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【摘要】目的：应用Rp-HPLC（DAD）对大血藤药材三氯甲烷部位进行指纹图谱研究。方法：DiamonsilspursilC18分析柱，乙腈-水梯度洗脱，流速0.8mL/min，检测波长270nm。柱温：30℃;进样量为10μL。结果：建立了大血藤药材三氯甲烷部位指纹图谱，确认19个共有峰，指认了3个峰，指纹图谱的相似度达到0.801以上，所建立的大血藤药材三氯甲烷部位指纹图谱测定方法精密度、重复性和稳定性良好。结论：建立了专属性强的大血藤药材三氯甲烷部位指纹图谱，可为大血藤质量控制提供依据。
【关键词】大血藤;HPLC;指纹图谱;
【中图分类号】R927.2【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2019）1-0031-05
Abstract：ObjectiveAfingerprintofchloroformextractsofSargentodoxaeCaulishasbeenstudiedandprovidesthequalityinformation.MethodDiamonsilspursilC18columnwasused，withmixturesofacetonitrileandwaterasmobilephaseinagradientmode.Thewavelengthofmeasurementwas270nm.Columntemperaturewas30℃;Injectvolumewas10μL.ResultTheHPLCcharacteristicfingerprintofchloroformextractsofSargentodoxaeCauliswith19commonspeaks，andthreeofthemwereidentifiedbycomparingwithreferencesubslances.Thevaluesofsimilaritywashigherthan0.801.TheHPLCmethodshowedbetterresultsofstability，precision，andrepeatability.ConclusionThefingerprintofchloroformextractsofSargentodoxaeCaulishasbeenestablish.ItmaybepracticalvalueforthequalitycontrolofsampleforSargentodoxaeCaulis.
Keywords：SargentodoxaeCaulis;HPLC;Fingerprint
中药大血藤为木通科大血藤Sargentodoxacuneata（Oliv.）Rehd.etWils..的干燥藤茎。大血藤味苦、平，归大肠、肝经。具有清热解毒、活血、祛风止痛等作用，可用以治疗肠痈腹痛、热毒疮疡、经闭痛经、风湿痹痛、跌打肿痛等[1]。中国药典（2015年版）大血藤质量标准中并未对其所含的化学成分进行定量控制。据文献报道[2～5]，大血藤中含有鞣质、糖苷类、环多酚类、三萜皂苷类、木质素类、黄酮类以及蒽醌类化学物质。而大黄素、大黄酚、绿原酸等物质具有较强的抗菌活性，这与其在肠痈腹痛、慢性盆腔炎中的临床应用密切相关，为更有效地控制大血藤的内在质量，本实验应用HPLC方法，建立了大血藤三氯甲烷部位HPLC指纹图谱分析方法，为该药材提供了更全面的质量控制依据。
1仪器与材料
1.1仪器LC-20A型系列高效液相色谱仪（包括二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、色谱工作站，日本岛津公司）;B2200S-T超声清洗器（必能信超声（上海）有限公司）;BT224S电子天平（德国Sartorius公司）;HH-S恒温水浴锅（金坛市恒丰仪器厂）;NW20超纯水系统（力新仪器（上海）有限公司）。
1.2材料大黄素、大黄酚对照品（质量分数≥98%）由上海顺勃生物工程技术有限公司提供;绿原酸对照品（批号：20110812，中国药品生物制品检定所）。乙腈、甲醇均为色谱纯溶剂;水为超纯水;氯仿、乙酸乙酯、盐酸均为分析纯。大血藤药材信息见表1。
2方法
2.1对照品溶液的制备分别精密称取一定量的绿原酸、大黄素、大黄酚对照品，置于25mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，0.45μm微孔滤膜過滤，即得。
2.2供试品溶液的制备取约1.0g的大血藤，精密称定，加入50mL甲醇回流1h，趁热抽滤，用少许甲醇洗药渣及抽滤瓶，合并甲醇至圆底烧瓶中，将甲醇提取液旋蒸至近干，加入8%HCL10mL，将酸液超声10min后再加入氯仿25mL，回流30min，将氯仿溶液转移置分液漏斗中，静置分层，取氯仿层溶液并再用15mL氯仿萃取三次，合并氯仿层，旋蒸至近干，用甲醇定容至5mL，0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
2.3色谱条件色谱柱：DiamonsilspursilC18（150×4.6mm，5μm）;流动相A为乙腈，B为水，梯度洗脱。柱温：30℃;流速0.8mL/min;检测波长270nm;进样量为10μL。梯度洗脱程序见表2。
2.4方法学考察
2.4.1精密度试验取同一供试品溶液，按2.3中色谱条件注入液相色谱仪，连续进样6次，选定指纹图谱中3号共有峰为参照峰，在270nm波长进行检测，计算主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，主要共有峰的相对保留时间的RSD为0%～1.01%，相对峰面积的RSD为0%～2.37%，结果表明，仪器精密度良好。
2.4.2稳定性试验取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、16、24、48、66、80、96h，按2.3中色谱条件注入液相色谱仪，在270nm波长进行检测，计算主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，主要共有峰的相对保留时间的RSD为0%～1.21%，相对峰面积的RSD为0%～2.88%。结果表明，供试品溶液在96h内稳定性良好。 2.4.3重复性试验按2.2项下“供试品溶液的制备”方法，同法制备六份，按上述色谱条件注入液相色谱仪，在270nm波长进行检测，计算主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，主要共有峰的相对保留时间的RSD为0%～1.98%，相对峰面积的RSD为0%～2.91%。结果表明重复性良好。
3结果与分析
3.1大血藤三氯甲烷部位指纹图谱的建立与分析按2.2项下“供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，测定10批大血藤三氯甲烷部位的HPLC图谱，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）”软件进行处理，得到10批药材三氯甲烷部位在270nm波长下的指纹图谱图（图1），经过谱峰多点校正后生成共有模式的对照指纹图谱（图3），确定19个色谱峰为共有指纹峰。10批药材的相似度在0.80～1.00之间，见表4。
3.2峰的确认根据已确认的19个共有峰，因6号峰在各样品中均存在，保留时间适中，为峰面积大的共有色谱峰，故选取6号峰为参照峰（S）。
3.3大血藤三氯甲烷部位指纹图谱分析大血藤三氯甲烷部位共检测到19个共有色谱峰，经与对照品的保留时间和紫外光谱对照，其中1、14、16号峰分别为绿原酸、大黄素和大黄酚。10批次大血藤药材共有峰面积占总峰面积均大于90%。选定指纹图谱中3号共有峰为参照物峰。以参照物峰的保留时间和峰面积作为1，分别计算共有指紋峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，不同批次大血藤共有峰相对保留时间RSD小于3%，而相对保留峰面积RSD较大。由此可知，本实验建立的色谱方法可以使不同批次大血藤药材具有基本一致的色谱行为，但药材之间各种化学成分的含量受多种因素的影响具有较大差异。
4实验讨论
研究表明，大血藤中的绿原酸及蒽醌类成分具有抗菌消炎的功效，因而把大血藤中酚酸类及蒽醌类成分作为其指纹图谱的目标成分。在供试品溶液的制备中，考察了以甲醇、乙醇为溶剂，采用回流提取、超声提取、酸水解后氯仿提取等方案，实验结果表明单纯的醇提图谱成分复杂，且极性成分较多，用C18柱难以实现较好的分离。考虑到蒽醌类成分在大血藤中以游离形式或苷类存在、蒽醌类物质的溶解性质，最终采用酸水解氯仿萃取的提取方法。徐锋[6]等人进行了大血藤的HPLC指纹图谱研究，建立大血藤的乙醇提取液的指纹图谱。本实验研究大血藤氯仿部位的HPLC指纹图谱，确定19个色谱峰为共有指纹峰。10批药材的相似度在0.80～1.00之间，指认了大黄素、大黄酚及绿原酸峰，这与大血藤临床应用及药理药效更加契合。
本实验通过比较大血藤三氯甲烷部位200nm～500nmHPLC色谱图，发现270nm下各峰分离良好，特征峰明显且峰型较好，而且在此波长下，绿原酸、大黄素、大黄酚，这些指标成分都显示了较好的色谱峰，故确定选择270nm作为指纹图谱的检测波长。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：20.
[2]田瑛，张慧娟，屠爱萍，等.中药大血藤的酚性化合物[J].药学学报，2005，40（7）：628-631.
[3]史伟，陈凌云.五花血藤化学成分的研究[J].云南中医学院学报，2014，37（3）：25-27.
[4]高玉琼，赵德刚，刘建华，等.大血藤挥发性成分研究[J].中成药，2004，26（10）：843-845.
[5]袁贤达，高慧敏，陈两绵.大血藤中1个新的木脂素类化合物[J].中国中药杂志，2013，38（13）：2118-2124.
[6]徐锋，杨烨，舒秋娥，等.大血藤的HPLC指纹图谱[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（13）：145-149.
（收稿日期：2018-11-07编辑：刘斌）
【关键词】大血藤;HPLC;指纹图谱;
【中图分类号】R927.2【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2019）1-0031-05
Abstract：ObjectiveAfingerprintofchloroformextractsofSargentodoxaeCaulishasbeenstudiedandprovidesthequalityinformation.MethodDiamonsilspursilC18columnwasused，withmixturesofacetonitrileandwaterasmobilephaseinagradientmode.Thewavelengthofmeasurementwas270nm.Columntemperaturewas30℃;Injectvolumewas10μL.ResultTheHPLCcharacteristicfingerprintofchloroformextractsofSargentodoxaeCauliswith19commonspeaks，andthreeofthemwereidentifiedbycomparingwithreferencesubslances.Thevaluesofsimilaritywashigherthan0.801.TheHPLCmethodshowedbetterresultsofstability，precision，andrepeatability.ConclusionThefingerprintofchloroformextractsofSargentodoxaeCaulishasbeenestablish.ItmaybepracticalvalueforthequalitycontrolofsampleforSargentodoxaeCaulis.
Keywords：SargentodoxaeCaulis;HPLC;Fingerprint
中药大血藤为木通科大血藤Sargentodoxacuneata（Oliv.）Rehd.etWils..的干燥藤茎。大血藤味苦、平，归大肠、肝经。具有清热解毒、活血、祛风止痛等作用，可用以治疗肠痈腹痛、热毒疮疡、经闭痛经、风湿痹痛、跌打肿痛等[1]。中国药典（2015年版）大血藤质量标准中并未对其所含的化学成分进行定量控制。据文献报道[2～5]，大血藤中含有鞣质、糖苷类、环多酚类、三萜皂苷类、木质素类、黄酮类以及蒽醌类化学物质。而大黄素、大黄酚、绿原酸等物质具有较强的抗菌活性，这与其在肠痈腹痛、慢性盆腔炎中的临床应用密切相关，为更有效地控制大血藤的内在质量，本实验应用HPLC方法，建立了大血藤三氯甲烷部位HPLC指纹图谱分析方法，为该药材提供了更全面的质量控制依据。
1仪器与材料
1.1仪器LC-20A型系列高效液相色谱仪（包括二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、色谱工作站，日本岛津公司）;B2200S-T超声清洗器（必能信超声（上海）有限公司）;BT224S电子天平（德国Sartorius公司）;HH-S恒温水浴锅（金坛市恒丰仪器厂）;NW20超纯水系统（力新仪器（上海）有限公司）。
1.2材料大黄素、大黄酚对照品（质量分数≥98%）由上海顺勃生物工程技术有限公司提供;绿原酸对照品（批号：20110812，中国药品生物制品检定所）。乙腈、甲醇均为色谱纯溶剂;水为超纯水;氯仿、乙酸乙酯、盐酸均为分析纯。大血藤药材信息见表1。
2方法
2.1对照品溶液的制备分别精密称取一定量的绿原酸、大黄素、大黄酚对照品，置于25mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，0.45μm微孔滤膜過滤，即得。
2.2供试品溶液的制备取约1.0g的大血藤，精密称定，加入50mL甲醇回流1h，趁热抽滤，用少许甲醇洗药渣及抽滤瓶，合并甲醇至圆底烧瓶中，将甲醇提取液旋蒸至近干，加入8%HCL10mL，将酸液超声10min后再加入氯仿25mL，回流30min，将氯仿溶液转移置分液漏斗中，静置分层，取氯仿层溶液并再用15mL氯仿萃取三次，合并氯仿层，旋蒸至近干，用甲醇定容至5mL，0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
2.3色谱条件色谱柱：DiamonsilspursilC18（150×4.6mm，5μm）;流动相A为乙腈，B为水，梯度洗脱。柱温：30℃;流速0.8mL/min;检测波长270nm;进样量为10μL。梯度洗脱程序见表2。
2.4方法学考察
2.4.1精密度试验取同一供试品溶液，按2.3中色谱条件注入液相色谱仪，连续进样6次，选定指纹图谱中3号共有峰为参照峰，在270nm波长进行检测，计算主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，主要共有峰的相对保留时间的RSD为0%～1.01%，相对峰面积的RSD为0%～2.37%，结果表明，仪器精密度良好。
2.4.2稳定性试验取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、16、24、48、66、80、96h，按2.3中色谱条件注入液相色谱仪，在270nm波长进行检测，计算主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，主要共有峰的相对保留时间的RSD为0%～1.21%，相对峰面积的RSD为0%～2.88%。结果表明，供试品溶液在96h内稳定性良好。 2.4.3重复性试验按2.2项下“供试品溶液的制备”方法，同法制备六份，按上述色谱条件注入液相色谱仪，在270nm波长进行检测，计算主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，主要共有峰的相对保留时间的RSD为0%～1.98%，相对峰面积的RSD为0%～2.91%。结果表明重复性良好。
3结果与分析
3.1大血藤三氯甲烷部位指纹图谱的建立与分析按2.2项下“供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，测定10批大血藤三氯甲烷部位的HPLC图谱，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）”软件进行处理，得到10批药材三氯甲烷部位在270nm波长下的指纹图谱图（图1），经过谱峰多点校正后生成共有模式的对照指纹图谱（图3），确定19个色谱峰为共有指纹峰。10批药材的相似度在0.80～1.00之间，见表4。
3.2峰的确认根据已确认的19个共有峰，因6号峰在各样品中均存在，保留时间适中，为峰面积大的共有色谱峰，故选取6号峰为参照峰（S）。
3.3大血藤三氯甲烷部位指纹图谱分析大血藤三氯甲烷部位共检测到19个共有色谱峰，经与对照品的保留时间和紫外光谱对照，其中1、14、16号峰分别为绿原酸、大黄素和大黄酚。10批次大血藤药材共有峰面积占总峰面积均大于90%。选定指纹图谱中3号共有峰为参照物峰。以参照物峰的保留时间和峰面积作为1，分别计算共有指紋峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，不同批次大血藤共有峰相对保留时间RSD小于3%，而相对保留峰面积RSD较大。由此可知，本实验建立的色谱方法可以使不同批次大血藤药材具有基本一致的色谱行为，但药材之间各种化学成分的含量受多种因素的影响具有较大差异。
4实验讨论
研究表明，大血藤中的绿原酸及蒽醌类成分具有抗菌消炎的功效，因而把大血藤中酚酸类及蒽醌类成分作为其指纹图谱的目标成分。在供试品溶液的制备中，考察了以甲醇、乙醇为溶剂，采用回流提取、超声提取、酸水解后氯仿提取等方案，实验结果表明单纯的醇提图谱成分复杂，且极性成分较多，用C18柱难以实现较好的分离。考虑到蒽醌类成分在大血藤中以游离形式或苷类存在、蒽醌类物质的溶解性质，最终采用酸水解氯仿萃取的提取方法。徐锋[6]等人进行了大血藤的HPLC指纹图谱研究，建立大血藤的乙醇提取液的指纹图谱。本实验研究大血藤氯仿部位的HPLC指纹图谱，确定19个色谱峰为共有指纹峰。10批药材的相似度在0.80～1.00之间，指认了大黄素、大黄酚及绿原酸峰，这与大血藤临床应用及药理药效更加契合。
本实验通过比较大血藤三氯甲烷部位200nm～500nmHPLC色谱图，发现270nm下各峰分离良好，特征峰明显且峰型较好，而且在此波长下，绿原酸、大黄素、大黄酚，这些指标成分都显示了较好的色谱峰，故确定选择270nm作为指纹图谱的检测波长。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：20.
[2]田瑛，张慧娟，屠爱萍，等.中药大血藤的酚性化合物[J].药学学报，2005，40（7）：628-631.
[3]史伟，陈凌云.五花血藤化学成分的研究[J].云南中医学院学报，2014，37（3）：25-27.
[4]高玉琼，赵德刚，刘建华，等.大血藤挥发性成分研究[J].中成药，2004，26（10）：843-845.
[5]袁贤达，高慧敏，陈两绵.大血藤中1个新的木脂素类化合物[J].中国中药杂志，2013，38（13）：2118-2124.
[6]徐锋，杨烨，舒秋娥，等.大血藤的HPLC指纹图谱[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（13）：145-149.
（收稿日期：2018-11-07编辑：刘斌）