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嗜热栖热菌具有促进细胞生长、延缓衰老、阻抗日光对皮肤的损害和修复皮肤的能力。本文采用高温发酵制备嗜热栖热菌发酵液（Thermus thermoph.Ius fermentation broth），从细胞层面对其安全性、延缓衰老、防晒和创伤修复能力进行评价。结果表明，积分数≤10%的嗜热栖热菌发酵液对人永生化表皮细胞（HACAT）和人皮肤成纤维细胞（HSF）都是安全无毒的，并具有促进细胞增殖的作用;UVB光紫外照射损伤修复模型中，体积分数为1%～ 10%的嗜热栖热菌发酵液均有较强的防晒能力和促进细胞生长能力，且具有延缓细胞衰老的功效;在细胞创伤修复模型中，体积分数为1%～ 10%的嗜热栖热菌发酵液具有不同程度的创伤修复能力。上述结果表明嗜热栖热菌发酵液安全无毒，并具有一定的延缓衰老、防晒和创伤修复功效。
随着生物技术的飞速发展，微生物发酵原料被广泛应用于化妆品领域，也有将其用于皮肤微生态的研究。将微生物高效应用制成的功能性化妆品（延缓衰老、美白、修复、保湿和辅助炎性皮肤改善等功效）受到人们青睐。一种生活在火山、深海热岩等极端高热环境下的嗜热菌已成为人们日益重视并利用的微生物资源[1]，嗜热栖热菌（ThermusThermophilus）广泛分布于温泉、地热区土壤、海底火山口附近、厩肥等处[2]，是一种耐热菌，含有特异性的超嗜热蛋白（如taqDNA聚合酶、耐热淀粉酶、嗜热蛋白酶、分子马达等嗜热酶），这些蛋白具有耐热特性和强稳定性，可以耐受90℃以上的高温而不失活[3]。
嗜热栖热菌中较为独特的“生长因子”以核酸、维生素A、维生素82、烟酰胺、β类胡萝卜素、谷胱甘肽、聚多氨（多聚氨基酸）等为主要成分，近年来，研究发现其还合有烟酰胺单核苷酸（Nicotinamide Mononucleotide）等延缓衰老的活性物质。核酸是细胞代谢的必需物质，有助于表皮细胞基因的营养及其损伤的修复，对皮肤进行深层滋润，使皮肤柔软。维生素、谷胱甘肽、多聚氨为细胞生长因子，能够恢复和促进细胞生理机能，在慢性、非治疗伤口（如糖尿病溃疡的伤口）修复时能够促进细胞生长，还可以减轻皮肤炎症反应和抵抗日光的损害。耐热活性酶使嗜热栖热菌在高温条件下仍具备超强的DNA保护与修复能力。利用该耐热特性，K.B.Mullis将嗜热菌中的taqDNA聚合酶应用开发了多聚酶链式反应，获得了1993年的诺贝尔奖，基因工程研究也因此技术得以飞速发展[4]。LINTNERK等研究表明，在嗜熱菌体内提取到的一种对热稳定的酶可作为化妆品配方中维生素类活性成分的有效替代和补充，从而保护皮肤免受A型紫外线（UV-A）诱导生成自由基的损害[5]。相比于从植物中萃取和化学合成的方法将有效成分提取和分离，通过微生物发酵可产生大量活性成分（如透明质酸、氨基酸），发酵过程中还可能会伴随某些成分的分解转化而生成新的有效成分，从而发挥更佳的目标功能;并且从能源经济角度来看，发酵法还是一种更加高效环保获得的方法旧。
本文利用高温发酵制备嗜热栖热菌发酵液（Thermusthermophi[us fermentation broth），从体外细胞安全性、延缓衰老和修复功效等三个方面对发酵产物进行综合评价，发掘其在延缓衰老和修复化妆品中的应用价值。
01 材料与方法
1.材料与仪器
嗜热栖热菌发酵液（杭州优玛达生物科技有限公司）;DMEM高糖培养基（上海典瑞生物科技有限公司）;RPMI1640培养基、胎牛血清（FBS）（美国Gibco公司）;0.25%胰酶，青一链霉素溶液（SK）（杭州吉诺生物医药技术有限公司）;噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）（西格玛奥德里奇中国有限公司）;地塞米松（Dexamethasone）标准品，（IGC公司）;人永生化表皮细胞（HACAT），人皮肤成纤维细胞（HSF）（北京北纳创联生物技术研究院）;磷酸缓冲盐溶液（PBS），现用现配，装瓶灭菌待用;净化工作台（BT-ICD）（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）;HH系列数显恒温水浴锅（XMTP203）（金坛市科析仪器有限公司）;二氧化碳培养箱（HF90）（上海力申科学仪器有限公司）;低速立式离心机（KA-1000C）（上海安亭科学仪器厂）;倒置显微镜（CKX31-12PHP）（杭州汇尔仪器设备有限公司）;紫外线光疗仪[SH4 （B） 1154T]（上海希格玛高技术有限公司）;酶标仪（Mu[tiskan FC），[赛默飞世尔（上海）仪器有限公司]。
2.实验方法
（1）细胞培养
将人永生化表皮细胞培养于含10%FBS、1%SK的DMEM培养基，成纤维细胞培养于含10%FBS、1%SK的RPMI 1640培养基，置于37℃、5%CO2恒温细胞培养箱中，以0.25%胰酶+0.02%EDTA溶液消化，将处于对数生长期的细胞接种于细胞培养瓶，于37℃、5% CO2上进行培养。
（2）嗜热栖热菌发酵液延缓衰老功效研究
①入永生化表皮细胞（ HACAT）毒性的测定
采用MTT法[7，8]检测受试物对HACAT细胞存活率的影响。收集对数期细胞，用含10%FBS、1%SK的DMEM培养液制成HACAT细胞悬液，采用血球计数板计数，用培养液调节细胞终浓度为IX104个/mL接种于96孔板中，于37℃、5% CO2下培养，以不含细胞的培养液为空白调零组，板四周孔用无菌PBS填充封边。待细胞贴壁生长至一定细胞个数，换液加入不同体积分数（0.05%、0.1%、0.5%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%）的样品，以不含样品的培养液为对照组。继续培养24 h，每孑L加入20 mL MTT溶液（5g/L），继续培养4h后弃去培养液，每孔加100 mL DMSO，低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择490 nm处在酶标仪上测定各孔吸光度值，记录结果。 ②人皮肤成纤维细胞（HSF）毒性的测定
采用MTT法检测受试物对HSF细胞存活率的影响。收集对数期细胞，用合10%FBS、1%SK的RPMI 1640培养液制成HSF细胞悬液，采用血球计数板计数，用培养液调节细胞终浓度为ixi04个/mL接种200 mL/孑L96孔板中，于37℃、5% CO2下培养，以不合细胞的培养液为空白调零组，板四周孔用无菌PBS填充封边。待细胞贴壁生长至一定细胞个数，换液加入不同体积分数（0.05%、0.1%、0.5%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%）的样品，以不合样品的培养液为对照组。继续培养24 h，每孔加入20mL MTT溶液（5 g/L），继续培养4h后弃去培养液，每孔加100 m[ DMSO，低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择490 nm处在酶标仪上测定各孔吸光度值，记录结果。按下式计算细胞存活率[10]，用SPSS 16.O程序计算出IC50，并按表l判定毒性分级[11]：
x（%）= （A药物-A调零）× 100%
（A对照-A调零）
X（%）一细胞存活率;
A药物一加药样品测定孔的吸光度平均值;
A调零一空白孔的吸光度平均值;
A对照一对照孔的吸光度平均值;
（3）嗜热栖热菌发酵液光损伤修复功效研究
通过模拟的UVB光源照射HSF细胞建立光损伤修复模型后加入受试物，检测受试物对光损伤细胞的修复能力。收集对数期细胞，用含10%FBS、1%SK的RPMI 1640培养液制成HSF细胞悬液，采用血球计数板计数，用培养液调节细胞终浓度为5×104个/mL接种100 mL/孔96孔板中，于37℃、5%CO2下培养，板四周子L用无菌PBS填充封边。共接种2块96孔板，每块板设置相同，分为正常对照组（不照射UVB，加细胞），对照组（照射UVB，加细胞）和空白调零组（不照射UVB，不加细胞）。
板1处理：细胞培养24h后，吸出培养液，用PBS洗一次，吸出培养液，再加入20 uL的PBS，进行UVB光源照射[UVB照射时间：UVB灯，峰值311 nm，开灯lOmin后用紫外线辐射强度为1.05mW/cm2。辐射剂量控制为30mJ/cm2，辐射时间（S）=辐射剂量（m J/cm2）/辐射强度（m W/cm2） =30sl，其中正常对照组和空白调零不需要辐照（用铝箔纸遮盖住）。板2处理与板1处理基本一致，UVB光源辐射强度为60s，两板均换入不同体积分数（0.5%、1%、3%、5%、10%）的样品，以35 ppm地塞米松为阳性对照组，以不合加药样品的培养液为对照组。继续培养24h，进行MTT实验（同嗜热栖热菌发酵液延缓衰老功效研究）。记录结果，根据细胞存活率来评价样品对光损伤的修复能力。
（4）嗜热栖热菌发酵液划痕修复功效研究
通过建立体外细胞创伤模型，加入受试药物来观察HSF细胞迁移面积，检测受试物的划痕修复能力。收集对数期细胞，用合10%FBS、1%SK的RPM11640培养液制成HSF细胞悬液，采用血球计数板计数，用培养液调节细胞终浓度为2×105个/mL接种于6孔板中，于37℃、5%CO2下培养，RPMI 1640全培养液常规培养，细胞单层融合时，弃去培养液，用无菌200 μL移液器枪头在细胞层的标记垂直划痕，6孔细胞培养板板底中央用MARK笔做标记。建立体外细胞创伤模型，PBS反复冲洗，至划痕区域干净。6孔板加入不同体积分数的不含胎牛血清的培养基及空白组加入不合胎牛血清的培养基，对照组加入含l0%FBS的培养基均2.0mL，设计见表2。观察0h、24h和48h，定性观察愈合时间，利用SigmaPlot 14.O软件计算愈合面积的大小，记录结果，判断受试物的愈合能力。
02 结果与讨论
1.嗜热栖热菌发酵液延缓衰老功效研究
（1）嗜热栖热菌发酵液对人永生化表皮细胞（HACAT）毒性的检测
如图1所示，在体积分数0% - 10%范围内的嗜热栖热菌发酵液作用下，HACAT细胞存活率均在100%以上，计算IC50≥10 mg/mL，根据欧盟国家实验室化妆品毒性的标准中ICso >1.5 mg/ mL，表明此体积分数0% -10%范围内的嗜热栖热菌发酵液无毒性作用，且具有促进HACAT细胞增殖的能力。
（2）嗜热栖热菌发酵液对人皮肤成纤维细胞（HSF）毒性的检测
成纤维细胞是皮肤真皮中的主体细胞成分，它不仅能够合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、基质大分子物质和某些生长因子，同时还具有黏附特性和趋化性，对维持皮肤的弹性和韧性具有重要作用。随着年龄的增长，皮肤逐渐老化、皱纹增多、弹性降低，這些表现都与成纤维细胞数量减少、合成功能下降密切相关[9，10]。
如图2所示，在体积分数0%- 10%范围内的嗜热栖热菌发酵液作用下HSF细胞存活率在100%以上，计算IC50≥10 mg/mL，根据欧盟国家实验室化妆品毒性的标准中IC50>1.5 mg/ mL，表明此体积分数O%- 10%范围内的嗜热栖热菌发酵液无毒性作用，且具有促进HSF细胞增殖的能力。
2.嗜热栖热菌发酵液修复功效研究
（1）嗜热栖热菌发酵液对人皮肤成纤维细胞（HSF）光损伤修复能力的检测
①由于长期的紫外线辐射会加速皮肤的老化进程，使皮肤提前衰老，所以防晒原料是延缓皮肤衰老产品中必不可少的一类。
如图3所示，模拟UVB光源照射HSF细胞30 s建立光损伤修复模型。在体积分数0.5%- 10%范围内的嗜热栖热菌发酵液作用下，除体积分数为0.5%的嗜热栖热菌发酵液作用下HSF细胞存活率为80.41%，光损伤修复能力相对较低，其他体积分数的HSF细胞存活率均在130%以上，光损伤修复能力均较强，有促进细胞生长的作用：而阳性对照组地塞米松和正常对照组的HSF细胞存活率为9.73%和19.03%，几乎没有光损伤修复能力。表明在体积分数1% - 10%范围内嗜热栖热菌发酵液均有较强的光损伤修复能力及延缓细胞衰老的作用。 ②如图4所示，模拟UVB光源照射HSF细胞60 s建立光损伤修复模型。在体积分数0.5%- 10%范围内的嗜热栖热菌发酵液作用下，除体积分数为0.5%的嗜热栖热菌发酵液作用下HSF细胞存活率为63.76%，光损伤修复能力相对较低，其他体积分数的HSF细胞存活率均在100%以上，光损伤修复能力均较强，有促进细胞生长的作用;而阳性对照组地塞米松和正常对照组的HSF细胞存活率为7.14%和11.97%，几乎没有光损伤修复能力。表明在体积分数1% -10%范围内嗜热栖热菌发酵液均有较强的光损伤修复能力及延缓细胞衰老的作用。
（2）嗜热栖热菌发酵液对人皮肤成纤维细胞（HSF）创伤修复能力的检测
如图5所示，采用枪头划痕模拟HSF细胞创伤，根据HSF细胞迁移面积检测受试物的划痕修复能力。在体积分数1% - 10%范围内的嗜热栖热菌发酵液作用下，有不同程度的修复能力，其中体积分数10%修复能力最强，愈合面积达到21.39%：而对照组愈合面积为43.21%，体积分数10%嗜热栖热菌发酵液的修复能力达到对照组修复能力的一半，表明体积分数为10%有较强的创伤修复能力：而体积分数在1% - 10%范围内的嗜热栖热菌发酵液有不同程度的创伤修复能力。
03 结论
本研究结果在体外细胞实验中表明，体积分数≤10%的嗜热栖热菌发酵液对人永生化表皮细胞（HACAT）和人皮肤成纤维细胞（HSF）是安全无毒的，且具有促进细胞增殖的作用。
在光损伤修复模型中，通过不同的光照时间，体积分数为1% - 10%的嗜热栖热菌发酵液对人皮肤成纤维细胞（HSF）均有较强的防晒能力及促进细胞生长能力，且具有延缓细胞衰老的功效：在细胞创伤修复模型中，体积分数在1% - 10%的嗜热栖热菌发酵液对人皮肤成纤维细胞（HSF）具有不同程度的创伤修复能力。
嗜热栖热菌发酵液作为延缓衰老和皮肤损伤修复的个人护理天然原料，应用到延缓皮肤衰老和促进皮肤疤痕修复功效的化妆品之中，应用前景广阔。
（作者任职于杭州优玛达生物科技有限公司）
参考文献
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[2]沈萍.微生物学[M].北京：高等教育出版社，2000
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[4]郑婷，高颖，姚雨辰，等，一种嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵的方法.
[5]LINTNER K，LAMY F MAS-CHAMBERLIN C等.深海细菌中提取的热稳定酶——保护肌肤的主要媒体，抵抗A型紫外线辐射诱导生成自由基侵害[C]2004年中国化妆品学术研讨会论文集.2004.
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[11]金凤慈，闵莉静.MTT法测定香菇多糖细胞毒性的研究[J].科技信息，2011（08）：84-85.
随着生物技术的飞速发展，微生物发酵原料被广泛应用于化妆品领域，也有将其用于皮肤微生态的研究。将微生物高效应用制成的功能性化妆品（延缓衰老、美白、修复、保湿和辅助炎性皮肤改善等功效）受到人们青睐。一种生活在火山、深海热岩等极端高热环境下的嗜热菌已成为人们日益重视并利用的微生物资源[1]，嗜热栖热菌（ThermusThermophilus）广泛分布于温泉、地热区土壤、海底火山口附近、厩肥等处[2]，是一种耐热菌，含有特异性的超嗜热蛋白（如taqDNA聚合酶、耐热淀粉酶、嗜热蛋白酶、分子马达等嗜热酶），这些蛋白具有耐热特性和强稳定性，可以耐受90℃以上的高温而不失活[3]。
嗜热栖热菌中较为独特的“生长因子”以核酸、维生素A、维生素82、烟酰胺、β类胡萝卜素、谷胱甘肽、聚多氨（多聚氨基酸）等为主要成分，近年来，研究发现其还合有烟酰胺单核苷酸（Nicotinamide Mononucleotide）等延缓衰老的活性物质。核酸是细胞代谢的必需物质，有助于表皮细胞基因的营养及其损伤的修复，对皮肤进行深层滋润，使皮肤柔软。维生素、谷胱甘肽、多聚氨为细胞生长因子，能够恢复和促进细胞生理机能，在慢性、非治疗伤口（如糖尿病溃疡的伤口）修复时能够促进细胞生长，还可以减轻皮肤炎症反应和抵抗日光的损害。耐热活性酶使嗜热栖热菌在高温条件下仍具备超强的DNA保护与修复能力。利用该耐热特性，K.B.Mullis将嗜热菌中的taqDNA聚合酶应用开发了多聚酶链式反应，获得了1993年的诺贝尔奖，基因工程研究也因此技术得以飞速发展[4]。LINTNERK等研究表明，在嗜熱菌体内提取到的一种对热稳定的酶可作为化妆品配方中维生素类活性成分的有效替代和补充，从而保护皮肤免受A型紫外线（UV-A）诱导生成自由基的损害[5]。相比于从植物中萃取和化学合成的方法将有效成分提取和分离，通过微生物发酵可产生大量活性成分（如透明质酸、氨基酸），发酵过程中还可能会伴随某些成分的分解转化而生成新的有效成分，从而发挥更佳的目标功能;并且从能源经济角度来看，发酵法还是一种更加高效环保获得的方法旧。
本文利用高温发酵制备嗜热栖热菌发酵液（Thermusthermophi[us fermentation broth），从体外细胞安全性、延缓衰老和修复功效等三个方面对发酵产物进行综合评价，发掘其在延缓衰老和修复化妆品中的应用价值。
01 材料与方法
1.材料与仪器
嗜热栖热菌发酵液（杭州优玛达生物科技有限公司）;DMEM高糖培养基（上海典瑞生物科技有限公司）;RPMI1640培养基、胎牛血清（FBS）（美国Gibco公司）;0.25%胰酶，青一链霉素溶液（SK）（杭州吉诺生物医药技术有限公司）;噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）（西格玛奥德里奇中国有限公司）;地塞米松（Dexamethasone）标准品，（IGC公司）;人永生化表皮细胞（HACAT），人皮肤成纤维细胞（HSF）（北京北纳创联生物技术研究院）;磷酸缓冲盐溶液（PBS），现用现配，装瓶灭菌待用;净化工作台（BT-ICD）（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）;HH系列数显恒温水浴锅（XMTP203）（金坛市科析仪器有限公司）;二氧化碳培养箱（HF90）（上海力申科学仪器有限公司）;低速立式离心机（KA-1000C）（上海安亭科学仪器厂）;倒置显微镜（CKX31-12PHP）（杭州汇尔仪器设备有限公司）;紫外线光疗仪[SH4 （B） 1154T]（上海希格玛高技术有限公司）;酶标仪（Mu[tiskan FC），[赛默飞世尔（上海）仪器有限公司]。
2.实验方法
（1）细胞培养
将人永生化表皮细胞培养于含10%FBS、1%SK的DMEM培养基，成纤维细胞培养于含10%FBS、1%SK的RPMI 1640培养基，置于37℃、5%CO2恒温细胞培养箱中，以0.25%胰酶+0.02%EDTA溶液消化，将处于对数生长期的细胞接种于细胞培养瓶，于37℃、5% CO2上进行培养。
（2）嗜热栖热菌发酵液延缓衰老功效研究
①入永生化表皮细胞（ HACAT）毒性的测定
采用MTT法[7，8]检测受试物对HACAT细胞存活率的影响。收集对数期细胞，用含10%FBS、1%SK的DMEM培养液制成HACAT细胞悬液，采用血球计数板计数，用培养液调节细胞终浓度为IX104个/mL接种于96孔板中，于37℃、5% CO2下培养，以不含细胞的培养液为空白调零组，板四周孔用无菌PBS填充封边。待细胞贴壁生长至一定细胞个数，换液加入不同体积分数（0.05%、0.1%、0.5%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%）的样品，以不含样品的培养液为对照组。继续培养24 h，每孑L加入20 mL MTT溶液（5g/L），继续培养4h后弃去培养液，每孔加100 mL DMSO，低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择490 nm处在酶标仪上测定各孔吸光度值，记录结果。 ②人皮肤成纤维细胞（HSF）毒性的测定
采用MTT法检测受试物对HSF细胞存活率的影响。收集对数期细胞，用合10%FBS、1%SK的RPMI 1640培养液制成HSF细胞悬液，采用血球计数板计数，用培养液调节细胞终浓度为ixi04个/mL接种200 mL/孑L96孔板中，于37℃、5% CO2下培养，以不合细胞的培养液为空白调零组，板四周孔用无菌PBS填充封边。待细胞贴壁生长至一定细胞个数，换液加入不同体积分数（0.05%、0.1%、0.5%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%）的样品，以不合样品的培养液为对照组。继续培养24 h，每孔加入20mL MTT溶液（5 g/L），继续培养4h后弃去培养液，每孔加100 m[ DMSO，低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择490 nm处在酶标仪上测定各孔吸光度值，记录结果。按下式计算细胞存活率[10]，用SPSS 16.O程序计算出IC50，并按表l判定毒性分级[11]：
x（%）= （A药物-A调零）× 100%
（A对照-A调零）
X（%）一细胞存活率;
A药物一加药样品测定孔的吸光度平均值;
A调零一空白孔的吸光度平均值;
A对照一对照孔的吸光度平均值;
（3）嗜热栖热菌发酵液光损伤修复功效研究
通过模拟的UVB光源照射HSF细胞建立光损伤修复模型后加入受试物，检测受试物对光损伤细胞的修复能力。收集对数期细胞，用含10%FBS、1%SK的RPMI 1640培养液制成HSF细胞悬液，采用血球计数板计数，用培养液调节细胞终浓度为5×104个/mL接种100 mL/孔96孔板中，于37℃、5%CO2下培养，板四周子L用无菌PBS填充封边。共接种2块96孔板，每块板设置相同，分为正常对照组（不照射UVB，加细胞），对照组（照射UVB，加细胞）和空白调零组（不照射UVB，不加细胞）。
板1处理：细胞培养24h后，吸出培养液，用PBS洗一次，吸出培养液，再加入20 uL的PBS，进行UVB光源照射[UVB照射时间：UVB灯，峰值311 nm，开灯lOmin后用紫外线辐射强度为1.05mW/cm2。辐射剂量控制为30mJ/cm2，辐射时间（S）=辐射剂量（m J/cm2）/辐射强度（m W/cm2） =30sl，其中正常对照组和空白调零不需要辐照（用铝箔纸遮盖住）。板2处理与板1处理基本一致，UVB光源辐射强度为60s，两板均换入不同体积分数（0.5%、1%、3%、5%、10%）的样品，以35 ppm地塞米松为阳性对照组，以不合加药样品的培养液为对照组。继续培养24h，进行MTT实验（同嗜热栖热菌发酵液延缓衰老功效研究）。记录结果，根据细胞存活率来评价样品对光损伤的修复能力。
（4）嗜热栖热菌发酵液划痕修复功效研究
通过建立体外细胞创伤模型，加入受试药物来观察HSF细胞迁移面积，检测受试物的划痕修复能力。收集对数期细胞，用合10%FBS、1%SK的RPM11640培养液制成HSF细胞悬液，采用血球计数板计数，用培养液调节细胞终浓度为2×105个/mL接种于6孔板中，于37℃、5%CO2下培养，RPMI 1640全培养液常规培养，细胞单层融合时，弃去培养液，用无菌200 μL移液器枪头在细胞层的标记垂直划痕，6孔细胞培养板板底中央用MARK笔做标记。建立体外细胞创伤模型，PBS反复冲洗，至划痕区域干净。6孔板加入不同体积分数的不含胎牛血清的培养基及空白组加入不合胎牛血清的培养基，对照组加入含l0%FBS的培养基均2.0mL，设计见表2。观察0h、24h和48h，定性观察愈合时间，利用SigmaPlot 14.O软件计算愈合面积的大小，记录结果，判断受试物的愈合能力。
02 结果与讨论
1.嗜热栖热菌发酵液延缓衰老功效研究
（1）嗜热栖热菌发酵液对人永生化表皮细胞（HACAT）毒性的检测
如图1所示，在体积分数0% - 10%范围内的嗜热栖热菌发酵液作用下，HACAT细胞存活率均在100%以上，计算IC50≥10 mg/mL，根据欧盟国家实验室化妆品毒性的标准中ICso >1.5 mg/ mL，表明此体积分数0% -10%范围内的嗜热栖热菌发酵液无毒性作用，且具有促进HACAT细胞增殖的能力。
（2）嗜热栖热菌发酵液对人皮肤成纤维细胞（HSF）毒性的检测
成纤维细胞是皮肤真皮中的主体细胞成分，它不仅能够合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、基质大分子物质和某些生长因子，同时还具有黏附特性和趋化性，对维持皮肤的弹性和韧性具有重要作用。随着年龄的增长，皮肤逐渐老化、皱纹增多、弹性降低，這些表现都与成纤维细胞数量减少、合成功能下降密切相关[9，10]。
如图2所示，在体积分数0%- 10%范围内的嗜热栖热菌发酵液作用下HSF细胞存活率在100%以上，计算IC50≥10 mg/mL，根据欧盟国家实验室化妆品毒性的标准中IC50>1.5 mg/ mL，表明此体积分数O%- 10%范围内的嗜热栖热菌发酵液无毒性作用，且具有促进HSF细胞增殖的能力。
2.嗜热栖热菌发酵液修复功效研究
（1）嗜热栖热菌发酵液对人皮肤成纤维细胞（HSF）光损伤修复能力的检测
①由于长期的紫外线辐射会加速皮肤的老化进程，使皮肤提前衰老，所以防晒原料是延缓皮肤衰老产品中必不可少的一类。
如图3所示，模拟UVB光源照射HSF细胞30 s建立光损伤修复模型。在体积分数0.5%- 10%范围内的嗜热栖热菌发酵液作用下，除体积分数为0.5%的嗜热栖热菌发酵液作用下HSF细胞存活率为80.41%，光损伤修复能力相对较低，其他体积分数的HSF细胞存活率均在130%以上，光损伤修复能力均较强，有促进细胞生长的作用：而阳性对照组地塞米松和正常对照组的HSF细胞存活率为9.73%和19.03%，几乎没有光损伤修复能力。表明在体积分数1% - 10%范围内嗜热栖热菌发酵液均有较强的光损伤修复能力及延缓细胞衰老的作用。 ②如图4所示，模拟UVB光源照射HSF细胞60 s建立光损伤修复模型。在体积分数0.5%- 10%范围内的嗜热栖热菌发酵液作用下，除体积分数为0.5%的嗜热栖热菌发酵液作用下HSF细胞存活率为63.76%，光损伤修复能力相对较低，其他体积分数的HSF细胞存活率均在100%以上，光损伤修复能力均较强，有促进细胞生长的作用;而阳性对照组地塞米松和正常对照组的HSF细胞存活率为7.14%和11.97%，几乎没有光损伤修复能力。表明在体积分数1% -10%范围内嗜热栖热菌发酵液均有较强的光损伤修复能力及延缓细胞衰老的作用。
（2）嗜热栖热菌发酵液对人皮肤成纤维细胞（HSF）创伤修复能力的检测
如图5所示，采用枪头划痕模拟HSF细胞创伤，根据HSF细胞迁移面积检测受试物的划痕修复能力。在体积分数1% - 10%范围内的嗜热栖热菌发酵液作用下，有不同程度的修复能力，其中体积分数10%修复能力最强，愈合面积达到21.39%：而对照组愈合面积为43.21%，体积分数10%嗜热栖热菌发酵液的修复能力达到对照组修复能力的一半，表明体积分数为10%有较强的创伤修复能力：而体积分数在1% - 10%范围内的嗜热栖热菌发酵液有不同程度的创伤修复能力。
03 结论
本研究结果在体外细胞实验中表明，体积分数≤10%的嗜热栖热菌发酵液对人永生化表皮细胞（HACAT）和人皮肤成纤维细胞（HSF）是安全无毒的，且具有促进细胞增殖的作用。
在光损伤修复模型中，通过不同的光照时间，体积分数为1% - 10%的嗜热栖热菌发酵液对人皮肤成纤维细胞（HSF）均有较强的防晒能力及促进细胞生长能力，且具有延缓细胞衰老的功效：在细胞创伤修复模型中，体积分数在1% - 10%的嗜热栖热菌发酵液对人皮肤成纤维细胞（HSF）具有不同程度的创伤修复能力。
嗜热栖热菌发酵液作为延缓衰老和皮肤损伤修复的个人护理天然原料，应用到延缓皮肤衰老和促进皮肤疤痕修复功效的化妆品之中，应用前景广阔。
（作者任职于杭州优玛达生物科技有限公司）
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