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摘要：运用基因克隆技术，以分离鉴定获得的蛋白水解酶高活性类芽孢杆菌（Paenibacillus lautus）CHN26菌株的基因组DNA为模板，经克隆鉴定该菌株是一种新型ATP-依赖型ClpP家族蛋白水解酶PlclpP基因，全长585 bp，编码194个氨基酸，分子量约为21 ku。采用大肠杆菌（Eschericia coli）pET表达系统构建PlclpP基因表达质粒pET-28-PlclpP，并在大肠杆菌BL21中实现了重组PlClpP蛋白的表达。利用组氨酸标签（His-tag）亲和纯化法获得 PlClpP 纯化蛋白，发现PlClpP可能与宿主菌未知伴侣分子形成蛋白复合物。PlClpP复合物具有ATP-依赖型酪蛋白水解酶活性，最适反应温度为40 ℃、pH值7.0。表面活性剂强烈抑制PlClpP复合物的酶活性，而常规丝氨酸蛋白酶抑制剂对其活性没有抑制作用。本研究结果为蛋白酶新基因资源的开发、ClpP家族蛋白酶的基础理论和应用研究奠定了基础。
关键词：ClpP家族蛋白水解酶；类芽孢杆菌；基因；克隆；表达；酶学特性
中图分类号： Q789文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0047-04
蛋白水解酶约占全球酶制剂市场的60%，被广泛应用于食品、医药、洗涤剂、农业等领域[1]。微生物是水解酶的主要来源，探索并开发微生物新基因资源，对于解决目前商品化酶制剂种类及来源较少、底物单一、价格昂贵等问题具有重要意义。
ClpP（caseinolytic peptidase）家族ATP-依赖型伴侣分子相连（chaperone-linked）的酪蛋白水解肽酶广泛存在于原核生物及真核生物中[2]，其利用ATP驱动蛋白底物解折叠并转位进入蛋白水解腔（chamber）中降解成小分子肽[3]。1988年，ClpP蛋白酶首次被发现于大肠杆菌（Eschericia coli）中[4]。此后的大量研究表明，大肠杆菌中ClpP蛋白酶（EcClpP）由蛋白水解核心ClpP、依赖ATP的伴侣分子ClpA或ClpX组成，其蛋白水解腔由催化位点序列形成的2个反向同型七聚体环构成[2]。在国外，ClpP蛋白酶已商品化，而目前国内尚无涉及ClpP家族蛋白酶的研究报道。此外，有关类芽孢杆菌属（Paenibacillus spp.）中clpP基因功能的研究国内外均无报道。采用基因克隆技术，以笔者所在实验室分离鉴定获得的蛋白水解酶高活性类芽孢杆菌（P. lautus） CHN26菌株基因组DNA为模板，克隆鉴定了该菌株的一种新型ATP-依赖型ClpP家族蛋白水解酶PlclpP基因，并在大肠杆菌BL21中实现了异源表达。本研究结果为ClpP家族蛋白酶的基础理论和应用研究奠定了基础。
1材料与方法
1.1试验材料
Mini BEST细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、Premix Ex Taq Verision 2.0、T4 DNA ligase均购自宝生物工程（大连）有限公司。限制性核酸内切酶BamHⅠ和HindⅢ 购自Promega（美国）公司，Luria-Bertani（LB）培养基购自北京陆桥技术有限责任公司。卡那霉素、氨苄青霉素、聚丙烯酰胺和N，N′-亚甲双丙烯酰胺等SDS-PAGE试剂、蛋白质定量检测试剂盒均购自生工生物工程（上海）有限公司。蛋白裂解试剂BugBuster Protein Extraction、纯化试剂Ni-NTA His·Bindresin均购自Merck Millipore（德国）公司。β-酪蛋白购自Sigma-Aldrich（美国）公司。
大肠杆菌TOP10、大肠杆菌BL21、基因克隆载体pGM-T（Ampr）均购自天根生物技术有限公司；基因表达载体pET-28a（Kmr）购自Merck Millipore（德国）公司；类芽孢杆菌CHN26由笔者所在实验室分离鉴定并保存。
1.2试验方法
1.2.1分子生物学方法采用Primer 5.0软件（http：//www.premierbiosoft.com/）设计PlclpP基因PCR扩增上、下游引物ClpP-P1f（5′-ATGGAGGATGAAACCATGAA-3′）、ClpP-P1r（5′-TCACAGTTTGGTGACGATGT-3′），以及在5′端分别引入限制性核酸内切酶BamHⅠ、HindⅢ酶切位点（以下划线表示）的上、下游引物ClpP-P2f（5′-CGGGATCCATGGAGGATGA-3′）、ClpP-P2r（5′-CCCAAGCTTCAGTTTGGTGAC-3′）。寡核苷酸引物合成、DNA序列测定由生工生物工程（上海）有限公司完成，基因组和质粒DNA的提取参照试剂盒说明书完成。参考Shi等的方法[5]进行PCR反应、产物纯化、酶切、DNA片段连接与转化、菌落PCR检测等。采用Clustal 2.1软件（www.ebi.ac.uk/Tools/services）进行多序列比对分析。
1.2.2蛋白表达及纯化参考Li等的方法[6]进行PlclpP基因表达质粒的构建、蛋白的诱导表达、组氨酸标签（His-tag）亲和纯化、SDS-PAGE等。
1.2.3蛋白水解酶活性的检测以β-酪蛋白为底物，在150 μL酶反应液[2.7 μg β-casein，5 μL 0.1 mol/L ATP，2 mmol/L ZnCl2，50 mmol/L Tris-HCl（pH值为7.3）]中加入50 μL纯化酶进行反应。将40 ℃、pH值7.0条件下，30 min内水解β酪蛋白使D562 nm值增加0.01的酶量定义为1个酶活性单位（U）[7]。参考Li等的方法[6]测定温度、pH值，表明活性剂（SDS、Tween-20、Tween-80）和蛋白酶抑制剂（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）对PlClpP复合物酶活性的影响。 2结果与分析
2.1蛋白水解酶高活性菌株类芽孢杆菌CHN26的分离鉴定
基于酶功能的筛选方法[6]，笔者所在实验室从东海水产养殖池塘底泥中分离获得1株蛋白水解酶高活性菌株，经16S rRNA基因序列测定（GenBank登录号为KF460030）分析及生理生化鉴定，发现其为厚壁菌门（Firmicutes）芽孢杆菌纲（Bacilli）芽孢杆菌目（Bacillales）类芽孢杆菌科（Paenibacillaceae）类芽孢杆菌属（Paenibacillus）的细菌，命名为类芽孢杆菌CHN26[6]。笔者所在实验室对该菌株的多种蛋白水解酶基因进行了研究，本次报道其中一种酪蛋白水解肽酶clpP基因的克隆和表达。
2.2类芽孢杆菌CHN26的PlclpP基因分子克隆及序列分析
迄今为止，国内外涉及类芽孢杆菌中clpP基因功能的研究尚无文献报道。本研究利用目前GenBank数据库中类芽孢杆菌属Y412MC10菌株的全基因组信息（GenBank登录号为NC_013406.1），基于其clpP基因序列设计了PCR扩增引物clpP-P1f/r。提取类芽孢杆菌CHN26基因组DNA并以其为模板进行PCR扩增，获得约0.6 kb的单一PCR扩增产物。PCR产物经纯化后与克隆载体pGM-T连接，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。筛选并提取Ampr阳性转化子重组质粒，经DNA序列测定发现，克隆所得类芽孢杆菌CHN26的clpP基因全长585 bp，编码194个氨基酸，预测分子量约为 21 ku，将其命名为PlclpP。
BLAST序列比对分析结果显示，PlclpP序列与GenBank数据库中类芽孢杆菌属的ATP-依赖型ClpP蛋白酶水解亚单位氨基酸序列的相似性为71%～98%，而与EcClpP的氨基酸序列相似性仅为62%。然而clpP基因多序列比对分析结果显示，PlclpP基因序列含有S14_ClpP家族的特征性八肽结构域（KDIHMYIN，第59个至第66个氨基酸）（图1），其中第59个的赖氨酸（Lys58，K）、第60个的天冬氨酸（Asp59，D）、第64个的催化亲核物质（catalytic nucleophile）酪氨酸（Tyr63，Y）为高度保守的催化三分体残基（catalytic triad residues），在酪蛋白水解中发挥重要作用[8]。此外，PlclpP序列还含有丝氨酸蛋白水解酶高度保守的催化活性位点（Ser99-His124-Asp173）（图1）。
2.3PlclpP基因表达质粒pET-28a-PlclpP的构建与鉴定
基于本研究获得的PlclpP基因序列，设计了携带限制性核酸内切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的引物clpP-P2f/r，采用PCR方法扩增PlclpP基因，获得单一PCR产物。采用BamHⅠ和HindⅢ双酶切PCR产物，回收纯化酶切产物。同时，提取表达载体pET-28a的质粒DNA，经BamHⅠ和HindⅢ 双酶切为线性的DNA片段，酶切产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果见图2。
将上述纯化后的酶切片段经T4-DNA连接酶连接后，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，在含有30 μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，采用菌落PCR方法筛选获得阳性转化子克隆（图2）。提取阳性转化子重组质粒DNA，经BamHⅠ和 HindⅢ 双酶切验证为单一DNA片段插入，大小约0.6 kb（图2）。经DNA序列测定，验证插入片段为PlclpP基因。
2.4PlclpP基因的表达和纯化
采用LB液体培养基（含30 μg/mL卡那霉素）于20 ℃培养含有重组表达质粒的大肠杆菌BL21（pET-28a-PlclpP），通过0.6 mmol/L IPTG诱导表达18 h，获得含有组氨酸标签的重组PlClpP蛋白，分子量约为21ku，与预测的ClpP蛋白分子量大小相一致，SDS-PAGE分析结果见图3。利用Ni-NTA-His·Bind resin纯化法纯化大肠杆菌BL21菌体裂解后的无细胞提取液，经SDS-PAGE分析洗脱液各组分，获得了纯化的目标蛋白PlClpP。在大肠杆菌BL21中异源表达的PlClpP蛋白在SDS-PAGE图谱上呈现2个条带，分子量分别约为21、25 ku（图3）。鉴于大肠杆菌EcClpP蛋白酶伴侣分子ClpA、ClpX的分子量分别为80、46 ku[9-10]，推测PlClpP可能与大肠杆菌BL21中未知伴侣分子形成复合物，未知伴侣分子的序列和功能有待进一步研究。采用BCA蛋白定量试剂盒检测PlClpP的表达量，结果显示，1 g细胞湿质量可以产生纯化的重组PlClpP蛋白复合物约0.54 mg，约占细胞总蛋白的 5.25%。
2.5PlClpP复合物的蛋白水解酶活
本研究以非折叠态模式底物β-酪蛋白为底物，在含有2.5 mmol/L ATP的反应液中分析纯化PlClpP复合物在不同温度下的蛋白水解酶活性，PlClpP复合物的最适反应温度为 40 ℃（图4），明显高于类芽孢杆菌CHN26和大肠杆菌BL21的最适生长温度37 ℃。同时分析了该复合物在不同温度下的稳定性，结果显示，PlClpP复合物在10～40℃下处理3h后相对酶活性仍高于90%，进一步证明了PlClpP复合物的嗜中温反应特性（图4）。此外还分析了pH值对PlClpP复合物蛋白水解酶活性的影响，结果显示，该复合物的最适反应pH值为7.0。在强酸（pH值≤6.0）、强碱（pH值≥7.0）条件下于 4 ℃ 处理12 h后，相对酶活性迅速减弱，而在pH值6.0～7.0 条件下相对酶活性强于87%，证明PlClpP复合物的中性pH值反应特性。
2.6表面活性剂和蛋白酶抑制剂对PlClpP复合物酶活性的影响
分别采用SDS、Tween-20、Tween-80表面活性剂于 40 ℃ 条件下处理纯化的PlClpP复合物1 h，并在最适温度和pH值条件下测定残余酶活。结果显示，终浓度为0.5%的表面活性剂强烈抑制PlClpP性复合物的酶活性50%～60%；PlClpP 复合物对常规丝氨酸蛋白酶抑制剂具有较强的抗性，10 mmol/L PMSF处理PlClpP复合物1 h对其酶活性无明显影响，表明PlClpP属于一类非常规的丝氨酸蛋白酶。
关键词：ClpP家族蛋白水解酶；类芽孢杆菌；基因；克隆；表达；酶学特性
中图分类号： Q789文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0047-04
蛋白水解酶约占全球酶制剂市场的60%，被广泛应用于食品、医药、洗涤剂、农业等领域[1]。微生物是水解酶的主要来源，探索并开发微生物新基因资源，对于解决目前商品化酶制剂种类及来源较少、底物单一、价格昂贵等问题具有重要意义。
ClpP（caseinolytic peptidase）家族ATP-依赖型伴侣分子相连（chaperone-linked）的酪蛋白水解肽酶广泛存在于原核生物及真核生物中[2]，其利用ATP驱动蛋白底物解折叠并转位进入蛋白水解腔（chamber）中降解成小分子肽[3]。1988年，ClpP蛋白酶首次被发现于大肠杆菌（Eschericia coli）中[4]。此后的大量研究表明，大肠杆菌中ClpP蛋白酶（EcClpP）由蛋白水解核心ClpP、依赖ATP的伴侣分子ClpA或ClpX组成，其蛋白水解腔由催化位点序列形成的2个反向同型七聚体环构成[2]。在国外，ClpP蛋白酶已商品化，而目前国内尚无涉及ClpP家族蛋白酶的研究报道。此外，有关类芽孢杆菌属（Paenibacillus spp.）中clpP基因功能的研究国内外均无报道。采用基因克隆技术，以笔者所在实验室分离鉴定获得的蛋白水解酶高活性类芽孢杆菌（P. lautus） CHN26菌株基因组DNA为模板，克隆鉴定了该菌株的一种新型ATP-依赖型ClpP家族蛋白水解酶PlclpP基因，并在大肠杆菌BL21中实现了异源表达。本研究结果为ClpP家族蛋白酶的基础理论和应用研究奠定了基础。
1材料与方法
1.1试验材料
Mini BEST细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、Premix Ex Taq Verision 2.0、T4 DNA ligase均购自宝生物工程（大连）有限公司。限制性核酸内切酶BamHⅠ和HindⅢ 购自Promega（美国）公司，Luria-Bertani（LB）培养基购自北京陆桥技术有限责任公司。卡那霉素、氨苄青霉素、聚丙烯酰胺和N，N′-亚甲双丙烯酰胺等SDS-PAGE试剂、蛋白质定量检测试剂盒均购自生工生物工程（上海）有限公司。蛋白裂解试剂BugBuster Protein Extraction、纯化试剂Ni-NTA His·Bindresin均购自Merck Millipore（德国）公司。β-酪蛋白购自Sigma-Aldrich（美国）公司。
大肠杆菌TOP10、大肠杆菌BL21、基因克隆载体pGM-T（Ampr）均购自天根生物技术有限公司；基因表达载体pET-28a（Kmr）购自Merck Millipore（德国）公司；类芽孢杆菌CHN26由笔者所在实验室分离鉴定并保存。
1.2试验方法
1.2.1分子生物学方法采用Primer 5.0软件（http：//www.premierbiosoft.com/）设计PlclpP基因PCR扩增上、下游引物ClpP-P1f（5′-ATGGAGGATGAAACCATGAA-3′）、ClpP-P1r（5′-TCACAGTTTGGTGACGATGT-3′），以及在5′端分别引入限制性核酸内切酶BamHⅠ、HindⅢ酶切位点（以下划线表示）的上、下游引物ClpP-P2f（5′-CGGGATCCATGGAGGATGA-3′）、ClpP-P2r（5′-CCCAAGCTTCAGTTTGGTGAC-3′）。寡核苷酸引物合成、DNA序列测定由生工生物工程（上海）有限公司完成，基因组和质粒DNA的提取参照试剂盒说明书完成。参考Shi等的方法[5]进行PCR反应、产物纯化、酶切、DNA片段连接与转化、菌落PCR检测等。采用Clustal 2.1软件（www.ebi.ac.uk/Tools/services）进行多序列比对分析。
1.2.2蛋白表达及纯化参考Li等的方法[6]进行PlclpP基因表达质粒的构建、蛋白的诱导表达、组氨酸标签（His-tag）亲和纯化、SDS-PAGE等。
1.2.3蛋白水解酶活性的检测以β-酪蛋白为底物，在150 μL酶反应液[2.7 μg β-casein，5 μL 0.1 mol/L ATP，2 mmol/L ZnCl2，50 mmol/L Tris-HCl（pH值为7.3）]中加入50 μL纯化酶进行反应。将40 ℃、pH值7.0条件下，30 min内水解β酪蛋白使D562 nm值增加0.01的酶量定义为1个酶活性单位（U）[7]。参考Li等的方法[6]测定温度、pH值，表明活性剂（SDS、Tween-20、Tween-80）和蛋白酶抑制剂（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）对PlClpP复合物酶活性的影响。 2结果与分析
2.1蛋白水解酶高活性菌株类芽孢杆菌CHN26的分离鉴定
基于酶功能的筛选方法[6]，笔者所在实验室从东海水产养殖池塘底泥中分离获得1株蛋白水解酶高活性菌株，经16S rRNA基因序列测定（GenBank登录号为KF460030）分析及生理生化鉴定，发现其为厚壁菌门（Firmicutes）芽孢杆菌纲（Bacilli）芽孢杆菌目（Bacillales）类芽孢杆菌科（Paenibacillaceae）类芽孢杆菌属（Paenibacillus）的细菌，命名为类芽孢杆菌CHN26[6]。笔者所在实验室对该菌株的多种蛋白水解酶基因进行了研究，本次报道其中一种酪蛋白水解肽酶clpP基因的克隆和表达。
2.2类芽孢杆菌CHN26的PlclpP基因分子克隆及序列分析
迄今为止，国内外涉及类芽孢杆菌中clpP基因功能的研究尚无文献报道。本研究利用目前GenBank数据库中类芽孢杆菌属Y412MC10菌株的全基因组信息（GenBank登录号为NC_013406.1），基于其clpP基因序列设计了PCR扩增引物clpP-P1f/r。提取类芽孢杆菌CHN26基因组DNA并以其为模板进行PCR扩增，获得约0.6 kb的单一PCR扩增产物。PCR产物经纯化后与克隆载体pGM-T连接，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。筛选并提取Ampr阳性转化子重组质粒，经DNA序列测定发现，克隆所得类芽孢杆菌CHN26的clpP基因全长585 bp，编码194个氨基酸，预测分子量约为 21 ku，将其命名为PlclpP。
BLAST序列比对分析结果显示，PlclpP序列与GenBank数据库中类芽孢杆菌属的ATP-依赖型ClpP蛋白酶水解亚单位氨基酸序列的相似性为71%～98%，而与EcClpP的氨基酸序列相似性仅为62%。然而clpP基因多序列比对分析结果显示，PlclpP基因序列含有S14_ClpP家族的特征性八肽结构域（KDIHMYIN，第59个至第66个氨基酸）（图1），其中第59个的赖氨酸（Lys58，K）、第60个的天冬氨酸（Asp59，D）、第64个的催化亲核物质（catalytic nucleophile）酪氨酸（Tyr63，Y）为高度保守的催化三分体残基（catalytic triad residues），在酪蛋白水解中发挥重要作用[8]。此外，PlclpP序列还含有丝氨酸蛋白水解酶高度保守的催化活性位点（Ser99-His124-Asp173）（图1）。
2.3PlclpP基因表达质粒pET-28a-PlclpP的构建与鉴定
基于本研究获得的PlclpP基因序列，设计了携带限制性核酸内切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的引物clpP-P2f/r，采用PCR方法扩增PlclpP基因，获得单一PCR产物。采用BamHⅠ和HindⅢ双酶切PCR产物，回收纯化酶切产物。同时，提取表达载体pET-28a的质粒DNA，经BamHⅠ和HindⅢ 双酶切为线性的DNA片段，酶切产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果见图2。
将上述纯化后的酶切片段经T4-DNA连接酶连接后，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，在含有30 μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，采用菌落PCR方法筛选获得阳性转化子克隆（图2）。提取阳性转化子重组质粒DNA，经BamHⅠ和 HindⅢ 双酶切验证为单一DNA片段插入，大小约0.6 kb（图2）。经DNA序列测定，验证插入片段为PlclpP基因。
2.4PlclpP基因的表达和纯化
采用LB液体培养基（含30 μg/mL卡那霉素）于20 ℃培养含有重组表达质粒的大肠杆菌BL21（pET-28a-PlclpP），通过0.6 mmol/L IPTG诱导表达18 h，获得含有组氨酸标签的重组PlClpP蛋白，分子量约为21ku，与预测的ClpP蛋白分子量大小相一致，SDS-PAGE分析结果见图3。利用Ni-NTA-His·Bind resin纯化法纯化大肠杆菌BL21菌体裂解后的无细胞提取液，经SDS-PAGE分析洗脱液各组分，获得了纯化的目标蛋白PlClpP。在大肠杆菌BL21中异源表达的PlClpP蛋白在SDS-PAGE图谱上呈现2个条带，分子量分别约为21、25 ku（图3）。鉴于大肠杆菌EcClpP蛋白酶伴侣分子ClpA、ClpX的分子量分别为80、46 ku[9-10]，推测PlClpP可能与大肠杆菌BL21中未知伴侣分子形成复合物，未知伴侣分子的序列和功能有待进一步研究。采用BCA蛋白定量试剂盒检测PlClpP的表达量，结果显示，1 g细胞湿质量可以产生纯化的重组PlClpP蛋白复合物约0.54 mg，约占细胞总蛋白的 5.25%。
2.5PlClpP复合物的蛋白水解酶活
本研究以非折叠态模式底物β-酪蛋白为底物，在含有2.5 mmol/L ATP的反应液中分析纯化PlClpP复合物在不同温度下的蛋白水解酶活性，PlClpP复合物的最适反应温度为 40 ℃（图4），明显高于类芽孢杆菌CHN26和大肠杆菌BL21的最适生长温度37 ℃。同时分析了该复合物在不同温度下的稳定性，结果显示，PlClpP复合物在10～40℃下处理3h后相对酶活性仍高于90%，进一步证明了PlClpP复合物的嗜中温反应特性（图4）。此外还分析了pH值对PlClpP复合物蛋白水解酶活性的影响，结果显示，该复合物的最适反应pH值为7.0。在强酸（pH值≤6.0）、强碱（pH值≥7.0）条件下于 4 ℃ 处理12 h后，相对酶活性迅速减弱，而在pH值6.0～7.0 条件下相对酶活性强于87%，证明PlClpP复合物的中性pH值反应特性。
2.6表面活性剂和蛋白酶抑制剂对PlClpP复合物酶活性的影响
分别采用SDS、Tween-20、Tween-80表面活性剂于 40 ℃ 条件下处理纯化的PlClpP复合物1 h，并在最适温度和pH值条件下测定残余酶活。结果显示，终浓度为0.5%的表面活性剂强烈抑制PlClpP性复合物的酶活性50%～60%；PlClpP 复合物对常规丝氨酸蛋白酶抑制剂具有较强的抗性，10 mmol/L PMSF处理PlClpP复合物1 h对其酶活性无明显影响，表明PlClpP属于一类非常规的丝氨酸蛋白酶。