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【摘要】
目的：桑椹是既是食用又是药用的水果之一，具有很高的营养价值，本文对它所含的抗氧化活性成分进行了研究。方法：新鲜桑椹的甲醇提取物用乙酸乙酯萃取后，通过硅胶柱层析、薄层层析等进行分离，得到的馏分用DPPH法测定其抗氧化活性。 结果：经过两次分离，各得到12个和7个馏分，大部分的馏分显示出了很强的抗氧化活性。 结论：日常食用的药食两用水果桑椹中含有抗氧化活性成分，可以通过日常饮食的摄入达到抗氧化的目的。
【关键词】桑椹；抗氧化活性；DPPH法
Preliminary Study on Antioxidative Activity of Mulberry
Wang RongWu Tong
【Abstract】 ObjectiveMulberry is one of both edible and medicinal fruits with high nutrition. The antioxidative components were isolated and analyzed. MethodThe fresh mulberry were extracted with methanol, and after concentration under reduced pressure, the aqueous residue was partitioned with EtOAc to give EtOAc extract. After isolated and purified by a silica gel column and thin layer chromatography, gained fractions were supplied to measure the antioxidative activity by DPPH method. Result12 fractions and 7 fractions were gained after isolated twice. Most of the fractions showed the very strong antioxidative activity. ConclusionThere are antioxidative components in mulberry, and antioxidation can be achieved by intake of mulberry.
【Key words】 mulberry; antioxidative activity; DPPH method
【中图分类号】R431 【文献标识码】B 【文章编号】1005-0515(2011)10-0419-02
桑椹，又名桑果、桑子，味甘、性寒，具有生津止渴、滋阴补血、补肝益肾、固精安胎、乌须黑发、聪耳明目、安神养心、润肠通便、健步履、利关节、去风湿、解酒等功效，常用于医治糖尿病、肝肾阴虚、失眠耳鸣、津液不足、风湿、便秘、须发早白、神经衰弱［1］等。现代医学研究发现，桑椹还具有防癌抗诱变、增强免疫力、驻颜抗衰老、促进造血细胞生长、降低血糖血脂［2］等方面的保健功能。本研究旨在通过提取桑椹鲜果中的抗氧化活性物质，利用DPPH法测定各馏分的抗氧化活性。
1材料与方法
1.1材料。
作为实验材料的桑椹为济南近郊所产的水果，从济南市果品批发市场购得。
1.2仪器。
SB-1000型旋转蒸发仪：上海爱明仪器有限公司；UV754紫外可见分光光度计、FA2004B型电子天平：上海精密科学仪器有限公司；SHB—Ⅲ循环水式多用真空水泵：郑州长城科工贸有限公司；ZF7C三用紫外分析仪：上海康华生化仪器制造有限公司。
1.3 试剂。
DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)：Alfa Aesar公司；无水乙醇、硫酸：莱阳市康德化工有限公司；甲醇、正己烷：天津市广成化学试剂有限公司；三氯甲烷：天津市北方天医化学试剂厂；乙酸乙酯：天津市富宇精细化工有限公司；正丁醇、冰乙酸：天津市化学试剂三厂；硅胶：青岛海浪硅胶干燥剂厂；试剂均为分析纯。
1.4方法
1.4.1 桑椹活性成分的提取。
将10千克新鲜的紫红色桑椹放入容器中，加入10升甲醇溶液，室溫下避光放置两天。用过滤瓶和砂芯漏斗抽滤后得到桑椹的初提液，暂放在棕色玻璃瓶中冷藏保存。再次将10升甲醇溶液加入盛有桑椹的容器中，放置一天，进行第二次提取。将两次的提取液混合，用旋转蒸发仪进行减压浓缩，得到桑椹的甲醇粗提水溶液。
将桑椹的甲醇粗提水溶液用乙酸乙酯萃取，得到190克桑椹乙酸乙酯提取物，将其溶解在50毫升的乙酸乙酯中，放入棕色瓶中在冰箱中保存待用。
1.4.2 玻璃柱层析法分离桑椹活性成分。
其中一部分的乙酸乙酯提取物（2.5g）经过硅胶色谱柱（40×2cm i.d.），用正己烷-乙酸乙酯-甲醇溶液按比例洗提，溶出12馏分。50%和100%甲醇馏分（0.5g）又进一步经过硅胶色谱柱（30×1.5 cm i.d.），用三氯甲烷-甲醇溶液洗提，得到7馏分。
1.4.3薄层层析法（thin layer chromatography，TLC）分离桑椹活性成分。
将各馏分用毛细管均匀地点在薄层层析板上，放入展开槽中进行分离。待分离完毕后，用含5%硫酸的乙醇溶液喷雾后加热，并计算分离成分的Rf值。
1.4.4 抗氧化活性的测定（DPPH法）。
DPPH·是一种人工合成的稳定自由基，在无水乙醇中呈紫色，于517nm处有强吸收。当有自由基清除剂存在时，DPPH·浓度减小而使其颜色减退，褪色程度与清除剂的能力及数量呈一定的关系。因而可用分光光度法进行定量测定、分析，从而评价所研究的物质的抗氧化活性的能力［3］。
准确称取0.0992克DPPH，用无水乙醇定溶于100毫升的容量瓶中摇匀，作为储备液。使用时取8毫升DPPH储备液，用无水乙醇定溶于100毫升的容量瓶中摇匀待测。
取提取物和DPPH溶液各2毫升加入试管中，摇匀记做Ai；取提取物和无水乙醇各2毫升加入试管，摇匀记做Aj； 取DPPH溶液和无水乙醇各2毫升加入试管，摇匀记做Ac。室温下放置30分钟，然后用分光光度计在517nm下测定各种溶液的吸光度，并按下列公式计算清除率。
清除率=1-［(Ai-Aj)÷Ac］×100%
2 结果与分析
2.1 活性成分的分离:
2.5克的桑椹乙酸乙酯提取物用正己烷—乙酸乙酯—甲醇按下表中的比例洗脱后得到了12个馏分，通过减压浓缩后得到了各馏分样品的重量（见表1）。
表1 桑椹乙酸乙酯提取物柱层析各馏分
馏分号
正己烷（%）
乙酸乙酯（%）
甲醇
样品质量（g）
颜色
1
100
0
—
—
无色
2
90
10
—
0.55
浅黄
3
80
20
—
0.12
浅黄
4
70
30
—
0.18
黄
5
60
40
—
0.11
黄绿
6
50
50
—
0.05
黑绿
7
30
70
—
0.07
深绿
8
0
100
—
0.29
黄绿
9
—
90
10
0.17
浅红
10
—
80
20
0.29
红
11
—
50
50
0.23
深红
12
—
0
100
0.23
深红
第11和12号馏分即50%和100%甲醇馏分混合在一起得到0.5克的物质，用50毫升的三氯甲烷—甲醇按下表中的比例进行洗脱，并接收各馏分，得到了7个馏分，通过减压浓缩后得到了各馏分样品的重量（见表2）。
表2 第11号和12号馏分混合物柱层析各馏分
馏分号
三氯甲烷（%）
甲醇（%）
样品质量（g）
颜色
1
100
0
—
无色
2
95
5
0.08
浅黄
3
90
10
0.11
墨绿
4
80
20
0.06
深绿
5
50
50
0.16
黄绿
6
30
70
0.17
浅红
7
0
100
0.12
红
2.2 TLC的结果:在薄层层析的分析中，正丁醇：冰乙酸：水=4：1：5展开剂中第10号馏分显示了一个橘黄色的圆点，Rf=0.83。
2.3 抗氧化活性:
桑椹乙酸乙酯提取物12馏分用DPPH法检测抗氧化活性，通过计算，得出各馏分对DPPH的清除率（见表3）。
表3 桑椹柱层析各馏分的抗氧化活性
馏分号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
清除率%
—
22.8
88.7
96
93
96
95
93.8
90
92
96.7
96.6
第二次柱层析的7个馏分也用DPPH法检测了抗氧化活性，通过计算，得出各馏分对DPPH的清除率（见表4）。
表4 第二次柱层析各馏分的抗氧化活性
馏分号 12 3 4 567
清除率% — 25.5 29.993.310096.1 93.8
3讨论
表3中数据显示，除了馏分2的活性很小以外，其他馏分都显示了较强的抗氧化活性，其中馏分4、6、7、11、12的DPPH清除率达到95%以上，说明桑椹中所含有的大多数物质具有很强的抗氧化活性。薄层层析的结果表明，馏分10只含有一个单一的物质，可进一步纯化，得到纯品后通过其他仪器分析确定其成分。表4结果显示，馏分4、5、6、7的DPPH清除率达到90%以上，特别是第5个馏分，显示了100%的清除率，说明桑椹中含有强抗氧化的物质。
随着物质文明程度的提高、社会和科技的不断发展和进步，人们开始追求食品对健康的促进作用和对机体的生理调节功能，进而达到健康和预防疾病的目的。生物的抗氧化能力与其抗病、抗逆性及延缓衰老密切相关，因此从天然植物中寻找有效的抗氧化剂是当前的研究热点。桑椹的化学成分含有游离氨基酸、维生素、矿物质、挥发性油、生物碱和黄酮类等，具有调节免疫、促进造血细胞生长、抗诱变、降血糖、降血脂、护肝等药理作用［4］。通过研究桑椹的抗氧化性，寻找有效的抗氧化物质应用于医药、食品和保健品等之中，给机体补充适当的外源抗氧化剂，可以改善老年人的衰老以及疾病的情况。抗氧化剂作为一种重要的食品添加剂，用于防止食品因氧化而使营养损坏、褐变、褪色等，并能够阻止或延缓油脂的自动氧化，对人类的健康和生活都具有很大的意义。
参考文献
［1］ 欧明.汉英常用中藥手册［M］.广州：广东科技出版社，1992，432.
［2］王颢蓉.桑椹果汁饮料的加工工艺［J］.安徽农业科学，2005，33(1)：112，131.
［3］王金华，曾海英，秦礼庚.乌洋芋色素抑菌活性与清除DPPH·能力研究［J］.食品科学，2007，28(9)：107-110.
［4］施青红，王向阳.桑椹的功能成分及药理作用［J］.食品与机械，2007，7(4)：153-162.
目的：桑椹是既是食用又是药用的水果之一，具有很高的营养价值，本文对它所含的抗氧化活性成分进行了研究。方法：新鲜桑椹的甲醇提取物用乙酸乙酯萃取后，通过硅胶柱层析、薄层层析等进行分离，得到的馏分用DPPH法测定其抗氧化活性。 结果：经过两次分离，各得到12个和7个馏分，大部分的馏分显示出了很强的抗氧化活性。 结论：日常食用的药食两用水果桑椹中含有抗氧化活性成分，可以通过日常饮食的摄入达到抗氧化的目的。
【关键词】桑椹；抗氧化活性；DPPH法
Preliminary Study on Antioxidative Activity of Mulberry
Wang RongWu Tong
【Abstract】 ObjectiveMulberry is one of both edible and medicinal fruits with high nutrition. The antioxidative components were isolated and analyzed. MethodThe fresh mulberry were extracted with methanol, and after concentration under reduced pressure, the aqueous residue was partitioned with EtOAc to give EtOAc extract. After isolated and purified by a silica gel column and thin layer chromatography, gained fractions were supplied to measure the antioxidative activity by DPPH method. Result12 fractions and 7 fractions were gained after isolated twice. Most of the fractions showed the very strong antioxidative activity. ConclusionThere are antioxidative components in mulberry, and antioxidation can be achieved by intake of mulberry.
【Key words】 mulberry; antioxidative activity; DPPH method
【中图分类号】R431 【文献标识码】B 【文章编号】1005-0515(2011)10-0419-02
桑椹，又名桑果、桑子，味甘、性寒，具有生津止渴、滋阴补血、补肝益肾、固精安胎、乌须黑发、聪耳明目、安神养心、润肠通便、健步履、利关节、去风湿、解酒等功效，常用于医治糖尿病、肝肾阴虚、失眠耳鸣、津液不足、风湿、便秘、须发早白、神经衰弱［1］等。现代医学研究发现，桑椹还具有防癌抗诱变、增强免疫力、驻颜抗衰老、促进造血细胞生长、降低血糖血脂［2］等方面的保健功能。本研究旨在通过提取桑椹鲜果中的抗氧化活性物质，利用DPPH法测定各馏分的抗氧化活性。
1材料与方法
1.1材料。
作为实验材料的桑椹为济南近郊所产的水果，从济南市果品批发市场购得。
1.2仪器。
SB-1000型旋转蒸发仪：上海爱明仪器有限公司；UV754紫外可见分光光度计、FA2004B型电子天平：上海精密科学仪器有限公司；SHB—Ⅲ循环水式多用真空水泵：郑州长城科工贸有限公司；ZF7C三用紫外分析仪：上海康华生化仪器制造有限公司。
1.3 试剂。
DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)：Alfa Aesar公司；无水乙醇、硫酸：莱阳市康德化工有限公司；甲醇、正己烷：天津市广成化学试剂有限公司；三氯甲烷：天津市北方天医化学试剂厂；乙酸乙酯：天津市富宇精细化工有限公司；正丁醇、冰乙酸：天津市化学试剂三厂；硅胶：青岛海浪硅胶干燥剂厂；试剂均为分析纯。
1.4方法
1.4.1 桑椹活性成分的提取。
将10千克新鲜的紫红色桑椹放入容器中，加入10升甲醇溶液，室溫下避光放置两天。用过滤瓶和砂芯漏斗抽滤后得到桑椹的初提液，暂放在棕色玻璃瓶中冷藏保存。再次将10升甲醇溶液加入盛有桑椹的容器中，放置一天，进行第二次提取。将两次的提取液混合，用旋转蒸发仪进行减压浓缩，得到桑椹的甲醇粗提水溶液。
将桑椹的甲醇粗提水溶液用乙酸乙酯萃取，得到190克桑椹乙酸乙酯提取物，将其溶解在50毫升的乙酸乙酯中，放入棕色瓶中在冰箱中保存待用。
1.4.2 玻璃柱层析法分离桑椹活性成分。
其中一部分的乙酸乙酯提取物（2.5g）经过硅胶色谱柱（40×2cm i.d.），用正己烷-乙酸乙酯-甲醇溶液按比例洗提，溶出12馏分。50%和100%甲醇馏分（0.5g）又进一步经过硅胶色谱柱（30×1.5 cm i.d.），用三氯甲烷-甲醇溶液洗提，得到7馏分。
1.4.3薄层层析法（thin layer chromatography，TLC）分离桑椹活性成分。
将各馏分用毛细管均匀地点在薄层层析板上，放入展开槽中进行分离。待分离完毕后，用含5%硫酸的乙醇溶液喷雾后加热，并计算分离成分的Rf值。
1.4.4 抗氧化活性的测定（DPPH法）。
DPPH·是一种人工合成的稳定自由基，在无水乙醇中呈紫色，于517nm处有强吸收。当有自由基清除剂存在时，DPPH·浓度减小而使其颜色减退，褪色程度与清除剂的能力及数量呈一定的关系。因而可用分光光度法进行定量测定、分析，从而评价所研究的物质的抗氧化活性的能力［3］。
准确称取0.0992克DPPH，用无水乙醇定溶于100毫升的容量瓶中摇匀，作为储备液。使用时取8毫升DPPH储备液，用无水乙醇定溶于100毫升的容量瓶中摇匀待测。
取提取物和DPPH溶液各2毫升加入试管中，摇匀记做Ai；取提取物和无水乙醇各2毫升加入试管，摇匀记做Aj； 取DPPH溶液和无水乙醇各2毫升加入试管，摇匀记做Ac。室温下放置30分钟，然后用分光光度计在517nm下测定各种溶液的吸光度，并按下列公式计算清除率。
清除率=1-［(Ai-Aj)÷Ac］×100%
2 结果与分析
2.1 活性成分的分离:
2.5克的桑椹乙酸乙酯提取物用正己烷—乙酸乙酯—甲醇按下表中的比例洗脱后得到了12个馏分，通过减压浓缩后得到了各馏分样品的重量（见表1）。
表1 桑椹乙酸乙酯提取物柱层析各馏分
馏分号
正己烷（%）
乙酸乙酯（%）
甲醇
样品质量（g）
颜色
1
100
0
—
—
无色
2
90
10
—
0.55
浅黄
3
80
20
—
0.12
浅黄
4
70
30
—
0.18
黄
5
60
40
—
0.11
黄绿
6
50
50
—
0.05
黑绿
7
30
70
—
0.07
深绿
8
0
100
—
0.29
黄绿
9
—
90
10
0.17
浅红
10
—
80
20
0.29
红
11
—
50
50
0.23
深红
12
—
0
100
0.23
深红
第11和12号馏分即50%和100%甲醇馏分混合在一起得到0.5克的物质，用50毫升的三氯甲烷—甲醇按下表中的比例进行洗脱，并接收各馏分，得到了7个馏分，通过减压浓缩后得到了各馏分样品的重量（见表2）。
表2 第11号和12号馏分混合物柱层析各馏分
馏分号
三氯甲烷（%）
甲醇（%）
样品质量（g）
颜色
1
100
0
—
无色
2
95
5
0.08
浅黄
3
90
10
0.11
墨绿
4
80
20
0.06
深绿
5
50
50
0.16
黄绿
6
30
70
0.17
浅红
7
0
100
0.12
红
2.2 TLC的结果:在薄层层析的分析中，正丁醇：冰乙酸：水=4：1：5展开剂中第10号馏分显示了一个橘黄色的圆点，Rf=0.83。
2.3 抗氧化活性:
桑椹乙酸乙酯提取物12馏分用DPPH法检测抗氧化活性，通过计算，得出各馏分对DPPH的清除率（见表3）。
表3 桑椹柱层析各馏分的抗氧化活性
馏分号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
清除率%
—
22.8
88.7
96
93
96
95
93.8
90
92
96.7
96.6
第二次柱层析的7个馏分也用DPPH法检测了抗氧化活性，通过计算，得出各馏分对DPPH的清除率（见表4）。
表4 第二次柱层析各馏分的抗氧化活性
馏分号 12 3 4 567
清除率% — 25.5 29.993.310096.1 93.8
3讨论
表3中数据显示，除了馏分2的活性很小以外，其他馏分都显示了较强的抗氧化活性，其中馏分4、6、7、11、12的DPPH清除率达到95%以上，说明桑椹中所含有的大多数物质具有很强的抗氧化活性。薄层层析的结果表明，馏分10只含有一个单一的物质，可进一步纯化，得到纯品后通过其他仪器分析确定其成分。表4结果显示，馏分4、5、6、7的DPPH清除率达到90%以上，特别是第5个馏分，显示了100%的清除率，说明桑椹中含有强抗氧化的物质。
随着物质文明程度的提高、社会和科技的不断发展和进步，人们开始追求食品对健康的促进作用和对机体的生理调节功能，进而达到健康和预防疾病的目的。生物的抗氧化能力与其抗病、抗逆性及延缓衰老密切相关，因此从天然植物中寻找有效的抗氧化剂是当前的研究热点。桑椹的化学成分含有游离氨基酸、维生素、矿物质、挥发性油、生物碱和黄酮类等，具有调节免疫、促进造血细胞生长、抗诱变、降血糖、降血脂、护肝等药理作用［4］。通过研究桑椹的抗氧化性，寻找有效的抗氧化物质应用于医药、食品和保健品等之中，给机体补充适当的外源抗氧化剂，可以改善老年人的衰老以及疾病的情况。抗氧化剂作为一种重要的食品添加剂，用于防止食品因氧化而使营养损坏、褐变、褪色等，并能够阻止或延缓油脂的自动氧化，对人类的健康和生活都具有很大的意义。
参考文献
［1］ 欧明.汉英常用中藥手册［M］.广州：广东科技出版社，1992，432.
［2］王颢蓉.桑椹果汁饮料的加工工艺［J］.安徽农业科学，2005，33(1)：112，131.
［3］王金华，曾海英，秦礼庚.乌洋芋色素抑菌活性与清除DPPH·能力研究［J］.食品科学，2007，28(9)：107-110.
［4］施青红，王向阳.桑椹的功能成分及药理作用［J］.食品与机械，2007，7(4)：153-162.