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摘 要：采用高效液相色谱柱前衍生法测定酵母抽提物中谷氨酸的含量，以苯异硫氰酸作为柱前衍生试剂，在C18柱上，弱碱性条件以保留时间定性、外标法定量。结果表明，在0.2～1.0mg/mL线性范围内，线性相关系数为0.999816，相对标准偏差小于5%，回收率在95%～110%，样品检测结果良好。该方法还可以用于其他氨基酸的检测。
关键词：高效液相色谱法；谷氨酸；柱前衍生
中图分类号 O657.72 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）18-0018-02
Determination of Glutamic Acid in Yeast Extract by HPLC
Li Suyuan et al.
（Three Gorges Product Quality Inspection and Testing Center，Yichang 443000，China）
Abstract：The content of glutamic acid in yeast extract was determined by high performance liquid chromatography column derivatization. Benzo thiocyanic acid was used as a pre column derivatization reagent. On the C18 column，the retention time was qualitative and the external standard was quantified under the condition of weak alkali. The results show that in the linear range of 0.2～1.0mg/mL，the linear correlation coefficient is 0.999816，the relative standard deviation is less than 5%，the recovery rate is between 95%～110%，and the sample test results are good. This method can also be used for the detection of other amino acids.
Key words：High performance liquid chromatography（HPLC）；Glutamic acid；Pre column derivatization
氨基酸是构成蛋白质的基本单元，是动物体合成蛋白质的主要原料，是食品、饲料的营养成分，也是生物工程、生化制药、表面活性剂工业产品的化工原料，因此它们的分离分析引起了人们的关注[1-4]。目前，安全国家标准《食品中氨基酸的测定》规定用氨基酸分析仪测定食品中氨基酸含量，但氨基酸分析仪价格昂贵，操作繁锁，分析时间长，仪器专一性强、成本高，所用试剂及材料價格不菲，且只能用于分析氨基酸，使氨基酸的快速、简便分析受到了限制[5-6]。近几年，高效液相色谱测氨基酸已成为研究热点[7-8]，由于大多数氨基酸无法被天然的紫外或荧光吸收，需要进行柱前、柱后[9-10]衍生化才能达到检测目的。本文以苯异硫氰酸作为柱前衍生试剂，在弱碱性条件下，氨基酸的α-氨基酸可与苯异硫氰酸反应生成相应的苯氨基甲酰氨基酸。经分离后，可在反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析，并通过紫外检测器定性、定量。液相色谱通用性强，检测灵敏度高，可用于多种物质的分析。
1 材料与方法
1.1 器材与试剂 冰乙酸（优级纯），乙腈（色谱纯），无水乙酸钠（优级纯），去离子高纯水，色谱柱（C18，5μm，4.6mm×250mm，Waters），高效液相色谱仪（Waters e2695）。
1.2 实验条件
1.2.1 色谱条件 流动相为A相乙腈，B相称取无水固体乙酸钠8.2g加水至1000mL，用乙酸调节pH值=6.5，过滤膜，超声脱气，检测波长254nm，进样量为10μL，流速为1.0mL/min，柱温25℃。
1.2.2 梯度洗脱
1.2.3 衍生剂 衍生剂A，取异硫氰酸苯酯1.2mL用乙腈定容到100mL；衍生剂B，取三乙胺13.9mL用乙腈定容到100mL。
1.2.4 标准溶液的配制 称取谷氨酸标品0.5g（精确至0.01mg）于50mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，此母液浓度为10mg/mL。用此母液逐级稀释，配制标准系列0.2mg/mL，0.4mg/mL，0.6mg/mL，0.8mg/mL，1mg/mL。
1.2.5 样品前处理 准确称取适量试样，一般固体1～5g左右，液态试样20g左右，置于100mL锥形瓶中，加入40℃～50℃温水至30mL，如果试样中含淀粉，加入淀粉酶0.2g，振摇混匀，盖上瓶塞，在55℃±5℃水浴条件下，酶解120min，如果试样不含淀粉，直接超声提取20min。冷至室温，用0.1mol/L盐酸调节pH值5.0±0.1，加入5mL0.5mol/L硫酸锌溶液，充分混合，转入50mL容量瓶中，用水定容至刻度并充分混匀后，离心。取上清液1mL于离心管中，分别加入衍生剂A和B1mL，室温静置1h，在衍生好的样品中加入正己烷2mL，震荡后静置10min，取下层清液用水稀释5倍后，过0.45μm滤膜，上液相色谱仪。标样采用同样的方法衍生处理。
2 结果与分析
2.1 线性关系及检出限 按照条件将谷氨酸的标准系列浓度进样，确定保留时间为5min，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制工作曲线。在0.2～1mg/mL线性范围内，谷氨酸的线性回归方程为y=9.49e+005x+1.82e+006，线性相关系数r2为0.999816。 2.2 精密度实验 平行称取安琪酵母抽提物样品5份，直接超声提取20min。冷至室温，用0.1mol/L盐酸调节pH值5.0±0.1，加入5mL0.5mol/L硫酸锌溶液，充分混合，转入50mL容量瓶中，用水定容至刻度并充分混匀后，离心。离心液与标准谷氨酸溶液同样方法衍生后进行分析。结果如表2。
结果表明，平行样间谷氨酸的相对标准偏差RSD小于5%，重现性较好。
2.3 回收率 称取同样的酵母抽提物样品5份，称样量1g左右，经检测样品中谷氨酸含量为2.276%，分别加入10mg/mL的谷氨酸标准溶液2mL，经同样处理后进仪器检测，谷氨酸的加标回收率结果如表3。
2.4 其它氨基酸检测 采用同样的衍生处理方法和仪器检测条件，对丝氨酸、甘氨酸、精氨酸等18种氨基酸进行檢测，各组分分离完全，线性好，所以该方法也可以用于混合氨基酸检测。
3 结论
以苯异硫氰酸作为柱前衍生的衍生试剂，在弱碱性条件下，经分离后，衍生产物在高效液相色谱上分离，紫外检测器测定谷氨酸的含量。该方法通用性强，样品前处理步骤简单，检测灵敏度高，重现性好，加标回收率高，结果准确可靠，可用于多种物质的分析。
参考文献
[1]刘钢，李裕林，南发俊.多样性导向的“类天然产物”化合物库合成[J].化学进展，2006，18（6）：789-793.
[2]于泓，牟世芬. 氨基酸分析方法的研究进展[J].分析化学，2005，33（3）：398-404.
[3]Shi WJ，Ai SY，Li JH，et al .Electrochemical Biosensor Based on Dendrimer Immobilized Deoxyribonucleic Acid[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry，2005，33（3）：398-404.
[4]章丽，刘松雁.氨基酸测定方法的研究进展[J].河北化工，2009，3（5）：27-28.
[5]Spackman DH，Moore S.Autom atic recording apparatus for usein th e chromatograph y of amino acids[J].Analytical Chemistry，1958，30（7）：1190.
[6]许彦芳，许新民，王永利.高效液相色谱柱前自动衍生法测定氨基酸含量[J].河北医科大学学报，1996，17（3）：132-134.
[7]Furst P，Pollack L，Graser T A，et al.Appraisal of four pre-column derivatization methods for the high-performance liquid chromatographic determination of free amino acids in biological materials[J].Journal of Chromatography A，1990，499（19）：557-569.
[8]Hong JL.Determination of amino acids by precolumn derivatization with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccin iomidyl carbamate and high performance liquid chromatography with ultroviolet detection[J].Journal of Chromatography A，1994，670（1）：59-66.
[9]Latorre R M，Saurina J，Hernandez C S.Sensitivity enhancement by on-ine preconcentration and in-apillary derivatization for the electrophoretic determination of amino acids[J].Electrophoresis，1999，37：353-359.
[10]Weng QF，Jin W R. Determination of free intracellular amino acids in single mouse peritoneal macrophages after naphthalene-2，3-dicarboxaldehyde derivatization by capillary zone electrophoresis with electrochemical detection[J].Electrophoresis，Electrophoresis，2001，22（13）：2797-2803.
（责编：王慧晴）
关键词：高效液相色谱法；谷氨酸；柱前衍生
中图分类号 O657.72 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）18-0018-02
Determination of Glutamic Acid in Yeast Extract by HPLC
Li Suyuan et al.
（Three Gorges Product Quality Inspection and Testing Center，Yichang 443000，China）
Abstract：The content of glutamic acid in yeast extract was determined by high performance liquid chromatography column derivatization. Benzo thiocyanic acid was used as a pre column derivatization reagent. On the C18 column，the retention time was qualitative and the external standard was quantified under the condition of weak alkali. The results show that in the linear range of 0.2～1.0mg/mL，the linear correlation coefficient is 0.999816，the relative standard deviation is less than 5%，the recovery rate is between 95%～110%，and the sample test results are good. This method can also be used for the detection of other amino acids.
Key words：High performance liquid chromatography（HPLC）；Glutamic acid；Pre column derivatization
氨基酸是构成蛋白质的基本单元，是动物体合成蛋白质的主要原料，是食品、饲料的营养成分，也是生物工程、生化制药、表面活性剂工业产品的化工原料，因此它们的分离分析引起了人们的关注[1-4]。目前，安全国家标准《食品中氨基酸的测定》规定用氨基酸分析仪测定食品中氨基酸含量，但氨基酸分析仪价格昂贵，操作繁锁，分析时间长，仪器专一性强、成本高，所用试剂及材料價格不菲，且只能用于分析氨基酸，使氨基酸的快速、简便分析受到了限制[5-6]。近几年，高效液相色谱测氨基酸已成为研究热点[7-8]，由于大多数氨基酸无法被天然的紫外或荧光吸收，需要进行柱前、柱后[9-10]衍生化才能达到检测目的。本文以苯异硫氰酸作为柱前衍生试剂，在弱碱性条件下，氨基酸的α-氨基酸可与苯异硫氰酸反应生成相应的苯氨基甲酰氨基酸。经分离后，可在反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析，并通过紫外检测器定性、定量。液相色谱通用性强，检测灵敏度高，可用于多种物质的分析。
1 材料与方法
1.1 器材与试剂 冰乙酸（优级纯），乙腈（色谱纯），无水乙酸钠（优级纯），去离子高纯水，色谱柱（C18，5μm，4.6mm×250mm，Waters），高效液相色谱仪（Waters e2695）。
1.2 实验条件
1.2.1 色谱条件 流动相为A相乙腈，B相称取无水固体乙酸钠8.2g加水至1000mL，用乙酸调节pH值=6.5，过滤膜，超声脱气，检测波长254nm，进样量为10μL，流速为1.0mL/min，柱温25℃。
1.2.2 梯度洗脱
1.2.3 衍生剂 衍生剂A，取异硫氰酸苯酯1.2mL用乙腈定容到100mL；衍生剂B，取三乙胺13.9mL用乙腈定容到100mL。
1.2.4 标准溶液的配制 称取谷氨酸标品0.5g（精确至0.01mg）于50mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，此母液浓度为10mg/mL。用此母液逐级稀释，配制标准系列0.2mg/mL，0.4mg/mL，0.6mg/mL，0.8mg/mL，1mg/mL。
1.2.5 样品前处理 准确称取适量试样，一般固体1～5g左右，液态试样20g左右，置于100mL锥形瓶中，加入40℃～50℃温水至30mL，如果试样中含淀粉，加入淀粉酶0.2g，振摇混匀，盖上瓶塞，在55℃±5℃水浴条件下，酶解120min，如果试样不含淀粉，直接超声提取20min。冷至室温，用0.1mol/L盐酸调节pH值5.0±0.1，加入5mL0.5mol/L硫酸锌溶液，充分混合，转入50mL容量瓶中，用水定容至刻度并充分混匀后，离心。取上清液1mL于离心管中，分别加入衍生剂A和B1mL，室温静置1h，在衍生好的样品中加入正己烷2mL，震荡后静置10min，取下层清液用水稀释5倍后，过0.45μm滤膜，上液相色谱仪。标样采用同样的方法衍生处理。
2 结果与分析
2.1 线性关系及检出限 按照条件将谷氨酸的标准系列浓度进样，确定保留时间为5min，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制工作曲线。在0.2～1mg/mL线性范围内，谷氨酸的线性回归方程为y=9.49e+005x+1.82e+006，线性相关系数r2为0.999816。 2.2 精密度实验 平行称取安琪酵母抽提物样品5份，直接超声提取20min。冷至室温，用0.1mol/L盐酸调节pH值5.0±0.1，加入5mL0.5mol/L硫酸锌溶液，充分混合，转入50mL容量瓶中，用水定容至刻度并充分混匀后，离心。离心液与标准谷氨酸溶液同样方法衍生后进行分析。结果如表2。
结果表明，平行样间谷氨酸的相对标准偏差RSD小于5%，重现性较好。
2.3 回收率 称取同样的酵母抽提物样品5份，称样量1g左右，经检测样品中谷氨酸含量为2.276%，分别加入10mg/mL的谷氨酸标准溶液2mL，经同样处理后进仪器检测，谷氨酸的加标回收率结果如表3。
2.4 其它氨基酸检测 采用同样的衍生处理方法和仪器检测条件，对丝氨酸、甘氨酸、精氨酸等18种氨基酸进行檢测，各组分分离完全，线性好，所以该方法也可以用于混合氨基酸检测。
3 结论
以苯异硫氰酸作为柱前衍生的衍生试剂，在弱碱性条件下，经分离后，衍生产物在高效液相色谱上分离，紫外检测器测定谷氨酸的含量。该方法通用性强，样品前处理步骤简单，检测灵敏度高，重现性好，加标回收率高，结果准确可靠，可用于多种物质的分析。
参考文献
[1]刘钢，李裕林，南发俊.多样性导向的“类天然产物”化合物库合成[J].化学进展，2006，18（6）：789-793.
[2]于泓，牟世芬. 氨基酸分析方法的研究进展[J].分析化学，2005，33（3）：398-404.
[3]Shi WJ，Ai SY，Li JH，et al .Electrochemical Biosensor Based on Dendrimer Immobilized Deoxyribonucleic Acid[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry，2005，33（3）：398-404.
[4]章丽，刘松雁.氨基酸测定方法的研究进展[J].河北化工，2009，3（5）：27-28.
[5]Spackman DH，Moore S.Autom atic recording apparatus for usein th e chromatograph y of amino acids[J].Analytical Chemistry，1958，30（7）：1190.
[6]许彦芳，许新民，王永利.高效液相色谱柱前自动衍生法测定氨基酸含量[J].河北医科大学学报，1996，17（3）：132-134.
[7]Furst P，Pollack L，Graser T A，et al.Appraisal of four pre-column derivatization methods for the high-performance liquid chromatographic determination of free amino acids in biological materials[J].Journal of Chromatography A，1990，499（19）：557-569.
[8]Hong JL.Determination of amino acids by precolumn derivatization with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccin iomidyl carbamate and high performance liquid chromatography with ultroviolet detection[J].Journal of Chromatography A，1994，670（1）：59-66.
[9]Latorre R M，Saurina J，Hernandez C S.Sensitivity enhancement by on-ine preconcentration and in-apillary derivatization for the electrophoretic determination of amino acids[J].Electrophoresis，1999，37：353-359.
[10]Weng QF，Jin W R. Determination of free intracellular amino acids in single mouse peritoneal macrophages after naphthalene-2，3-dicarboxaldehyde derivatization by capillary zone electrophoresis with electrochemical detection[J].Electrophoresis，Electrophoresis，2001，22（13）：2797-2803.
（责编：王慧晴）