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摘要：【目的】研究来自六堡茶的3株散囊菌属真菌对烟草梗丝的发酵效果，为散囊菌屬真菌在烟草中的应用提供参考依据。【方法】分析从六堡茶中筛选得到的3株散囊菌属真菌Aspergillus chevalieri E2（简写E2）、Aspergillus chevalieri E3（简写E3）和Aspergillus cristatus E6（简写E6）在自制烟梗粉液体培养基中的发酵情况，采用DNS法测定果胶酶、纤维素酶和淀粉酶活力及总糖和还原糖含量，茚三酮比色法测定氨基酸含量，普鲁士蓝法测定总抗氧化能力，DPPH·降解法测定自由基清除能力。【结果】3株真菌在烟梗粉液体培养基中均能很好生长，在其表面形成金色有性子囊果结构，产生香气；且在此培养基中3株真菌均能产果胶酶、纤维素酶和淀粉酶，3种酶的最高活力约5.00、1.10和0.50 U/mL，其中E2的产酶速度不及另外两株真菌。与未发酵的对照相比，发酵上清液的还原糖含量均有大幅提升，其中E2提高了289.18%，达31.64 mg/mL；E2、E3和E6总糖含量极显著降低（P<0.01，下同），分别是对照的83.71%、60.03%和70.37%，发酵液的还原糖与总糖比例均接近1∶1，而对照的还原糖含量为总糖含量的20.83%；E3和E6发酵液的氨基酸含量显著减少（P<0.05），分别为对照的82.71%和82.12%；总抗氧化能力无明显变化，但E2和E3发酵液的DPPH·清除能力极显著增强，分别提升了14.71%和21.26%。【结论】来自六堡茶的散囊菌属真菌在烟梗粉液体培养基中能大量生长，具有产糖水解酶特性和清除自由基能力，在改善烟制品方面有一定应用潜力。
关键词： 烟草；散囊菌属；真菌；发酵；酶活；抗氧化能力
中图分类号： S572.09 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）10-2055-07
0 引言
【研究意义】在从发酵茶中分离的众多微生物中，金花菌最受关注，即冠突散囊菌（Aspergillus cristatus）或谢瓦氏散囊菌（A. chevalieri），该菌具有有性与无性两种形态分明的生殖结构。有性结构为黄至橘黄色球形子囊果，内含有性孢子闭囊壳；无性结构为灰绿至淡绿色扫帚状分身孢子梗，产生无性孢子（谭玉梅等，2017）。探索散囊菌属真菌在各种产业中的应用，赋予产品新特性，能带来新的经济价值。在冠突散囊菌成功发酵茶叶的基础上（苏凤等，2011），将其应用扩大至烟梗或烟叶发酵中，以减少烟草有害性和改善吸味，也是提高烟草品质的主要途径和目标。烟梗是烟制品的传统添加物之一，可改善烟制品燃烧性、固定香气和降低成本。利用烟梗作为发酵底物，微生物的作用会转化其中刺激性或在燃烧中起不利影响的物质，而金花菌是茶叶中的产香真菌，发酵后的液体与梗丝均添加到烟制品中作为香料或填充物，具有潜在的利用价值。【前人研究进展】黑茶有降低人体血脂的功效，并能给机体提供消除自由基的物质，已有研究表明六堡茶比普洱茶和普通黑茶更能显著降低试验大鼠血清中胆固醇和甘油三酯水平，并有较强的抗氧化能力（赵宝权等，2013）。黑茶的这些能力与其发酵的微生物关系密切，微生物通过发酵作用将茶中咖啡碱、茶多酚等含量较多的物质转化成刺激性较小的其他物质。在利用微生物改善烟草品质方面，甄达文等（2009）利用生香酵母、德氏乳酸菌和根霉对经酶处理的烟草原料进行发酵，结果发现增香效果明显；刘蓓（2013）的研究结果表明，菌株发酵处理会导致造纸法烟草薄片中纤维素、果胶、蛋白质及淀粉等大分子物质含量降低，总糖和还原糖含量增加；谷月（2016）利用米曲霉或醋酸菌发酵口用型烟草，发酵后烟丝挥发酸含量升高，致香物质种类增多。【本研究切入点】前人已成功利用散囊菌属真菌中的冠突散囊菌对黑毛茶进行发酵（何梅珍等，2014），并运用到商品化生产中；散囊菌属真菌能产生香气物质，但在除茶叶之外的应用非常有限，其应用于烟草的研究目前鲜有报道。【拟解决的关键问题】研究来自六堡茶的3株散囊菌属真菌A. chevalieri E2、A. chevalieri E3和A. cristatus E6在烟梗粉液体培养基中的生长特性，并测定发酵后培养基液体酶活力、还原糖和总糖含量、氨基酸、抗氧化能力等指标，为散囊菌属真菌在烟草中的应用提供参考依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
试验用菌株是广西大学生命科学与技术学院资源与环境微生物实验室前期从六堡茶中分离鉴定获得的3株真菌A. chevalieri E2（简写E2）、A. chevalieri E3（简写E3）和A. cristatus E6（简写E6）。烟草梗丝（水含量约12%）由广西中烟工业有限责任公司提供，经榨汁机搅碎至细小碎块，过100目标准筛得烟梗粉。
改良察氏培养基（苏凤等，2011）：每升液体培养基含K2HPO4·3H2O 1.0 g、MgSO4 0.5 g、NH4NO3 3.0 g，NaCl添加量3.2%，蔗糖2.0%，pH自然。固体培养基琼脂添加量为1.5%。烟梗粉液体培养基：取2.5 g烟梗粉和1.0 g蔗糖加入装有50 mL蒸馏水的250 mL三角瓶中，115 ℃低压灭菌15 min。1%苹果果胶、1%羧甲基纤维素钠、2%可溶性淀粉底物溶液：使用pH 5.0的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液配制，底物均购于索莱宝公司。DNS试剂和茚三酮溶液参照陈桂梅等（2013）的方法配制。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 孢子悬液制作 于-80 ℃取出保存的菌种，活化后，无菌条件下用接种环于改良察氏培养基上划线，置于30 ℃恒温培养箱生长7 d，于无菌环境下用已消毒铁勺将培养基上菌体物质刮下，一个培养基（规格为9 cm）里的菌体放入1.5 mL EP管中，再加入900 μL无菌40%甘油水溶液。使用平板计数法将每个EP管内的可培养孢子数调至约1×107个，制作好的孢子悬液置于-20 ℃保藏。 1. 2. 2 烟梗粉液体培养基发酵 在无菌环境下将50 μL孢子悬液接种至烟梗粉液体培养基中，31 ℃静置培养，每天观察生长情况。
1. 2. 3 发酵烟梗粉液体培养基酶活力测定 使用DNS显色法测试发酵烟梗粉液体培养基上清液中的果胶酶、纤维素酶及淀粉酶活力。3种酶活力均定义为在所给定反应体系与反应条件下每小时生成还原糖产物的毫克数。灭活酶液的处理方法如下：0.5 mL酶液中加入0.5 mL 0.4 mol/L氢氧化钠，煮沸10 min；与样品液同时测定酶活力时，将其稀释成与样品液同样的稀释倍数。
1. 2. 3. 1 果胶酶 在5.0 mL EP管中加入1.0 mL 1%苹果果胶、0.5 mL pH 5.0柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液和0.5 mL适当稀释的酶液，置于水浴锅中50 ℃反应30 min，再加入2.0 mL DNS试剂，沸水浴显色5 min后加1.0 mL蒸馏水定容至5.0 mL，在540 nm处测定吸光值。
1. 2. 3. 2 纤维素酶 在5.0 mL EP管中加入1.5 mL 1%羧甲基纤维素钠、0.5 mL pH 5.0柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液和0.5 mL适当稀释的酶液，置于水浴锅中50 ℃反应30 min，再加入2.5 mL DNS试剂，沸水浴显色5 min，在520 nm处测定吸光值。
1. 2. 3. 3 淀粉酶 在5.0 mL EP管中加入1.0 mL 2%可溶性淀粉、0.5 mL pH 5.0柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液和0.5 mL适当稀释的酶液，置于水浴锅中40 ℃反应1 h，再加入2.0 mL DNS试剂，沸水浴显色5 min，加1.0 mL蒸馏水定容至5.0 mL，在520 nm处测定吸光值。
1. 2. 4 烟梗粉培养基成分分析 测定前使用定性滤纸过滤发酵上清液。以未发酵的烟梗粉培养基为对照。
1. 2. 4. 1 还原糖和总糖含量 参考尹建雄等（2007）的方法测定还原糖和总糖含量。还原糖测定方法：取适当稀释的发酵上清液1.0 mL和1.0 mL DNS试剂加入2.0 mL EP管中，沸水浴中放置6 min，于540 nm下测定吸光值，根据相同方法制作的标准曲线和发酵液稀释倍数计算出还原糖含量。总糖测定方法：取过滤得到的发酵液25.0 mL加入7.0 mL盐酸溶液（浓盐酸与蒸馏水以1∶3配制），沸水浴中酸化30 min，用10%氫氧化钠调节pH至7.0，定容至100 mL，此时发酵液稀释倍数为4；酸化的发酵液使用还原糖测定方法测定总糖。
1. 2. 4. 2 氨基酸含量 采用国标（GB/T 8314—1987）中的茚三酮比色法测定氨基酸含量。取适当稀释的发酵上清液1.0 mL与0.5 mL 1/15 mol/L磷酸缓冲液加入到直形瓶中，再加入茚三酮溶液0.5 mL，沸水浴15 min，定容至25.0 mL，混匀后于570 nm测定吸光值。
1. 2. 4. 3 抗氧化能力 采用普鲁士蓝法（赵艳红等，2008）测定总抗氧化能力，样品液体均稀释100倍。使用DPPH·降解法（胡喜兰等，2006）测定自由基清除能力，样品液体均稀释20倍。
1. 3 统计分析
采用Excel 2010对试验数据进行制图及统计分析。
2 结果与分析
2. 1 烟梗粉液体培养基的发酵结果
从图1可看出，各菌株在烟梗粉液体培养基中均能生长。E2在烟梗粉培养基中第3 d形成可见菌丝球，随时间推移，第6 d液体中不断生长的菌丝球因为液体空间不足而暴露出液体表面，第7 d开始形成金黄色点状有性结构。E3在烟梗粉培养基中第2 d即可在液体表面形成可见菌落，并迅速发展，第3 d菌落附着瓶壁的部分出现金色气生结构，第4 d液体表面形成一层膜，液体内的菌丝球也迅速增大，随后液体表面膜皱缩卷曲，并有小块墨绿色无性结构区域出现。E6在烟梗粉培养基中第3 d可见菌丝球，至第6 d形成小块状边缘不规则的金黄色有性结构，随着时间推移颜色不断加深。
2. 2 发酵烟梗粉液体培养基的酶活力测定结果
2. 2. 1 果胶酶 图2显示，3株菌株从第3 d开始有明显的果胶酶活力，并缓慢上升，其中E3和E6的果胶酶活力上升速度快于E2。E2和E6的酶活力最终维持在5.00 U/mL左右，而E3从第6 d开始出现下降趋势。E2、E3和E6的果胶酶活力达最高值的时间点分别为第7 d（4.94 U/mL）、第6 d（4.46 U/mL）和第7 d（5.08 U/mL）。
2. 2. 2 纤维素酶 图3显示，3株菌株的纤维素酶活力在第2～3 d是对数期，E3和E6的纤维素酶活力上升速度快于E2，与果胶酶活力变化趋势相似，但E2的纤维素酶活力保持上升趋势直到第7 d。当菌株生长至平台期之后，其相应的酶活力也随之表现出降低趋势。就生长情况来看，E2在7 d内均在适应培养基环境，最终达到与其他两株菌株相同的状态。E2、E3和E6的纤维素酶活力达最高值的时间点分别为第7 d（1.14 U/mL）、第7 d（1.17 U/mL）和第6 d（1.16 U/mL）。
2. 2. 3 淀粉酶 图4显示，3株菌株在第2～8 d均有一定程度的淀粉酶活力，E2、E3和E6的淀粉酶活力达最高值的时间点分别为第8 d（0.47 U/mL）、第3 d（0.47 U/mL）和第8 d（0.51 U/mL）。从第2 d开始3株菌株的淀粉酶活力在一定范围内波动，说明其淀粉酶分泌稳定，但酶活力较低。
2. 3 烟梗粉液体培养基发酵前后的成分分析
2. 3. 1 还原糖和总糖含量 从图5可看出，发酵液的还原糖含量较对照极显著提高（P<0.01，下同），其中E2发酵液中还原糖含量（31.64 mg/mL）是对照（8.13 mg/mL）的3.89倍，E3是对照的2.86倍，E6为对照的3.32倍。3株菌株发酵液的总糖含量均较对照（39.03 mg/mL）极显著降低，降幅最大的是E3发酵液（23.43 mg/mL），总糖含量为对照的60.03%，E2发酵液为对照的83.71%，E6发酵液为对照的70.37%。所有发酵液中还原糖与总糖含量比例均接近1∶1，说明各菌株倾向于适当分解环境中的总糖，而不是将所有总糖迅速消耗；根据2.1各菌株在培养液中的表观生长情况来看，生长速度越快的菌株对于糖的消耗速度越快。 2. 3. 2 氨基酸含量 从图6可看出，相比对照（1.34 mg/mL），3株菌株发酵液的氨基酸含量均有所降低，降幅最大的是E6发酵液（剩余1.10 mg/mL）。与糖类利用不同，生长速度最快的E3并没有消耗最多的氨基酸，其原因可能是培养基中有充足的能源物质以供利用合成各种氨基酸。
2. 3. 3 抗氧化能力 如图7所示，测定液在700 nm的OD越高，其总抗氧化能力越强。相对于对照，E2和E6发酵液的总抗氧化能力略有提升，E3发酵液的总抗氧化能力轻微降低。
从图8可看出，3株菌株发酵液的DPPH·清除能力均比对照有所提升，其中E2和E3发酵液极显著增强。相对于自然氧化，微生物的生长会加速消耗天然培养基中的还原性物质，导致培养基的抗氧化能力减弱，但DPPH·清除能力试验并未反映这一趋势，说明各菌株在生长过程中向培养基液体中分泌了具有自由基清除能力的物质。
3 讨论
本研究中，3株真菌在烟梗粉液体培养基中静态培养均能快速生长，菌落形态差异明显，其中E3能在培养基表面形成一层膜，并在生长后期出现无性型，E6菌落颜色在生长后期加深。3株菌株不同的生长特性为下一步试验提供了培养条件基础。谭玉梅等（2013）研究发现了一些與有性型或无性型调控相关的基因，结合本研究观察，3株菌株的世代偏好差异明显，在本研究培养条件下3株真菌的繁殖偏好为有性型，在发酵过程中产生香气，赋予培养基新的香气特性，为真菌在烟草制品中的应用提供了条件。3株菌株均能产生果胶酶、纤维素酶和淀粉酶。蔡正安等（2010）的研究结果表明，在自制液体发酵液中冠突散囊菌的羧甲基纤维素钠酶活力约0.60 U/mL，较本研究结果（约1.00 U/mL）略低，可能是培养基成分不同所造成。在产糖类水解酶方面，E6优于E3，E3优于E2。虽然3株真菌的水解酶活力均较低，但能在发酵过程中改变糖类物质的含量，将其他糖类物质转化为大量分子量相对较低的还原糖，导致所有发酵液的还原糖与总糖比例接近1∶1，符合理想的添加物糖含量比值（≥0.9）。E2发酵液的糖类含量保持在较高水平，优于E6，而E6优于E3。
氨基酸含量与烟草品质关系密切，是重要的致香前体物质，其与还原糖的美拉德反应能产生多种调和烟草香气的芳香物质（王蕾等，2006）。本研究3株真菌发酵液的氨基酸含量均较对照有所降低，反映了真菌生长需消耗一部分氨基酸，或转化成新物质。有研究表明，冠突散囊菌分泌的色素类物质大致有蒽醌类衍生物、蒽醌杂环类物质、酰胺类物质及酚醛类物质（郑欣欣，2015），这些生物活性物质均有抗氧化活性。对于烟草而言，其抗氧化能力主要由所含酚类物质决定，其中绿原酸等对烟草香气有提升作用（傅茂润等，2014），所以能根据抗氧化能力选择燃烧香气较好的烟草添加物。本研究证实所用真菌菌株在提供的培养基中并未产生大量具有总抗氧化生物活性物质，而可能是将培养基中原有的生物活性物质消耗。DPPH·降解试验也反映生物活性物质含量，但主要反映具有自由基清除能力的物质含量，本研究结果表明3株真菌均具有在烟梗粉培养基中产生此类活性物质的能力，其中E3产生的自由基清除活性物质最多。此外，本研究培养基原料为烟制品废料烟草梗丝和蔗糖，具有低成本和发酵迅速的特点。
综上所述，本研究发酵得到的真菌发酵液在糖含量、燃烧产香能力方面有优于其他烟草添加物的特性，在烟草增香提质方面具有应用潜力。
4 结论
本研究所用的3株散囊菌属真菌在烟梗粉液体培养基中均能大量生长，以有性形态占主导，其不同的生长特性中存在诸多共性。3株真菌具有产糖水解酶特性，均能将不溶性糖类物质或可溶性总糖转化为分子量较小的游离还原糖类物质，这一特点符合其在烟制品添加上的应用要求。发酵液的氨基酸含量和总抗氧化能力无明显变化，但DPPH·清除能力较未发酵培养基有所提高的特点为3株真菌在此发酵培养基中筛选具有清除自由基能力的生物活性物质打下了基础。
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（责任编辑 罗 丽）
关键词： 烟草；散囊菌属；真菌；发酵；酶活；抗氧化能力
中图分类号： S572.09 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）10-2055-07
0 引言
【研究意义】在从发酵茶中分离的众多微生物中，金花菌最受关注，即冠突散囊菌（Aspergillus cristatus）或谢瓦氏散囊菌（A. chevalieri），该菌具有有性与无性两种形态分明的生殖结构。有性结构为黄至橘黄色球形子囊果，内含有性孢子闭囊壳；无性结构为灰绿至淡绿色扫帚状分身孢子梗，产生无性孢子（谭玉梅等，2017）。探索散囊菌属真菌在各种产业中的应用，赋予产品新特性，能带来新的经济价值。在冠突散囊菌成功发酵茶叶的基础上（苏凤等，2011），将其应用扩大至烟梗或烟叶发酵中，以减少烟草有害性和改善吸味，也是提高烟草品质的主要途径和目标。烟梗是烟制品的传统添加物之一，可改善烟制品燃烧性、固定香气和降低成本。利用烟梗作为发酵底物，微生物的作用会转化其中刺激性或在燃烧中起不利影响的物质，而金花菌是茶叶中的产香真菌，发酵后的液体与梗丝均添加到烟制品中作为香料或填充物，具有潜在的利用价值。【前人研究进展】黑茶有降低人体血脂的功效，并能给机体提供消除自由基的物质，已有研究表明六堡茶比普洱茶和普通黑茶更能显著降低试验大鼠血清中胆固醇和甘油三酯水平，并有较强的抗氧化能力（赵宝权等，2013）。黑茶的这些能力与其发酵的微生物关系密切，微生物通过发酵作用将茶中咖啡碱、茶多酚等含量较多的物质转化成刺激性较小的其他物质。在利用微生物改善烟草品质方面，甄达文等（2009）利用生香酵母、德氏乳酸菌和根霉对经酶处理的烟草原料进行发酵，结果发现增香效果明显；刘蓓（2013）的研究结果表明，菌株发酵处理会导致造纸法烟草薄片中纤维素、果胶、蛋白质及淀粉等大分子物质含量降低，总糖和还原糖含量增加；谷月（2016）利用米曲霉或醋酸菌发酵口用型烟草，发酵后烟丝挥发酸含量升高，致香物质种类增多。【本研究切入点】前人已成功利用散囊菌属真菌中的冠突散囊菌对黑毛茶进行发酵（何梅珍等，2014），并运用到商品化生产中；散囊菌属真菌能产生香气物质，但在除茶叶之外的应用非常有限，其应用于烟草的研究目前鲜有报道。【拟解决的关键问题】研究来自六堡茶的3株散囊菌属真菌A. chevalieri E2、A. chevalieri E3和A. cristatus E6在烟梗粉液体培养基中的生长特性，并测定发酵后培养基液体酶活力、还原糖和总糖含量、氨基酸、抗氧化能力等指标，为散囊菌属真菌在烟草中的应用提供参考依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
试验用菌株是广西大学生命科学与技术学院资源与环境微生物实验室前期从六堡茶中分离鉴定获得的3株真菌A. chevalieri E2（简写E2）、A. chevalieri E3（简写E3）和A. cristatus E6（简写E6）。烟草梗丝（水含量约12%）由广西中烟工业有限责任公司提供，经榨汁机搅碎至细小碎块，过100目标准筛得烟梗粉。
改良察氏培养基（苏凤等，2011）：每升液体培养基含K2HPO4·3H2O 1.0 g、MgSO4 0.5 g、NH4NO3 3.0 g，NaCl添加量3.2%，蔗糖2.0%，pH自然。固体培养基琼脂添加量为1.5%。烟梗粉液体培养基：取2.5 g烟梗粉和1.0 g蔗糖加入装有50 mL蒸馏水的250 mL三角瓶中，115 ℃低压灭菌15 min。1%苹果果胶、1%羧甲基纤维素钠、2%可溶性淀粉底物溶液：使用pH 5.0的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液配制，底物均购于索莱宝公司。DNS试剂和茚三酮溶液参照陈桂梅等（2013）的方法配制。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 孢子悬液制作 于-80 ℃取出保存的菌种，活化后，无菌条件下用接种环于改良察氏培养基上划线，置于30 ℃恒温培养箱生长7 d，于无菌环境下用已消毒铁勺将培养基上菌体物质刮下，一个培养基（规格为9 cm）里的菌体放入1.5 mL EP管中，再加入900 μL无菌40%甘油水溶液。使用平板计数法将每个EP管内的可培养孢子数调至约1×107个，制作好的孢子悬液置于-20 ℃保藏。 1. 2. 2 烟梗粉液体培养基发酵 在无菌环境下将50 μL孢子悬液接种至烟梗粉液体培养基中，31 ℃静置培养，每天观察生长情况。
1. 2. 3 发酵烟梗粉液体培养基酶活力测定 使用DNS显色法测试发酵烟梗粉液体培养基上清液中的果胶酶、纤维素酶及淀粉酶活力。3种酶活力均定义为在所给定反应体系与反应条件下每小时生成还原糖产物的毫克数。灭活酶液的处理方法如下：0.5 mL酶液中加入0.5 mL 0.4 mol/L氢氧化钠，煮沸10 min；与样品液同时测定酶活力时，将其稀释成与样品液同样的稀释倍数。
1. 2. 3. 1 果胶酶 在5.0 mL EP管中加入1.0 mL 1%苹果果胶、0.5 mL pH 5.0柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液和0.5 mL适当稀释的酶液，置于水浴锅中50 ℃反应30 min，再加入2.0 mL DNS试剂，沸水浴显色5 min后加1.0 mL蒸馏水定容至5.0 mL，在540 nm处测定吸光值。
1. 2. 3. 2 纤维素酶 在5.0 mL EP管中加入1.5 mL 1%羧甲基纤维素钠、0.5 mL pH 5.0柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液和0.5 mL适当稀释的酶液，置于水浴锅中50 ℃反应30 min，再加入2.5 mL DNS试剂，沸水浴显色5 min，在520 nm处测定吸光值。
1. 2. 3. 3 淀粉酶 在5.0 mL EP管中加入1.0 mL 2%可溶性淀粉、0.5 mL pH 5.0柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液和0.5 mL适当稀释的酶液，置于水浴锅中40 ℃反应1 h，再加入2.0 mL DNS试剂，沸水浴显色5 min，加1.0 mL蒸馏水定容至5.0 mL，在520 nm处测定吸光值。
1. 2. 4 烟梗粉培养基成分分析 测定前使用定性滤纸过滤发酵上清液。以未发酵的烟梗粉培养基为对照。
1. 2. 4. 1 还原糖和总糖含量 参考尹建雄等（2007）的方法测定还原糖和总糖含量。还原糖测定方法：取适当稀释的发酵上清液1.0 mL和1.0 mL DNS试剂加入2.0 mL EP管中，沸水浴中放置6 min，于540 nm下测定吸光值，根据相同方法制作的标准曲线和发酵液稀释倍数计算出还原糖含量。总糖测定方法：取过滤得到的发酵液25.0 mL加入7.0 mL盐酸溶液（浓盐酸与蒸馏水以1∶3配制），沸水浴中酸化30 min，用10%氫氧化钠调节pH至7.0，定容至100 mL，此时发酵液稀释倍数为4；酸化的发酵液使用还原糖测定方法测定总糖。
1. 2. 4. 2 氨基酸含量 采用国标（GB/T 8314—1987）中的茚三酮比色法测定氨基酸含量。取适当稀释的发酵上清液1.0 mL与0.5 mL 1/15 mol/L磷酸缓冲液加入到直形瓶中，再加入茚三酮溶液0.5 mL，沸水浴15 min，定容至25.0 mL，混匀后于570 nm测定吸光值。
1. 2. 4. 3 抗氧化能力 采用普鲁士蓝法（赵艳红等，2008）测定总抗氧化能力，样品液体均稀释100倍。使用DPPH·降解法（胡喜兰等，2006）测定自由基清除能力，样品液体均稀释20倍。
1. 3 统计分析
采用Excel 2010对试验数据进行制图及统计分析。
2 结果与分析
2. 1 烟梗粉液体培养基的发酵结果
从图1可看出，各菌株在烟梗粉液体培养基中均能生长。E2在烟梗粉培养基中第3 d形成可见菌丝球，随时间推移，第6 d液体中不断生长的菌丝球因为液体空间不足而暴露出液体表面，第7 d开始形成金黄色点状有性结构。E3在烟梗粉培养基中第2 d即可在液体表面形成可见菌落，并迅速发展，第3 d菌落附着瓶壁的部分出现金色气生结构，第4 d液体表面形成一层膜，液体内的菌丝球也迅速增大，随后液体表面膜皱缩卷曲，并有小块墨绿色无性结构区域出现。E6在烟梗粉培养基中第3 d可见菌丝球，至第6 d形成小块状边缘不规则的金黄色有性结构，随着时间推移颜色不断加深。
2. 2 发酵烟梗粉液体培养基的酶活力测定结果
2. 2. 1 果胶酶 图2显示，3株菌株从第3 d开始有明显的果胶酶活力，并缓慢上升，其中E3和E6的果胶酶活力上升速度快于E2。E2和E6的酶活力最终维持在5.00 U/mL左右，而E3从第6 d开始出现下降趋势。E2、E3和E6的果胶酶活力达最高值的时间点分别为第7 d（4.94 U/mL）、第6 d（4.46 U/mL）和第7 d（5.08 U/mL）。
2. 2. 2 纤维素酶 图3显示，3株菌株的纤维素酶活力在第2～3 d是对数期，E3和E6的纤维素酶活力上升速度快于E2，与果胶酶活力变化趋势相似，但E2的纤维素酶活力保持上升趋势直到第7 d。当菌株生长至平台期之后，其相应的酶活力也随之表现出降低趋势。就生长情况来看，E2在7 d内均在适应培养基环境，最终达到与其他两株菌株相同的状态。E2、E3和E6的纤维素酶活力达最高值的时间点分别为第7 d（1.14 U/mL）、第7 d（1.17 U/mL）和第6 d（1.16 U/mL）。
2. 2. 3 淀粉酶 图4显示，3株菌株在第2～8 d均有一定程度的淀粉酶活力，E2、E3和E6的淀粉酶活力达最高值的时间点分别为第8 d（0.47 U/mL）、第3 d（0.47 U/mL）和第8 d（0.51 U/mL）。从第2 d开始3株菌株的淀粉酶活力在一定范围内波动，说明其淀粉酶分泌稳定，但酶活力较低。
2. 3 烟梗粉液体培养基发酵前后的成分分析
2. 3. 1 还原糖和总糖含量 从图5可看出，发酵液的还原糖含量较对照极显著提高（P<0.01，下同），其中E2发酵液中还原糖含量（31.64 mg/mL）是对照（8.13 mg/mL）的3.89倍，E3是对照的2.86倍，E6为对照的3.32倍。3株菌株发酵液的总糖含量均较对照（39.03 mg/mL）极显著降低，降幅最大的是E3发酵液（23.43 mg/mL），总糖含量为对照的60.03%，E2发酵液为对照的83.71%，E6发酵液为对照的70.37%。所有发酵液中还原糖与总糖含量比例均接近1∶1，说明各菌株倾向于适当分解环境中的总糖，而不是将所有总糖迅速消耗；根据2.1各菌株在培养液中的表观生长情况来看，生长速度越快的菌株对于糖的消耗速度越快。 2. 3. 2 氨基酸含量 从图6可看出，相比对照（1.34 mg/mL），3株菌株发酵液的氨基酸含量均有所降低，降幅最大的是E6发酵液（剩余1.10 mg/mL）。与糖类利用不同，生长速度最快的E3并没有消耗最多的氨基酸，其原因可能是培养基中有充足的能源物质以供利用合成各种氨基酸。
2. 3. 3 抗氧化能力 如图7所示，测定液在700 nm的OD越高，其总抗氧化能力越强。相对于对照，E2和E6发酵液的总抗氧化能力略有提升，E3发酵液的总抗氧化能力轻微降低。
从图8可看出，3株菌株发酵液的DPPH·清除能力均比对照有所提升，其中E2和E3发酵液极显著增强。相对于自然氧化，微生物的生长会加速消耗天然培养基中的还原性物质，导致培养基的抗氧化能力减弱，但DPPH·清除能力试验并未反映这一趋势，说明各菌株在生长过程中向培养基液体中分泌了具有自由基清除能力的物质。
3 讨论
本研究中，3株真菌在烟梗粉液体培养基中静态培养均能快速生长，菌落形态差异明显，其中E3能在培养基表面形成一层膜，并在生长后期出现无性型，E6菌落颜色在生长后期加深。3株菌株不同的生长特性为下一步试验提供了培养条件基础。谭玉梅等（2013）研究发现了一些與有性型或无性型调控相关的基因，结合本研究观察，3株菌株的世代偏好差异明显，在本研究培养条件下3株真菌的繁殖偏好为有性型，在发酵过程中产生香气，赋予培养基新的香气特性，为真菌在烟草制品中的应用提供了条件。3株菌株均能产生果胶酶、纤维素酶和淀粉酶。蔡正安等（2010）的研究结果表明，在自制液体发酵液中冠突散囊菌的羧甲基纤维素钠酶活力约0.60 U/mL，较本研究结果（约1.00 U/mL）略低，可能是培养基成分不同所造成。在产糖类水解酶方面，E6优于E3，E3优于E2。虽然3株真菌的水解酶活力均较低，但能在发酵过程中改变糖类物质的含量，将其他糖类物质转化为大量分子量相对较低的还原糖，导致所有发酵液的还原糖与总糖比例接近1∶1，符合理想的添加物糖含量比值（≥0.9）。E2发酵液的糖类含量保持在较高水平，优于E6，而E6优于E3。
氨基酸含量与烟草品质关系密切，是重要的致香前体物质，其与还原糖的美拉德反应能产生多种调和烟草香气的芳香物质（王蕾等，2006）。本研究3株真菌发酵液的氨基酸含量均较对照有所降低，反映了真菌生长需消耗一部分氨基酸，或转化成新物质。有研究表明，冠突散囊菌分泌的色素类物质大致有蒽醌类衍生物、蒽醌杂环类物质、酰胺类物质及酚醛类物质（郑欣欣，2015），这些生物活性物质均有抗氧化活性。对于烟草而言，其抗氧化能力主要由所含酚类物质决定，其中绿原酸等对烟草香气有提升作用（傅茂润等，2014），所以能根据抗氧化能力选择燃烧香气较好的烟草添加物。本研究证实所用真菌菌株在提供的培养基中并未产生大量具有总抗氧化生物活性物质，而可能是将培养基中原有的生物活性物质消耗。DPPH·降解试验也反映生物活性物质含量，但主要反映具有自由基清除能力的物质含量，本研究结果表明3株真菌均具有在烟梗粉培养基中产生此类活性物质的能力，其中E3产生的自由基清除活性物质最多。此外，本研究培养基原料为烟制品废料烟草梗丝和蔗糖，具有低成本和发酵迅速的特点。
综上所述，本研究发酵得到的真菌发酵液在糖含量、燃烧产香能力方面有优于其他烟草添加物的特性，在烟草增香提质方面具有应用潜力。
4 结论
本研究所用的3株散囊菌属真菌在烟梗粉液体培养基中均能大量生长，以有性形态占主导，其不同的生长特性中存在诸多共性。3株真菌具有产糖水解酶特性，均能将不溶性糖类物质或可溶性总糖转化为分子量较小的游离还原糖类物质，这一特点符合其在烟制品添加上的应用要求。发酵液的氨基酸含量和总抗氧化能力无明显变化，但DPPH·清除能力较未发酵培养基有所提高的特点为3株真菌在此发酵培养基中筛选具有清除自由基能力的生物活性物质打下了基础。
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（责任编辑 罗 丽）