论文部分内容阅读
[摘要]目的：观察釉基质蛋白（enamel matrix proteins，EMPs）对牙龈间充质干细胞（human gingivalmesenchymal stem cells，hGMSCs）增殖和I型胶原合成的影响。方法：分离培养人牙龈成纤维细胞，免疫细胞化学方法检测其间充质干细胞特性STRO-1的表达，不同浓度EMPs，25mg/L（Al组）、50mg/L（A2组）、100mg/L（A3组）、200mg/L（A4组），对照组（AO组）10% FCS的DMEM溶液培养，MTT检测EMPs对细胞增殖活性的影响。免疫细胞化学方法鉴定细胞I型胶原合成和图像分析。结果：50～200mg/L表现出促hGMSCs增殖的作用，50mg/L EMPs即可以显著促进hGMSCs的生长，但以100mg/L EMPs的促增殖作用最强（与其余各组相比p﹤0.01），实验组胶原合成明显强于对照组。其中，lOOmg/L促I型胶原（collagen type I，COL I-合成最明显，且随时间变化。结论：EMP可促进hGMSCs增殖和I型胶原合成。
[关键词]牙龈间充质干细胞；EMP；I型胶原；增殖
[中图分类号]Q813.1
[文献标志码]A
[文章编号]1008-6455（2015）08-0030-04
成纤维细胞存在于人体的各种器官中，参与各种创伤的修复过程。近年来的研究认为成纤维细胞具有合成和改建胞外基质的功能，并在组织修复过程中发挥支架的支撑功能。参与器官发育、炎症反应、损伤修复和免疫调节，纤维化等多种疾病和和正常牛命过程，并具有干细胞特性。牙龈成纤维细胞是否也具有间充质干细胞特性，参与了牙周组织的冉牛修复，免疫调节和炎症反应过程？课题组分离牙龈成纤维细胞，鉴定其间充质T细胞标志的表达，并观察EMPs对其增殖和胶原合成的影响。初步分析hGMSCs在牙周冉牛中的作用。
1 材料和方法
1.1实验材料
a-MEM培养液，胎牛血清，胰蛋白酶，胶原酶（Gibco，美国），超净工作台（苏州净安泰空气技术有限公司），粗提型EMPs由第四军医大学口腔医院牙周科惠赠，C02孵箱（Heraeus，Germany），倒置相差显微镜照相系统（Olympus，日本），EMP （Biora，美国），兔抗人stro-1单克隆抗体，抗I型胶原抗体，MTT（Sigma，美国）SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德公司），DAB显色试剂盒（武汉博士德公司），HPIAS-1000彩色图像分析系统（同济医科大学千屏影像工程公司），倒置显微镜和照相系统（Olympus，日本）。
1.2 方法
1.2.1 hGMSCs培养：选取患者因正畸需要拔除的健康第一前磨牙牙龈组织。采用组织块培养法获取hGMSCs，当细胞长面瓶底80%时传代。
1.2.2 细胞来源鉴定：取对数牛长期的第二代人GMSCs制备细胞爬片（将牛长状态良好的F2代细胞接种至预先置有盖玻片的培养皿，待细胞牛长状态良好时终止培养。取出盖玻片，用O.Olmol/L PBS清洗3遍，多聚甲醛固定30min，将固定好的细胞爬片用O.Olmol/L PBS清洗3次，2.5ml/L TritonX- 100处理15min，正常羊血清37℃封闭（孵育）30min，甩去血清。滴加1∶200稀释的兔抗人STRO-1单克隆抗体，4℃湿盒过夜，37℃复温1h，PBS振洗3次，5min/次。滴加1∶50稀释的羊抗兔二抗，37℃孵育30min，PBS振洗3次，5min/次，DAB显色，苏木素胞核衬染，脱水封片。阴性对照用PBS代替一抗染色，其余步骤不变。
1.2.3 实验分组：实验组分别用含2% FCS的DMEM将EMPs溶解并配置成25 mg/L（Al组）、50mg/L（A2组）、100mg/L（A3组）、200mg/L（A4组）的4个浓度组培养。对照组（AO组）用含2%FCS的DMEM溶液培养。
1.2.4 含EMPs溶液培养细胞及制作细胞爬片：将牛长状态良好的F2代细胞制成细胞悬液，调整细胞密度为6×l04/L，接种于预先放置了盖玻片的24孔板，每孔加细胞悬液Iml，标准条件培养24h，细胞贴壁时换无血清DMEM培养液静息24h，按EMPs实验分组换相应培养液。在培养的第1天和第7天分别收集各组的细胞爬片，4%多聚甲醛固定，-20℃冻存备用。
1.2.3 MTT法检测不同浓度FMP对hGMSCs增殖的测定：取第3代GMSCs，2×l06/L接种于96孔板，每孔接种100μl细胞悬液。另设调零孔，加入100μl培养液。37℃，95%空气，5%CO2，100%湿度培养24h，待细胞贴壁，无血清DMEM培养液静息24h。按实验分组换相应含EMPs培养液，每组4孔，继续培养72h，每孔加MTT溶液20μl，标准条件下孵育6h，洗净孔内液体，每孔加DMS0 150μl，振荡lOmin，酶联免疫检测仪在490nm波长测吸光度值（A值）。
1.2.4 免疫细胞化学染色：将固定好的细胞爬片用0.Olmol/L PBS清洗3次，2.5ml/L Triton X-100处理15min，正常羊血清37℃封闭（孵育）30min，甩去血清。各组滴加抗I型胶原。4℃湿盒过夜，37℃复温th，PBS振洗3次，5min/次。滴加1∶50稀释的羊抗兔二抗，37℃孵育30min，PBS振洗3次，5min/次，DAB显色，苏木素胞核衬染，脱水封片。阴性对照用PBS代替一抗染色，其余步骤不变。
1.2.5 图像分析：利用HPIAS-1000彩色图像分析系统对染色标本进行图像分析，每张标本选取5个高倍视野（40×10倍），每个视野选取四个区域测定细胞染色灰度值。灰度值越小，表明其染色程度越深。本实验所列结果为同代细胞、同批次染色的结果。 1.2.6 数据统计分析：将测得的灰度值利用SPSS 16进行统计分析，数据以均数±标准差的形式表示，并进行方差分析和t检验。
2 结果
2.1 细胞形态及来源图
组织块法培养的人牙龈成纤维细胞呈长梭型，少量多角型细胞，细胞贴擘后牛长较快，另有上皮细胞散在组织块中央，多次差别消化法传代，上皮细胞明显减少，大部分细胞在为长梭型和多角型细胞（图1）。免疫细胞化学染色发现部分细胞STRO-1阳性着色（图2）。
2.2 不同浓度的EMPs对rMSCs生长的影响（A490值，x±s）
EMPs在50～200mg/L表现出促hGMSCs增殖的作用，50mg/L EMPs即可以显著促进hGMSCs的牛长，但以100mg/LEMPs的促增殖作用最强（表1）。
2. 31 型胶原图像分析及统计分析结果
不同浓度EMP作用GMSCs 1周时，与第1天相比，I型胶原表达差异具有统计学意义（P 3 讨论
间充质干细胞与成纤维细胞一样遍布牛物体的每个器官，近年来研究发现，成纤维细胞是一个具有多种功能的细胞，它与慢性炎症、肿瘤发牛，肿瘤包裹及损伤修复相关，与间充质干细胞具有许多相同的特点，如共同表达CD73，CD105，SSEA-1，SSEA-4不表达CD14，CD34 and CD45，可向骨、软骨和脂肪细胞分化。牙龈是牙周组织的门户，长期暴露在U腔中，不断受到炎症的侵袭和各种刺激，推测牙龈成纤维细胞在抵抗牙周疾病和牙周组织冉牛修复中具有一定的功能。EMPs的牙周冉牛作用已经得到临床和基础研究的肯定。研究认为EMPs对牙周膜细胞、牙囊细胞，骨髓细胞的牛物学功能具有重要作用，可以促进细胞增殖及蛋白合成，自分泌一些牛长因子而且可以促进细胞向成骨方向分化，促进小鼠成骨细胞I型胶原合成，但是有关EMPs对牙龈及其细胞成分的生物学作用研究较少。鉴于此，课题组分离牙龈成纤维细胞，免疫细胞化学染色观察细胞间充质干细胞特性，并用EMPs培养，通过免疫细胞化学和图像分析方法观察EMPs对hGMSCs增殖和合成I型胶原的影响，以期初步了解EMPs对hGMSCs的牛物学作用。
实验用组织块法分离培养了牙龈成纤维细胞，免疫细胞化学检测到牙龈成纤维细胞表达STRO-1，证实牙龈成纤维细胞具有间充质干细胞特性。STRO-1是间充质干细胞最重要的早期标志之一，是骨髓源间充质干细胞的分离标志，STRO-1阳性细胞具有向成纤维细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞和成骨成软骨等间充质来源细胞分化的特性，血管内皮细胞、牙髓干细胞及牙周膜干细胞均表达STRO-1，具有多向分化特性。
实验还观察了EMPs对hGMSCs增殖和合成胶原的影响。即从浓度上看，EMPs在50-200mg/L表现出促hGMSCs增殖的作用，50mg/L的EMPs即可以显著促进hGMSCs的牛长，但以lOOmg/L的EMPs促增殖作用最强，从实验结果可以看出，EMPs可以促进体外培养的hGMSCs合成I型胶原。I型胶原是重要的细胞外基质成分，可促进不同类型细胞牛长，I型胶原是结缔组织的丰要胶原蛋白成分，是牙齿硬组织、骨和软骨的丰要胶原类型，I型胶原的表达与成骨活动关系密切，其mRNA的出现早于碱性磷酸酶和骨钙素，是成骨细胞早期分化的特异性分子标记，可以调节骨钙素基因表达，是成骨标志性产物，I型胶原也是牙周膜的丰要胶原成分，在牙周膜细胞向成骨方向分化时，I型胶原明显增强。先前的研究表明牙龈成纤维细胞在矿化诱导条件下也可形成矿化结节，但较成骨细胞牙周膜细胞量少，时间长，这可能与其含有的间充质干细胞较少有关。成纤维细胞具有分泌多种细胞因子，维持间充质干细胞微环境的功能，这表明间充质干细胞与成纤维细胞相伴存在。成纤维细胞和间充质干细胞在牛物学特性上及其相似，具有许多共同特性，另外，间充质干细胞依赖成纤维细胞来维持微环境的稳定，根据需要与上皮细胞相互作用进行发育、分化、组织修复和器官形成等牛命活动。
其他部位的成纤维细胞也参与创伤修复，并能在诱导条件下向成骨方向分化，推测成纤维细胞与间充质干细胞具有相同特性，目前，只有从基因型分析间充质干细胞和成纤维细胞，从牛物学特性无法区分两种细胞。创伤修复是多种细胞、牛长因子和细胞外基质之间相互作用的复杂动态过程。在各种创伤的修复过程中，成纤维细胞均起着极其重要的作用。骨折作为机体的一种创伤，它的修复过程即骨折的愈合过程及其复杂，除成骨细胞在骨折愈合过程中发挥决定作用外，成纤维细胞起着重要的作用，并参与了成骨过程，饶寒敏等的实验证明，皮肤成纤维细胞在体外培养过程中可形成骨，并且其成骨过程中基质合成、分泌和钙盐沉积的程序与成骨细胞成骨基本一致，符合骨组织形成的牛理过程。这些研究均表明成纤维细胞与间充质干细胞具有极其相似的作用，成纤维细胞提供适宜的微环境，支持_厂细胞维持稳定和向不同方向分化的作用。
细胞外基质是细胞微环境传递促进细胞增殖、分化的信号分子，EMPs是Hertwig上皮根鞘分泌的釉质发育过程中未矿化釉质中含有的蛋白成分，研究表明EMPs可促进牙周膜细胞和成骨细胞向牙骨质和骨细胞分化，可影响多种细胞的基因表达、蛋白合成、增殖和分化过程，对牙龈成纤维细胞、成牙骨质细胞、软骨细胞核牙囊细胞具有促进增殖和抑制分化的作用。有报道称EMPs具有促进成纤维样细胞增殖而抑制上皮类细胞的作用，在牙周发育期调控细胞的行为，控制上皮间充质细胞的相互作用。近年来认为EMPs还具有促进皮肤等其他部位成纤维细胞的组织和胶原分泌作用。Vowden等研究证实成釉蛋白可促进较大面积难愈性溃疡的愈合。在创面愈合过程中，成纤维细胞大量增殖，并分泌胶原和基质成分，与新牛毛细血管等共同形成肉芽组织，填补组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件。本实验结果证实EMPs可促进人牙龈间充质干细胞的增殖和胶原分泌，一周观察期内可随时间增殖作用增强。这为牙龈间充质细胞的临床应用提供了理论依据，目前牙种植技术为患者带来了福音，但许多患者的软组织严重缺失，限制了种植的适应症，利用EMPs和GMSCs的特性形成组织工程牙龈，可提高种植的成功率和使用范围。
[关键词]牙龈间充质干细胞；EMP；I型胶原；增殖
[中图分类号]Q813.1
[文献标志码]A
[文章编号]1008-6455（2015）08-0030-04
成纤维细胞存在于人体的各种器官中，参与各种创伤的修复过程。近年来的研究认为成纤维细胞具有合成和改建胞外基质的功能，并在组织修复过程中发挥支架的支撑功能。参与器官发育、炎症反应、损伤修复和免疫调节，纤维化等多种疾病和和正常牛命过程，并具有干细胞特性。牙龈成纤维细胞是否也具有间充质干细胞特性，参与了牙周组织的冉牛修复，免疫调节和炎症反应过程？课题组分离牙龈成纤维细胞，鉴定其间充质T细胞标志的表达，并观察EMPs对其增殖和胶原合成的影响。初步分析hGMSCs在牙周冉牛中的作用。
1 材料和方法
1.1实验材料
a-MEM培养液，胎牛血清，胰蛋白酶，胶原酶（Gibco，美国），超净工作台（苏州净安泰空气技术有限公司），粗提型EMPs由第四军医大学口腔医院牙周科惠赠，C02孵箱（Heraeus，Germany），倒置相差显微镜照相系统（Olympus，日本），EMP （Biora，美国），兔抗人stro-1单克隆抗体，抗I型胶原抗体，MTT（Sigma，美国）SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德公司），DAB显色试剂盒（武汉博士德公司），HPIAS-1000彩色图像分析系统（同济医科大学千屏影像工程公司），倒置显微镜和照相系统（Olympus，日本）。
1.2 方法
1.2.1 hGMSCs培养：选取患者因正畸需要拔除的健康第一前磨牙牙龈组织。采用组织块培养法获取hGMSCs，当细胞长面瓶底80%时传代。
1.2.2 细胞来源鉴定：取对数牛长期的第二代人GMSCs制备细胞爬片（将牛长状态良好的F2代细胞接种至预先置有盖玻片的培养皿，待细胞牛长状态良好时终止培养。取出盖玻片，用O.Olmol/L PBS清洗3遍，多聚甲醛固定30min，将固定好的细胞爬片用O.Olmol/L PBS清洗3次，2.5ml/L TritonX- 100处理15min，正常羊血清37℃封闭（孵育）30min，甩去血清。滴加1∶200稀释的兔抗人STRO-1单克隆抗体，4℃湿盒过夜，37℃复温1h，PBS振洗3次，5min/次。滴加1∶50稀释的羊抗兔二抗，37℃孵育30min，PBS振洗3次，5min/次，DAB显色，苏木素胞核衬染，脱水封片。阴性对照用PBS代替一抗染色，其余步骤不变。
1.2.3 实验分组：实验组分别用含2% FCS的DMEM将EMPs溶解并配置成25 mg/L（Al组）、50mg/L（A2组）、100mg/L（A3组）、200mg/L（A4组）的4个浓度组培养。对照组（AO组）用含2%FCS的DMEM溶液培养。
1.2.4 含EMPs溶液培养细胞及制作细胞爬片：将牛长状态良好的F2代细胞制成细胞悬液，调整细胞密度为6×l04/L，接种于预先放置了盖玻片的24孔板，每孔加细胞悬液Iml，标准条件培养24h，细胞贴壁时换无血清DMEM培养液静息24h，按EMPs实验分组换相应培养液。在培养的第1天和第7天分别收集各组的细胞爬片，4%多聚甲醛固定，-20℃冻存备用。
1.2.3 MTT法检测不同浓度FMP对hGMSCs增殖的测定：取第3代GMSCs，2×l06/L接种于96孔板，每孔接种100μl细胞悬液。另设调零孔，加入100μl培养液。37℃，95%空气，5%CO2，100%湿度培养24h，待细胞贴壁，无血清DMEM培养液静息24h。按实验分组换相应含EMPs培养液，每组4孔，继续培养72h，每孔加MTT溶液20μl，标准条件下孵育6h，洗净孔内液体，每孔加DMS0 150μl，振荡lOmin，酶联免疫检测仪在490nm波长测吸光度值（A值）。
1.2.4 免疫细胞化学染色：将固定好的细胞爬片用0.Olmol/L PBS清洗3次，2.5ml/L Triton X-100处理15min，正常羊血清37℃封闭（孵育）30min，甩去血清。各组滴加抗I型胶原。4℃湿盒过夜，37℃复温th，PBS振洗3次，5min/次。滴加1∶50稀释的羊抗兔二抗，37℃孵育30min，PBS振洗3次，5min/次，DAB显色，苏木素胞核衬染，脱水封片。阴性对照用PBS代替一抗染色，其余步骤不变。
1.2.5 图像分析：利用HPIAS-1000彩色图像分析系统对染色标本进行图像分析，每张标本选取5个高倍视野（40×10倍），每个视野选取四个区域测定细胞染色灰度值。灰度值越小，表明其染色程度越深。本实验所列结果为同代细胞、同批次染色的结果。 1.2.6 数据统计分析：将测得的灰度值利用SPSS 16进行统计分析，数据以均数±标准差的形式表示，并进行方差分析和t检验。
2 结果
2.1 细胞形态及来源图
组织块法培养的人牙龈成纤维细胞呈长梭型，少量多角型细胞，细胞贴擘后牛长较快，另有上皮细胞散在组织块中央，多次差别消化法传代，上皮细胞明显减少，大部分细胞在为长梭型和多角型细胞（图1）。免疫细胞化学染色发现部分细胞STRO-1阳性着色（图2）。
2.2 不同浓度的EMPs对rMSCs生长的影响（A490值，x±s）
EMPs在50～200mg/L表现出促hGMSCs增殖的作用，50mg/L EMPs即可以显著促进hGMSCs的牛长，但以100mg/LEMPs的促增殖作用最强（表1）。
2. 31 型胶原图像分析及统计分析结果
不同浓度EMP作用GMSCs 1周时，与第1天相比，I型胶原表达差异具有统计学意义（P
间充质干细胞与成纤维细胞一样遍布牛物体的每个器官，近年来研究发现，成纤维细胞是一个具有多种功能的细胞，它与慢性炎症、肿瘤发牛，肿瘤包裹及损伤修复相关，与间充质干细胞具有许多相同的特点，如共同表达CD73，CD105，SSEA-1，SSEA-4不表达CD14，CD34 and CD45，可向骨、软骨和脂肪细胞分化。牙龈是牙周组织的门户，长期暴露在U腔中，不断受到炎症的侵袭和各种刺激，推测牙龈成纤维细胞在抵抗牙周疾病和牙周组织冉牛修复中具有一定的功能。EMPs的牙周冉牛作用已经得到临床和基础研究的肯定。研究认为EMPs对牙周膜细胞、牙囊细胞，骨髓细胞的牛物学功能具有重要作用，可以促进细胞增殖及蛋白合成，自分泌一些牛长因子而且可以促进细胞向成骨方向分化，促进小鼠成骨细胞I型胶原合成，但是有关EMPs对牙龈及其细胞成分的生物学作用研究较少。鉴于此，课题组分离牙龈成纤维细胞，免疫细胞化学染色观察细胞间充质干细胞特性，并用EMPs培养，通过免疫细胞化学和图像分析方法观察EMPs对hGMSCs增殖和合成I型胶原的影响，以期初步了解EMPs对hGMSCs的牛物学作用。
实验用组织块法分离培养了牙龈成纤维细胞，免疫细胞化学检测到牙龈成纤维细胞表达STRO-1，证实牙龈成纤维细胞具有间充质干细胞特性。STRO-1是间充质干细胞最重要的早期标志之一，是骨髓源间充质干细胞的分离标志，STRO-1阳性细胞具有向成纤维细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞和成骨成软骨等间充质来源细胞分化的特性，血管内皮细胞、牙髓干细胞及牙周膜干细胞均表达STRO-1，具有多向分化特性。
实验还观察了EMPs对hGMSCs增殖和合成胶原的影响。即从浓度上看，EMPs在50-200mg/L表现出促hGMSCs增殖的作用，50mg/L的EMPs即可以显著促进hGMSCs的牛长，但以lOOmg/L的EMPs促增殖作用最强，从实验结果可以看出，EMPs可以促进体外培养的hGMSCs合成I型胶原。I型胶原是重要的细胞外基质成分，可促进不同类型细胞牛长，I型胶原是结缔组织的丰要胶原蛋白成分，是牙齿硬组织、骨和软骨的丰要胶原类型，I型胶原的表达与成骨活动关系密切，其mRNA的出现早于碱性磷酸酶和骨钙素，是成骨细胞早期分化的特异性分子标记，可以调节骨钙素基因表达，是成骨标志性产物，I型胶原也是牙周膜的丰要胶原成分，在牙周膜细胞向成骨方向分化时，I型胶原明显增强。先前的研究表明牙龈成纤维细胞在矿化诱导条件下也可形成矿化结节，但较成骨细胞牙周膜细胞量少，时间长，这可能与其含有的间充质干细胞较少有关。成纤维细胞具有分泌多种细胞因子，维持间充质干细胞微环境的功能，这表明间充质干细胞与成纤维细胞相伴存在。成纤维细胞和间充质干细胞在牛物学特性上及其相似，具有许多共同特性，另外，间充质干细胞依赖成纤维细胞来维持微环境的稳定，根据需要与上皮细胞相互作用进行发育、分化、组织修复和器官形成等牛命活动。
其他部位的成纤维细胞也参与创伤修复，并能在诱导条件下向成骨方向分化，推测成纤维细胞与间充质干细胞具有相同特性，目前，只有从基因型分析间充质干细胞和成纤维细胞，从牛物学特性无法区分两种细胞。创伤修复是多种细胞、牛长因子和细胞外基质之间相互作用的复杂动态过程。在各种创伤的修复过程中，成纤维细胞均起着极其重要的作用。骨折作为机体的一种创伤，它的修复过程即骨折的愈合过程及其复杂，除成骨细胞在骨折愈合过程中发挥决定作用外，成纤维细胞起着重要的作用，并参与了成骨过程，饶寒敏等的实验证明，皮肤成纤维细胞在体外培养过程中可形成骨，并且其成骨过程中基质合成、分泌和钙盐沉积的程序与成骨细胞成骨基本一致，符合骨组织形成的牛理过程。这些研究均表明成纤维细胞与间充质干细胞具有极其相似的作用，成纤维细胞提供适宜的微环境，支持_厂细胞维持稳定和向不同方向分化的作用。
细胞外基质是细胞微环境传递促进细胞增殖、分化的信号分子，EMPs是Hertwig上皮根鞘分泌的釉质发育过程中未矿化釉质中含有的蛋白成分，研究表明EMPs可促进牙周膜细胞和成骨细胞向牙骨质和骨细胞分化，可影响多种细胞的基因表达、蛋白合成、增殖和分化过程，对牙龈成纤维细胞、成牙骨质细胞、软骨细胞核牙囊细胞具有促进增殖和抑制分化的作用。有报道称EMPs具有促进成纤维样细胞增殖而抑制上皮类细胞的作用，在牙周发育期调控细胞的行为，控制上皮间充质细胞的相互作用。近年来认为EMPs还具有促进皮肤等其他部位成纤维细胞的组织和胶原分泌作用。Vowden等研究证实成釉蛋白可促进较大面积难愈性溃疡的愈合。在创面愈合过程中，成纤维细胞大量增殖，并分泌胶原和基质成分，与新牛毛细血管等共同形成肉芽组织，填补组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件。本实验结果证实EMPs可促进人牙龈间充质干细胞的增殖和胶原分泌，一周观察期内可随时间增殖作用增强。这为牙龈间充质细胞的临床应用提供了理论依据，目前牙种植技术为患者带来了福音，但许多患者的软组织严重缺失，限制了种植的适应症，利用EMPs和GMSCs的特性形成组织工程牙龈，可提高种植的成功率和使用范围。