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摘 要：本实验对红花中羟基红花黄色素A的纯化工艺进行研究。分别采用聚酰胺复合膜NF270-400、聚酰胺复合膜NF200-400、聚酰胺复合膜NF90-400进行纯化实验。实验结果表明采用聚酰胺复合膜NF200-400效果最好。本工艺稳定、可行、收率高。
关键词：红花；纯化；工艺
红花别名为红蓝花（《金匮要略》），红蓝（崔豹《古今注》），红花草（《履巉岩本草》），刺红花（《四州中药志》），草红花（《陕西中药志》），黄蓝（《博物志》），红花菜（《救荒本草》）。
红花具有活血通经，去瘀止痛的功效。红花常用于治疗经闭、难产、死胎、产后恶露不行、瘀血作痛、跌扑损伤等[1-2]。《开宝本草》记载：“主产后血运口噤，腹内恶血不尽、绞痛，胎死腹中，并酒煮服。亦主蛊毒下血。”红花含有红花甙（carthamin）、前红花甙（precarthamin）、红花黄色素（safflow yellow）A、绿原酸（chlorogenic acid）、儿茶酚（cate-chol）、焦性儿茶酚（pyrocatechol）、2-已醇（2-hexanol），（E）-2-已烯醛〔（E）-2-hexenal〕、对二甲苯（p-xylene）、1，2，3-三甲氧基-5-甲基苯（1，2，3-TCMLIBimethoxy-5-methylbenzene）、α-柏木烯（α-cedrene）、葎草烯（humulene）等成分。羟基红花黄色素A是红花药理功效的最有效水溶性部位，是红花黄色素的活血化瘀有效成分[3-5]。本实验对红花中羟基红花黄色素A的纯化工艺进行研究。
1 仪器与试药
WP-UP-Ⅲ-20精密型实验室专用超纯水机（四川沃特尔水处理设备有限公司）；科捷仪器LC600A液相色谱仪（南京科捷分析仪器有限公司）；LC-10B系列液相色谱仪（杭州科晓化工仪器设备有限公司）；Lanbo恒温柱温箱（天津市兰博实验仪器设备有限公司）；Cascada BIO 实验室超纯水系统（颇尔过滤器（北京）有限公司）；英国Grant冷冻离心机PCV-3000 PCV-4200R（深圳市标远科学仪器有限公司）；GLITRING-6实验室清洗机（北京嘉信怡达科技有限公司）；上海舜宇恒平AE124C内校电子分析天平（北京联合科仪科技有限公司）。羟基红花黄色素A对照品（中国药品生物制品检定所提供）。乙腈（上海甲美精细化工有限公司）；盐酸（常州通诚化工有限公司）；磷酸（天津博达盛业化工产品有限公司）；甲醇（上海甲美精细化工有限公司）；氢氧化钠（常州通诚化工有限公司）。
2 方法与结果
2.1 提取
按处方称取药材，至于圆底烧瓶內，分别提取三次，第一次加12倍的蒸馏水（用盐酸调PH值为3），60摄氏度提取60分钟，过滤，合并滤液，用氢氧化钠调PH值为7，减压浓缩；第二次加10倍的蒸馏水（用盐酸调PH 值为3），60摄氏度提取50分钟，过滤，合并滤液，用氢氧化钠调PH值为7，减压浓缩；第二次加8倍的蒸馏水（用盐酸调PH值为3），60摄氏度提取40分钟，过滤，合并滤液，用氢氧化钠调PH值为7，减压浓缩，合并三次浓缩液混匀。采用高效液相测定浓缩膏中羟基红花黄色素A含量并计算羟基红花黄色素A收率。
2.2 纯化
分别采用聚酰胺复合膜NF270-400、聚酰胺复合膜NF200-400、聚酰胺复合膜NF90-400进行纯化实验。聚酰胺复合膜NF270-400切割分子量为1000、聚酰胺复合膜NF200-400切割分子量为600、聚酰胺复合膜NF90-400切割分子量为300。红花中羟基红花黄色素纯化结果见表1。
3 含量测定方法
3.1 色谱条件
色谱柱为Waters SunFire C18液相色谱柱（规格250×4.6mm，5um）；甲醇-水-磷酸=70∶30：0.12为流动相；检测波长为403nm；流速1.0mL·min-1。
3.2 供试品溶液的制备
取提取膏，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加水10ml，称定重量，超声处理五分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，取上清液，滤过，取续滤液，即得。
3.3 对照品溶液的制备
精密称取羟基红花黄色素A对照品，用甲醇溶解稀释，配制成每1mL溶液中含羟基红花黄色素A 200μg的对照品溶液。
3.4 标准曲线的制备
将浓度为50μg/ml，100μg/ml，300μg/ml，500μg/ml，700μg/ml，800μg/ml，900μg/ml的对照品溶液分别吸取20μL注入HPLC，以进样量（μg）为横坐标，峰面积积分值A为纵坐标，绘制标准曲线。试验表明，羟基红花黄色素A对照品在50～900μg/ml范围内线性关系良好。
3.5 回收率试验
取已知含量的同一批供试品各6份，分别精密添加一定量的羟基红花黄色素A对照品，测定含量，计算回收率。平均回收率为98.66%，RSD为0.89%。
4 讨论
羟基红花黄色素A（hydroxysafflor yellow A）是具有单查尔酮苷类结构的化合物，可抑制血小板激活因子诱发的血小板聚集与释放，可竞争性地抑制血小板激活因子与血小板受体的结合，是红花黄色素的活血化瘀有效成分。羟基红花黄色素A是一种好的医药原料，具有抗炎活性，细胞保护活性，抗肿瘤活性。本实验对红花中羟基红花黄色素A的纯化工艺进行研究。提取工艺为提取三次，第一次加12倍的蒸馏水（用盐酸调PH值为3），60摄氏度提取60分钟，过滤，合并滤液，用氢氧化钠调PH值为7，减压浓缩；第二次加10倍的蒸馏水（用盐酸调PH值为3），60摄氏度提取50分钟，过滤，合并滤液，用氢氧化钠调PH值为7，减压浓缩；第二次加8倍的蒸馏水（用盐酸调PH值为3），60摄氏度提取40分钟，过滤，合并滤液，用氢氧化钠调PH值为7，减压浓缩，合并三次浓缩液混匀。羟基红花黄色素A提取率可达到百分之九十以上。分别采用聚酰胺复合膜NF270-400、聚酰胺复合膜NF200-400、聚酰胺复合膜NF90-400进行纯化实验。实验结果表明采用聚酰胺复合膜NF200-400效果最好。本工艺稳定、可行、收率高。
参考文献
[1]金鸣，裴崇强，臧宝霞，王麟.羟基红花黄色素A缓解血小板激活因子诱导的内皮细胞炎症因子表达升高作用的研究[J].心肺血管病杂志， 2011（5）.
[2]张庆，郑冬雁，徐红岩，潘燕，魏蜀一.红花黄素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].山东大学学报（医学版），2011（6）.
[3]韩海玲，孙玉芹，宋文刚，朱玉红，吕冬燕，朱艳彬，何海涛，姜欣.红花黄色素对内皮细胞增殖及凋亡的保护作用[J].中国实验诊断学，2011（1）.
[4]彭其胜.红花注射液对大鼠周围神经缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究[J].中国药房，2011（23）.
[5]靳宏光，姜琛，田宇丹.羟基红花黄色素A对兔动脉粥样硬化影响的实验研究[J].上海中医药杂志，2011（4）.
关键词：红花；纯化；工艺
红花别名为红蓝花（《金匮要略》），红蓝（崔豹《古今注》），红花草（《履巉岩本草》），刺红花（《四州中药志》），草红花（《陕西中药志》），黄蓝（《博物志》），红花菜（《救荒本草》）。
红花具有活血通经，去瘀止痛的功效。红花常用于治疗经闭、难产、死胎、产后恶露不行、瘀血作痛、跌扑损伤等[1-2]。《开宝本草》记载：“主产后血运口噤，腹内恶血不尽、绞痛，胎死腹中，并酒煮服。亦主蛊毒下血。”红花含有红花甙（carthamin）、前红花甙（precarthamin）、红花黄色素（safflow yellow）A、绿原酸（chlorogenic acid）、儿茶酚（cate-chol）、焦性儿茶酚（pyrocatechol）、2-已醇（2-hexanol），（E）-2-已烯醛〔（E）-2-hexenal〕、对二甲苯（p-xylene）、1，2，3-三甲氧基-5-甲基苯（1，2，3-TCMLIBimethoxy-5-methylbenzene）、α-柏木烯（α-cedrene）、葎草烯（humulene）等成分。羟基红花黄色素A是红花药理功效的最有效水溶性部位，是红花黄色素的活血化瘀有效成分[3-5]。本实验对红花中羟基红花黄色素A的纯化工艺进行研究。
1 仪器与试药
WP-UP-Ⅲ-20精密型实验室专用超纯水机（四川沃特尔水处理设备有限公司）；科捷仪器LC600A液相色谱仪（南京科捷分析仪器有限公司）；LC-10B系列液相色谱仪（杭州科晓化工仪器设备有限公司）；Lanbo恒温柱温箱（天津市兰博实验仪器设备有限公司）；Cascada BIO 实验室超纯水系统（颇尔过滤器（北京）有限公司）；英国Grant冷冻离心机PCV-3000 PCV-4200R（深圳市标远科学仪器有限公司）；GLITRING-6实验室清洗机（北京嘉信怡达科技有限公司）；上海舜宇恒平AE124C内校电子分析天平（北京联合科仪科技有限公司）。羟基红花黄色素A对照品（中国药品生物制品检定所提供）。乙腈（上海甲美精细化工有限公司）；盐酸（常州通诚化工有限公司）；磷酸（天津博达盛业化工产品有限公司）；甲醇（上海甲美精细化工有限公司）；氢氧化钠（常州通诚化工有限公司）。
2 方法与结果
2.1 提取
按处方称取药材，至于圆底烧瓶內，分别提取三次，第一次加12倍的蒸馏水（用盐酸调PH值为3），60摄氏度提取60分钟，过滤，合并滤液，用氢氧化钠调PH值为7，减压浓缩；第二次加10倍的蒸馏水（用盐酸调PH 值为3），60摄氏度提取50分钟，过滤，合并滤液，用氢氧化钠调PH值为7，减压浓缩；第二次加8倍的蒸馏水（用盐酸调PH值为3），60摄氏度提取40分钟，过滤，合并滤液，用氢氧化钠调PH值为7，减压浓缩，合并三次浓缩液混匀。采用高效液相测定浓缩膏中羟基红花黄色素A含量并计算羟基红花黄色素A收率。
2.2 纯化
分别采用聚酰胺复合膜NF270-400、聚酰胺复合膜NF200-400、聚酰胺复合膜NF90-400进行纯化实验。聚酰胺复合膜NF270-400切割分子量为1000、聚酰胺复合膜NF200-400切割分子量为600、聚酰胺复合膜NF90-400切割分子量为300。红花中羟基红花黄色素纯化结果见表1。
3 含量测定方法
3.1 色谱条件
色谱柱为Waters SunFire C18液相色谱柱（规格250×4.6mm，5um）；甲醇-水-磷酸=70∶30：0.12为流动相；检测波长为403nm；流速1.0mL·min-1。
3.2 供试品溶液的制备
取提取膏，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加水10ml，称定重量，超声处理五分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，取上清液，滤过，取续滤液，即得。
3.3 对照品溶液的制备
精密称取羟基红花黄色素A对照品，用甲醇溶解稀释，配制成每1mL溶液中含羟基红花黄色素A 200μg的对照品溶液。
3.4 标准曲线的制备
将浓度为50μg/ml，100μg/ml，300μg/ml，500μg/ml，700μg/ml，800μg/ml，900μg/ml的对照品溶液分别吸取20μL注入HPLC，以进样量（μg）为横坐标，峰面积积分值A为纵坐标，绘制标准曲线。试验表明，羟基红花黄色素A对照品在50～900μg/ml范围内线性关系良好。
3.5 回收率试验
取已知含量的同一批供试品各6份，分别精密添加一定量的羟基红花黄色素A对照品，测定含量，计算回收率。平均回收率为98.66%，RSD为0.89%。
4 讨论
羟基红花黄色素A（hydroxysafflor yellow A）是具有单查尔酮苷类结构的化合物，可抑制血小板激活因子诱发的血小板聚集与释放，可竞争性地抑制血小板激活因子与血小板受体的结合，是红花黄色素的活血化瘀有效成分。羟基红花黄色素A是一种好的医药原料，具有抗炎活性，细胞保护活性，抗肿瘤活性。本实验对红花中羟基红花黄色素A的纯化工艺进行研究。提取工艺为提取三次，第一次加12倍的蒸馏水（用盐酸调PH值为3），60摄氏度提取60分钟，过滤，合并滤液，用氢氧化钠调PH值为7，减压浓缩；第二次加10倍的蒸馏水（用盐酸调PH值为3），60摄氏度提取50分钟，过滤，合并滤液，用氢氧化钠调PH值为7，减压浓缩；第二次加8倍的蒸馏水（用盐酸调PH值为3），60摄氏度提取40分钟，过滤，合并滤液，用氢氧化钠调PH值为7，减压浓缩，合并三次浓缩液混匀。羟基红花黄色素A提取率可达到百分之九十以上。分别采用聚酰胺复合膜NF270-400、聚酰胺复合膜NF200-400、聚酰胺复合膜NF90-400进行纯化实验。实验结果表明采用聚酰胺复合膜NF200-400效果最好。本工艺稳定、可行、收率高。
参考文献
[1]金鸣，裴崇强，臧宝霞，王麟.羟基红花黄色素A缓解血小板激活因子诱导的内皮细胞炎症因子表达升高作用的研究[J].心肺血管病杂志， 2011（5）.
[2]张庆，郑冬雁，徐红岩，潘燕，魏蜀一.红花黄素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].山东大学学报（医学版），2011（6）.
[3]韩海玲，孙玉芹，宋文刚，朱玉红，吕冬燕，朱艳彬，何海涛，姜欣.红花黄色素对内皮细胞增殖及凋亡的保护作用[J].中国实验诊断学，2011（1）.
[4]彭其胜.红花注射液对大鼠周围神经缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究[J].中国药房，2011（23）.
[5]靳宏光，姜琛，田宇丹.羟基红花黄色素A对兔动脉粥样硬化影响的实验研究[J].上海中医药杂志，2011（4）.