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摘要：为研究戈戈健和本草劲方对猪肠上皮细胞因子表达的影响，本实验分别以200μg/mL的戈戈健和500μg/mL的本草劲方溶液处理猪肠上皮细胞，培养后收集细胞，提取总RNA，反转录成cDNA，通过荧光定量PCR测定各种相关细胞因子mRNA表达水平。结果显示，戈戈健能显著上调IFN-β（P<0.05）、IL-6（P<0.05）、IL-8（P<0.01）、TNF-α（P<0.05）和TGF-β（P<0.05）mRNA表达水平；本草劲方能显著上调IFN-α（P<0.05）、IFN-β（P<0.01）和TGF-β（P<0.05）mRNA表达水平，显著下调IL-6（P<0.05）和TNF-α（P<0.01）mRNA表达水平。表明这两种中药制剂均能通过诱导I型干扰素产生而发挥抗病毒作用；戈戈健能通过促进抗炎因子IL-6、IL-8和TNF-α分泌来增强细胞免疫，同时上调抑炎因子TGF-β表达来防止过度炎症；本草劲方能抑制促炎因子IL-6和TNF-α的产生并促进抑炎因子TGF-β的分泌，从而增强细胞的抗炎能力。本研究为戈戈健和本草劲方用于预防和治疗猪场病毒病提供了理论依据。
关键词：黄芪多糖；双黄连；IPEC-1；细胞因子；抗病毒；抗炎
近年来，传染性疾病制约着我国养猪业的发展，尤其是病毒病的危害最严重…，如猪瘟、流感、伪狂犬病和繁殖与呼吸综合症等恶性病毒病给养殖户造成了极大的经济损失。目前防治病毒病最常用的方法是注射疫苗，但由于病毒变异快，血清型多，导致疫苗的应用效果不理想。研究发现，许多中药有良好的抗病毒作用，能增强动物的免疫力，改善机体的不良反应，而且中药价格低廉、毒副作用小、不会产生耐药性，能广泛应用于病毒病的预防和治疗。戈戈健的主要成分是黄芪多糖粉，黄芪多糖是中药黄芪的主要活性成分，大量研究表明，黄芪多糖不仅能直接杀灭病毒，还能通过诱导产生干扰素，增强巨噬细胞功能而达到抗病毒的效果；可作为免疫增强剂，提高多种疫苗的抗体水平，增强疫苗免疫的效果；能提高机体的特异性和非特异性免疫功能，减少动物疾病的发生。本草劲方的主要成分是双黄连可溶性粉，由金银花、连翘和黄芩三味中药研制而成，对多种致病菌和病毒有较强的杀灭或抑制作用，临床用于治疗细菌和病毒感染所引起的肺炎、气管炎、支气管炎、扁桃体炎等上呼吸道感染。本研究通过体外培养猪肠上皮细胞（IPEC-1），用戈戈健和本草劲方处理，分析各种相关细胞因子mRNA表达水平的变化情况，探讨这两种中药制剂抗病毒、抗炎症和增强免疫力的作用机理，旨在为其应用于猪场病毒病的预防和治疗提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
IPEC-1细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院；戈戈健（黄芪多糖粉）和本草劲方（双黄连可溶性粉）由浙江博信药业有限公司提供，用PBS配制成溶液，浓度分别为4mg/mL和10mg/mL。
1.2主要试剂
含双抗（1001U/mL青霉素和100ug/mL链霉素）的DMEM培养液、D-Hanks液、0.25%胰酶（含0.02%EDTA）、胎牛血清均购自杭州四季青生物工程材料有限公司；RNA提取试剂盒（Trizol）购自北京天根生化科技有限公司；反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司。
1.3细胞培养及处理
IPEC-1细胞用含有10%胎牛血清的双抗DMEM培养基，于37℃5%CO，条件下培养，每24h换液，48h传代。采用台盼蓝法检测细胞活性，保持在95%以上。以培养液调整细胞浓度至1×10。个/mL，按每孔0.95mL接种至12孔细胞培养板中，37℃5%CO，继续培养6h，待细胞贴壁，进行试验。试验分为空白对照组、处理组1和处理组2，每组3个重复孔。对照组加入50μLPBS；处理组1加入50μL戈戈健溶液，使其终浓度为200μg/mL；处理组2加入50μL本草劲方溶液，使其终浓度为500μg/mL，37℃5%CO2继续培养6h。
1.4样品收集与测定
收集培养后的细胞，提取总RNA，反转录成cDNA，通过荧光定量PCR测定干扰素-α（IFN-α）、干扰素-β（IFN-β）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和转化生长因子-β（TGF-β）的mRNA表达量，以B-actin基因为内参，采用Pfaffl建立的方法计算所有基因的相对表达量。
1.5数据处理
采用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析及Duncan’s法多重比较。以P<0.01表示差異极显著，P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著，结果均以平均值±标准误表示。
2结果分析
2.1两种中药制剂对IFN表达的影响
由图1可以看出，与对照组相比，处理组1和处理组2的IFN-α mRNA相对表达量均上升，其中处理组2的差异达到显著水平（P<0.05）。由图2可以看出，处理组1的IFN-β mRNA相对表达量较对照组显著上升（P<0.05），处理组2的IFN-β mRNA相对表达量较对照组极显著上升（P<0.01）。试验结果表明，戈戈健和本草劲方均能诱导肠上皮细胞产生干扰素。
2.2两种中药制剂对促炎细胞因子表达的影响
由图3可以看出，处理组1的IL-6 mRNA相对表达量较对照组显著上升（P<0.05），处理组2的IL-6 mRNA相对表达量较对照组显著减少（P<0.05）。由图4可以看出，处理组1的IL-8 mRNA相对表达量较对照组极显著上升（P<0.01），处理组2的IL-8 mRNA相对表达量较对照组减少，但未达到显著水平。由图5可以看出，处理组1的TNF-α mRNA相对表达量较对照组显著上升（P<0.05），处理组2的TNF-α mRNA相对表达量较对照组极显著减少（P<0.01）。试验结果表明，戈戈健能诱导促炎细胞因子产生；本草劲方对促炎细胞因子有明显的抑制作用。 2.3两种中药制剂对抑炎细胞因子表达的影响
由图6可以看出，与对照组相比，处理组1和处理组2的TGF-β mRNA相对表达量均显著上升（P<0.05）。
试验结果表明，戈戈健和本草劲方均能诱导抑炎细胞因子产生。
3讨论
干扰素是由机体细胞产生的一类多功能活性蛋白，具有廣谱抗病毒、抗肿瘤活性及免疫调节等多种生物学活性。按照国际标准，干扰素分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三类，IFN-α、IFN-β属于Ⅰ类干扰素，当病毒作用于机体细胞时，Ⅰ型干扰素在数小时内大量产生，作为机体防御系统中出现最早的细胞因子，在防止病毒在体内扩散的前期起着重要的作用。刘立民等通过体外实验研究发现黄芪多糖能显著提高浆细胞样树突状细胞分泌的IFN-α量，促进自身及其它细胞分泌细胞因子来抑制病毒的复制。胡克杰等研究表明精制双黄连气雾剂有诱导人外周白细胞产生IFN-α的作用。徐凯建等研究发现双黄连气雾剂和注射剂均能促进淋巴细胞产生IFN-α。本研究表明，戈戈健能诱导IPEC-1的IFN-α表达水平上升，并显著上调IFN-β mRNA表达水平；本草劲方能诱导IFN-α和IFN-β mRNA的表达水平显著上升，提示这两种中药制剂均能通过诱导IPEC-1产生Ⅰ型干扰素来抑制病毒的入侵及复制。
炎症细胞因子可分为促炎和抑炎细胞因子两大类，促炎细胞因子包括IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α和IFN-γ等，抑炎细胞因子包括IL-4、IL-10、IL-13、IL-14和TGF-β等。机体受到病原体感染后出现免疫应答，释放促炎细胞因子，引起机体炎症反应，阻止病毒进一步扩散，而抗炎细胞因子能防止过度炎症反应，从而避免组织器官严重损伤。刘立民等通过体外培养浆细胞样树突状细胞，用ELISA法检测出黄芪多糖能显著提高IL-6和TNF-α的分泌量，促进B细胞向浆细胞分化，提高免疫球蛋白的分泌量，从而增强机体抗感染的能力。邹云等通过饲养试验研究发现，添加黄芪多糖能显著提高断奶仔猪血清中的TNF含量，也能在一定程度上提高IL-6的含量。本实验结果显示，戈戈健能诱导抗炎因子IL-6、IL-8和TNF-α mRNA表达水平显著上升，具有一定的免疫增强作用，同时上调抑炎因子TGF-βmRNA表达以防止过度炎症。
TNF-α是由单核巨噬细胞分泌的一种多肽调节因子，能诱导IL-6、IL-8等一系列炎症介质的释放，导致机体产生炎症反应。贾鹰珏等用双黄连微乳剂治疗胸膜炎模型大鼠，研究发现，双黄连能显著降低大鼠胸腔渗出液中的TNF-α含量，对IL-8也有一定的抑制作用，提示双黄连具有抗炎作用。李安泰等研究发现双黄连注射液能通过降低血清和脑脊液中的炎症因子IL-6和TNF-α的表达水平来治疗病毒性脑炎。本研究表明，本草劲方能抑制促炎因子IL-6和TNF-α的产生，同时促进抑炎因子TGF-β的分泌，从而增强细胞的抗炎能力。
4小结
综上所述，戈戈健具有抗病毒、增强机体免疫的作用，本草劲方具有抗病毒、抗炎的作用，两种中药制剂均能用于预防和治疗猪场病毒病，值得在养殖生产实践中推广。
关键词：黄芪多糖；双黄连；IPEC-1；细胞因子；抗病毒；抗炎
近年来，传染性疾病制约着我国养猪业的发展，尤其是病毒病的危害最严重…，如猪瘟、流感、伪狂犬病和繁殖与呼吸综合症等恶性病毒病给养殖户造成了极大的经济损失。目前防治病毒病最常用的方法是注射疫苗，但由于病毒变异快，血清型多，导致疫苗的应用效果不理想。研究发现，许多中药有良好的抗病毒作用，能增强动物的免疫力，改善机体的不良反应，而且中药价格低廉、毒副作用小、不会产生耐药性，能广泛应用于病毒病的预防和治疗。戈戈健的主要成分是黄芪多糖粉，黄芪多糖是中药黄芪的主要活性成分，大量研究表明，黄芪多糖不仅能直接杀灭病毒，还能通过诱导产生干扰素，增强巨噬细胞功能而达到抗病毒的效果；可作为免疫增强剂，提高多种疫苗的抗体水平，增强疫苗免疫的效果；能提高机体的特异性和非特异性免疫功能，减少动物疾病的发生。本草劲方的主要成分是双黄连可溶性粉，由金银花、连翘和黄芩三味中药研制而成，对多种致病菌和病毒有较强的杀灭或抑制作用，临床用于治疗细菌和病毒感染所引起的肺炎、气管炎、支气管炎、扁桃体炎等上呼吸道感染。本研究通过体外培养猪肠上皮细胞（IPEC-1），用戈戈健和本草劲方处理，分析各种相关细胞因子mRNA表达水平的变化情况，探讨这两种中药制剂抗病毒、抗炎症和增强免疫力的作用机理，旨在为其应用于猪场病毒病的预防和治疗提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
IPEC-1细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院；戈戈健（黄芪多糖粉）和本草劲方（双黄连可溶性粉）由浙江博信药业有限公司提供，用PBS配制成溶液，浓度分别为4mg/mL和10mg/mL。
1.2主要试剂
含双抗（1001U/mL青霉素和100ug/mL链霉素）的DMEM培养液、D-Hanks液、0.25%胰酶（含0.02%EDTA）、胎牛血清均购自杭州四季青生物工程材料有限公司；RNA提取试剂盒（Trizol）购自北京天根生化科技有限公司；反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司。
1.3细胞培养及处理
IPEC-1细胞用含有10%胎牛血清的双抗DMEM培养基，于37℃5%CO，条件下培养，每24h换液，48h传代。采用台盼蓝法检测细胞活性，保持在95%以上。以培养液调整细胞浓度至1×10。个/mL，按每孔0.95mL接种至12孔细胞培养板中，37℃5%CO，继续培养6h，待细胞贴壁，进行试验。试验分为空白对照组、处理组1和处理组2，每组3个重复孔。对照组加入50μLPBS；处理组1加入50μL戈戈健溶液，使其终浓度为200μg/mL；处理组2加入50μL本草劲方溶液，使其终浓度为500μg/mL，37℃5%CO2继续培养6h。
1.4样品收集与测定
收集培养后的细胞，提取总RNA，反转录成cDNA，通过荧光定量PCR测定干扰素-α（IFN-α）、干扰素-β（IFN-β）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和转化生长因子-β（TGF-β）的mRNA表达量，以B-actin基因为内参，采用Pfaffl建立的方法计算所有基因的相对表达量。
1.5数据处理
采用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析及Duncan’s法多重比较。以P<0.01表示差異极显著，P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著，结果均以平均值±标准误表示。
2结果分析
2.1两种中药制剂对IFN表达的影响
由图1可以看出，与对照组相比，处理组1和处理组2的IFN-α mRNA相对表达量均上升，其中处理组2的差异达到显著水平（P<0.05）。由图2可以看出，处理组1的IFN-β mRNA相对表达量较对照组显著上升（P<0.05），处理组2的IFN-β mRNA相对表达量较对照组极显著上升（P<0.01）。试验结果表明，戈戈健和本草劲方均能诱导肠上皮细胞产生干扰素。
2.2两种中药制剂对促炎细胞因子表达的影响
由图3可以看出，处理组1的IL-6 mRNA相对表达量较对照组显著上升（P<0.05），处理组2的IL-6 mRNA相对表达量较对照组显著减少（P<0.05）。由图4可以看出，处理组1的IL-8 mRNA相对表达量较对照组极显著上升（P<0.01），处理组2的IL-8 mRNA相对表达量较对照组减少，但未达到显著水平。由图5可以看出，处理组1的TNF-α mRNA相对表达量较对照组显著上升（P<0.05），处理组2的TNF-α mRNA相对表达量较对照组极显著减少（P<0.01）。试验结果表明，戈戈健能诱导促炎细胞因子产生；本草劲方对促炎细胞因子有明显的抑制作用。 2.3两种中药制剂对抑炎细胞因子表达的影响
由图6可以看出，与对照组相比，处理组1和处理组2的TGF-β mRNA相对表达量均显著上升（P<0.05）。
试验结果表明，戈戈健和本草劲方均能诱导抑炎细胞因子产生。
3讨论
干扰素是由机体细胞产生的一类多功能活性蛋白，具有廣谱抗病毒、抗肿瘤活性及免疫调节等多种生物学活性。按照国际标准，干扰素分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三类，IFN-α、IFN-β属于Ⅰ类干扰素，当病毒作用于机体细胞时，Ⅰ型干扰素在数小时内大量产生，作为机体防御系统中出现最早的细胞因子，在防止病毒在体内扩散的前期起着重要的作用。刘立民等通过体外实验研究发现黄芪多糖能显著提高浆细胞样树突状细胞分泌的IFN-α量，促进自身及其它细胞分泌细胞因子来抑制病毒的复制。胡克杰等研究表明精制双黄连气雾剂有诱导人外周白细胞产生IFN-α的作用。徐凯建等研究发现双黄连气雾剂和注射剂均能促进淋巴细胞产生IFN-α。本研究表明，戈戈健能诱导IPEC-1的IFN-α表达水平上升，并显著上调IFN-β mRNA表达水平；本草劲方能诱导IFN-α和IFN-β mRNA的表达水平显著上升，提示这两种中药制剂均能通过诱导IPEC-1产生Ⅰ型干扰素来抑制病毒的入侵及复制。
炎症细胞因子可分为促炎和抑炎细胞因子两大类，促炎细胞因子包括IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α和IFN-γ等，抑炎细胞因子包括IL-4、IL-10、IL-13、IL-14和TGF-β等。机体受到病原体感染后出现免疫应答，释放促炎细胞因子，引起机体炎症反应，阻止病毒进一步扩散，而抗炎细胞因子能防止过度炎症反应，从而避免组织器官严重损伤。刘立民等通过体外培养浆细胞样树突状细胞，用ELISA法检测出黄芪多糖能显著提高IL-6和TNF-α的分泌量，促进B细胞向浆细胞分化，提高免疫球蛋白的分泌量，从而增强机体抗感染的能力。邹云等通过饲养试验研究发现，添加黄芪多糖能显著提高断奶仔猪血清中的TNF含量，也能在一定程度上提高IL-6的含量。本实验结果显示，戈戈健能诱导抗炎因子IL-6、IL-8和TNF-α mRNA表达水平显著上升，具有一定的免疫增强作用，同时上调抑炎因子TGF-βmRNA表达以防止过度炎症。
TNF-α是由单核巨噬细胞分泌的一种多肽调节因子，能诱导IL-6、IL-8等一系列炎症介质的释放，导致机体产生炎症反应。贾鹰珏等用双黄连微乳剂治疗胸膜炎模型大鼠，研究发现，双黄连能显著降低大鼠胸腔渗出液中的TNF-α含量，对IL-8也有一定的抑制作用，提示双黄连具有抗炎作用。李安泰等研究发现双黄连注射液能通过降低血清和脑脊液中的炎症因子IL-6和TNF-α的表达水平来治疗病毒性脑炎。本研究表明，本草劲方能抑制促炎因子IL-6和TNF-α的产生，同时促进抑炎因子TGF-β的分泌，从而增强细胞的抗炎能力。
4小结
综上所述，戈戈健具有抗病毒、增强机体免疫的作用，本草劲方具有抗病毒、抗炎的作用，两种中药制剂均能用于预防和治疗猪场病毒病，值得在养殖生产实践中推广。