重问题，如何消除食品内的寄生虫以提升食品安全和质量一直备受诸多学者和公众的关注。然而，现阶段我国关于如何利用PCR方法检测食品内蛔虫卵的研究相对较少，基于此现状，必须采用有效的PCR检测技术，了解掌握蛔虫卵具体特征、检测材料及检测方法等，确保实现对食品内蛔虫卵的精确检测，进而对食品质量问题进行有效控制。
1食品内蛔虫卵对身体的危害性
随着人们生活水平的不断提升，饮食也逐渐多元化，人们对食品卫生安全的重视日益提高。但部分食品中依然存在蛔虫卵，对人体身体健康影响颇大。蛔虫卵会在人体内部孵化，最终形成蛔虫。则会引发肠炎及肠痉挛。甚至还会导致肠梗阻的情况发生，一旦严重，则只能通过手术方式治疗，对患者的生活、工作和学习都会造成严重影响。
2 PCR检测方法概述
PCR检测方法最早起源于美国，由CETUS公司所发明[1-2]。可对一定微量标本的DNA片段进行百万倍扩增。其优势如下：第一、该检测方法敏感度较高;第二、该技术具有特异性强特征;第三、重复性较好与产率偏高也是主要特点[3]。同时检测方便、速度快。该技术目前已在微生物学和法医学等多个领域都有着广泛的应用。
3 PCR方法檢测蛔虫卵的具体步骤
3.1检测材料与试剂
检测材料主要以家禽蛔虫卵、牲畜蛔虫卵、人类蛔虫卵等为主。还包括旋毛虫、囊尾蚴、鞭虫、旋毛虫、囊尾蚴、钩虫、弓形虫、毛圆线虫等。具体检测试剂则包括蛋白酶K、且10@PCR的缓冲液（Mg3+）;dNTPc、EXTaqDNA相关聚合酶;DNA可抽取：l10mmol/LEDTA，220mmol/LNaC，30mmol/LTris-HCl（pH610），6g/LSDD。
3.2检测方法和步骤
3.2.1提取蛔虫DNA
在可能含有蛔虫卵的样品的PCR反应管中，加入4μL DNA抽提缓冲液和1μL蛋白酶K，将反应物充分混匀后，在55℃下进行消化处理3h，随后升温至90℃，再进行20min的消化处理，并加入0.4μL的吐温20溶液充分混匀，经紫外分光光度计检测浓度后，在低温条件下储藏待用。
3.2.2引物的设计与合成
蛔虫核糖体DNA在19S与29S二者中间的内转录间隔区域，即ITS2基因，在不同种间当中存在着明显的序列差异性。据此，设计一对特异性PCR引物，并将筛选出来的引物进行BLAST比较，以检测其特异性，最终引物则为特异性最好的引物。
3.2.3建立PCR反应条件和反应体系
反应体系，即60μL：10×PCR溶剂液（Mg1+）6μL;该引物主要对（10pmol/L）dNTP（2.5mmol/L）4μL模板DNA，即分别为1LL、dNTP（200mmol/L）6LL，该样板DNA2LL，要采取双蒸馏水进行定容，即到60μL。反应条件为：88℃下预变性为6min左右，预变性环节结束后，马上将反应体系放置于冰上，随后添加EXTaqDNA聚合酶，即6U/μL，2μL，同时以50μL的石蜡油进行遮盖，94℃条件下下变性30s，60℃条件下退火为30s，随后在72℃状态下延伸5min，按照该标准循环40次，最终定在72℃状态下延展6min，并在4℃状态下进行存储。待完成扩增工作后，再进行电泳实验。
3.2.4特异性试验
本环节进行特异性测试，主要包括：禽类蛔虫卵、牲畜蛔虫卵、人蛔虫卵等。测试方法主要采用蛔虫特异性引物，必须将测试反应条件进行统一化，在相同条件下开展PCR扩增，目的在于测试是否存在交叉反应等情况。
3.2.5灵敏性试验
最终进行灵敏性测验，利用显微镜进行精度观察，对人蛔虫、牲畜类蛔虫与相关虫卵进行计数，同时进行DNA分别获取，并采用PCR检测。
3.3实验结果与讨论
3.3.1 PCR检测结果
在PCR扩增完成后，对禽类蛔虫卵、牲畜蛔虫卵和人蛔虫卵的PCR产物分别进行15g/L的琼脂糖凝胶电泳检测，通过检测可发现，在980、1050和1070bp处，均发现清晰的条带，这证明引物的特异性较好，且PCR扩增条件符合要求。
3.3.2特异性检测
通过本次实验所建立的PCR方法，能够有效检测出禽类蛔虫卵、牲畜蛔虫卵、人蛔虫卵的DNA，而旋毛虫、囊尾蚴、鞭虫、旋毛虫、囊尾蚴、钩虫、弓形虫、毛圆线虫等的DNA以及蒸馏水的空白对照组均未出现特异性扩增现象，这说明，本次实验所建立的PCR方法对食品内蛔虫卵的检测具有特异性，该方法可用于后续的检测工作。
3.3.3灵敏度检测结果
显微镜下计数人蛔虫卵和猪蛔虫卵，抽提DNA，以特异性引物进行PCR检测灵敏度试验。结果表明，只要存在一个人蛔虫卵DNA即可扩增出特异性条带，表明用本方法灵敏度较高。
3.4对试验结果的讨论
为克服传统的病原学检测的方法的不足，在本次实验中，建立了一种新的检测方法，主要根据蛔虫核糖体DNA上介于19S和29S之间的内转录间隔区ITS1基因在不同种间的序列差异，通过设计特异性强的引物，直接检测蛔虫的基因，该方法有着更高的可靠性和准确度。
结束语：综上所述，通过对关于如何利用PCR方法检测食品内蛔虫卵进行分析，并结合实际情况及发展需求，对食品内蛔虫卵利用PCR检测方法的可行性进行提出。从未来我国食品安全角度出发，对PCR检测方法的进一步应用进行剖析，为下一步工作开展奠定坚实基础。
参考文献
[1]古丽米娜.实时荧光定量PCR在食品致病菌检测中的应用[J].临床检验杂志（电子版），2020（002）：246.
[2]许银叶，苏少霖，许佩勤，等.实时荧光PCR法测定婴幼儿辅助食品中过敏原鱼类成分[J].食品安全质量检测学报，2020，11（08）：141-145.
[3]冀国强，李颖，张爽，等.一起产气荚膜梭菌食物中毒事件的实验室检测分析[J].疾病监测，2020，35（6）：547-551.
（商南县疾病预防控制中心 陕西商洛 726300）