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目的:乳腺癌是目前公认的严重危害女性健康的恶性肿瘤,易导致肿瘤患者的死亡。目前针对乳腺癌发生发展的分子机制不详,但是已有大量证据表明细胞内多条信号传导通路的异常激活与肿瘤的发生发展密切相关。其中关系最为密切的信号通路为转化生长因子(Transforming Growth Factor-beta,TGF-β)和表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)介导的信号通路。TGF-β信号通路在乳腺癌发生的早期能够抑制细胞增殖并促进细胞凋亡,但是随着肿瘤恶性程度的增加,TGF-β则表现为促进肿瘤进展和恶化。TGF-β在肿瘤发展过程中的这种双重作用被称为“TGF-β悖论”,但是TGF-β从肿瘤抑制转化为肿瘤促进的机制目前尚不明确。在本次研究中,我们首先分析了乳腺癌组织样本中TGF-β的表达与临床病理学特征及与患者预后的关系,同时分析了TGF-β和EGFR的表达相关性及与患者预后的关系,然后采用一系列分子生物学和细胞生物学实验技术并结合生物信息分析和免疫缺陷小鼠转移模型,探究TGF-β反式激活EGFR信号通路促进乳腺癌细胞侵袭、转移的分子机制。方法:1.采用免疫组化染色的方法分析TGF-β在人乳腺癌组织中的表达水平和病理学特征的相关性,以及TGF-β和EGFR的表达相关性及其与患者预后的关系。2.采用q RT-PCR分析TGF-β刺激乳腺癌细胞不同时间对EGFR、EGF、TGF-α的m RNA表达变化;采用Western blot分析EGFR蛋白水平以及下游信号通路p-EGFR、p-SMAD3、p-ERK的变化趋势。3.采用小RNA干扰技术敲减EGFR的表达或利用厄洛替尼(Erlotinib)抑制EGFR活性,基于Transwell小室迁移、侵袭实验检测EGFR在介导TGF-β诱导的乳腺癌细胞迁移侵袭能力的影响,通过尾静脉注射重症免疫缺陷鼠转移模型研究EGFR在介导TGF-β诱导的乳腺癌细胞转移能力的影响。4.采用生物信息学分析EGFR启动子的上游转录因子结合位点,构建包含不同结合位点的双荧光素酶报告基因载体,分别为p GL3-E1(包含Smad3和Sp1结合位点)、p GL3-E2(只包含Sp1结合位点)、p GL3-E3(只包含Smad3结合位点)。5.染色质免疫共沉淀和双荧光素酶报告基因检测系统验证上游转录因子Smad3和Sp1对EGFR启动子的活性是否有直接的调控作用。6.采用核苷酸定点突变技术构建针对EGFR启动子上Smad3和Sp1结合位点的双荧光素酶报告基因突变载体,分别为p GL3-E1Mut(突变Smad3和Sp1结合位点)、p GL3-E2Mut(只突变Sp1结合位点)和p GL3-E3Mut(只突变Smad3结合位点),然后采用双荧光素酶报告基因系统检测TGF-β诱导的EGFR启动子活性的变化。7.采用si RNA小干扰技术敲减Smad3和(或)Sp1的表达后检测对TGF-β诱导的EGFR启动子活性的变化。8.采用q RT-PCR和Western blot技术检测敲减Sp1表达或抑制其活性后对TGF-β诱导的EGFR m RNA和蛋白表达水平。9.采用q RT-PCR和Western blot技术分析ERK/Sp1信号通路是否参与到TGF-β诱导的EGFR上调过程中。10.采用q RT-PCR和Western blot技术分析敲减Smad3表达或抑制其活性后对TGF-β诱导的EGFR m RNA和蛋白水平的变化以及下游信号通路p-Erk的变化。11.在Smad3敲减的细胞中,抑制Sp1的活性(加入抑制剂MTM)或进一步敲减Sp1的表达,q RT-PCR和Western blot技术检测TGF-β诱导的EGFR的表达变化。12.采用小RNA干扰技术敲减Smad3或Sp1表达后,采用基于Transwell小室迁移侵袭实验检测TGF-β诱导的乳腺癌细胞迁移侵袭能力的变化。结果:1.乳腺癌组织中TGF-β高表达的患者病理分期较晚且预后较差,同时TGF-β和EGFR在人乳腺癌组织中的表达呈正相关,TGF-β和EGFR双阳性表达的患者预后较差。2.乳腺癌细胞系MDA-MB-231和T47D中TGF-β诱导的EGFR的配体m RNA无显著性变化,但是TGF-β诱导的EGFR m RNA水平和蛋白水平均上调并使EGFR、Smad3和Erk的磷酸化水平显著增强。3.敲减EGFR表达或抑制EGFR活性均阻断了TGF-β诱导的乳腺癌细胞迁移侵袭能力的增强,并且敲减EGFR表达明显抑制了TGF-β诱导的乳腺癌细胞的转移能力的增强。4.生物信息分析发现EGFR启动子上存在Smad3和Sp1的结合位点,且针对Smad3和Sp1结合位点的双荧光素酶报告基因载体构建成功。5.TGF-β处理后明显增强了Smad3和Sp1与EGFR启动子的结合能力和荧光素酶活性,且TGF-β诱导EGFR转录激活过程中Sp1的作用强于Smad3。6.突变EGFR启动子上Smad3和Sp1结合位点后明显减弱了TGF-β诱导的EGFR启动子的活性。7.敲减Sp1的表达明显抑制了p GL3-E1和p GL3-E2的双荧光素酶活性但不影响p GL3-E3的双荧光素酶活性。同时敲减Sp1和Smad3的表达后p GL3-E1的荧光素活性明显降低,但p GL3-E2的荧光素活性无明显变化。8.抑制Sp1的表达明显减弱了TGF-β诱导的EGFR mRNA和蛋白水平的上升。9.Erk/Sp1信号通路参与到TGF-β诱导的EGFR的上调过程中。10.在乳腺癌细胞系MDA-MB-231和T47D中,抑制Smad3的表达减弱了TGF-β诱导的EGFR m RNA和蛋白水平的升高,但并不影响p-ERK的表达水平。11.同时敲减Smad3和Sp1后明显抑制了TGF-β诱导的EGFR m RNA和蛋白水平的上升,且Sp1敲减组EGFR的抑制效果明显高于Smad3敲减组。12.敲减Smad3或Sp1后抑制了TGF-β诱导的乳腺癌细胞迁移侵袭能力的增强。结论:在本次研究中,我们证实了TGF-β高表达与较差的临床病理学特征相关,即TGF-β高表达的患者病理分期较晚,且预后较差。同时在乳腺癌肿瘤组织中TGF-β与EGFR表达呈正相关,TGF-β与EGFR双阳性表达的患者出现明显的不良预后;并且发现TGF-β促进乳腺癌细胞迁移、侵袭能力增强的过程中,伴随着EGFR表达的上调。进一步的实验证实了EGFR介导了TGF-β诱导的乳腺癌细胞迁移、侵袭和转移能力的增强。同时我们发现经典的Smad3信号通路和ERK/Sp1信号通路介导了TGF-β诱导的EGFR表达上调。因此,我们的研究初步揭示了TGF-β反式激活EGFR信号通路促进乳腺癌侵袭转移的作用机制。