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基金项目：
作者简介：谭志灿（1985-），男，汉族，硕士，讲师，研究方向为中药相关课程的教学工作。E-mail： tanzhican@163.com
通信作者：丘思兰（1985-），女，汉族，本科，主管中药师，研究方向为医院制剂。E-mail： tanzhican@126.com
【摘 要】 目的：优化牛大力总黄酮提取工艺。方法：采用超声提取法，以总黄酮提取率为评价指标，以乙醇浓度、乙醇体积、提取时间为考察因素，利用Box-Behnken效应面法优化提取工艺。结果：最佳工艺为乙醇浓度81.07%、乙醇体积21.63倍、超声提取2次、每次52.51 min，温度60℃。在此条件下，牛大力总黄酮提取率达3.81 mg/g。结论：Box-Behnken效应面法优选的提取工艺稳定可行，实验值与预测值相吻合。
【关键词】 Box-Behnken效应面法;牛大力;总黄酮;提取工艺
【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2019）7-0033-03
Abstract：Objective To optimize extraction technology of totals flavonoids from Radix Millettia speciosa. Method On the basis of single factor experiment， ultrasonic extraction method was adopted. Ethanol concentration， solvent volume and extraction time were used to examine the yield of total flavonoids by Box-Behnken response surface methodology. Result The optimum conditions of extraction process consisted of 81.07% ethanol for 21.63 times， 52.51 min extraction time， and twice ultrasonic with 60 ℃， while the extraction rate of totals flavonoids was 3.81 mg/g. Conclusion This optimized technology was stable and feasible by Box-Behnken response surface methodology， which the predictive value and the experimental observation value was fitted.
Keywords：Box-Behnken Response Surface Methodology; Radix Millettia Speciosa; Totals Flavonoids; Extraction Technology
牛大力，別名大力牛、甜牛大力、大力薯、扒山虎、血藤、金钟根、倒吊金锤等，原植物为攀缘灌木，为豆科植物美丽崖豆藤Millettia speciosa Champ.的干燥根[1]。全年均可采挖，以夏、秋季为佳，整理洗净，除去芦头和须根，切厚片或切段，晒干即可。主产于广东、广西、海南、福建、湖南、云南、贵州等地，生于灌木林丛、路边或疏林中。牛大力味甘、性平，归肺、脾、肾经，能补虚润肺、强筋活络，用于病后虚弱、阴虚咳嗽等症。现代研究表明，牛大力主要含有生物碱类化合物、黄酮类化合物、三萜类化合物、多糖类化合物和植物甾醇等多种成分[2-4]，具有镇咳、祛痰、平喘、保肝、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、提高免疫功能等作用[5-8]。本实验的研究对象为具有抗氧化活性的总黄酮[7]，采用Box-Behnken效应面法优选牛大力总黄酮提取工艺，为牛大力的综合利用提供实验依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器 SP-756PC型紫外-可见分光光度计（上海光谱仪器）;CJ-100ST功率可调加温定时型超声波清洗机（深圳市超洁科技）;AL104型电子分析天平（上海梅特勒托利多仪器）。
1.2 材料 牛大力（批号1803001，广州市岭南中药饮片有限公司）经鉴定为豆科植物美丽崖豆藤Millettia speciosa Champ.的干燥根;芦丁对照品（批号100086-201755，中国食品药品检定研究院）。
2 方法与结果
2.1 含量测定[9-10]
2.1.1 对照品溶液 取芦丁对照品适量，精密称定，置25mL量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得每1mL含芦丁0.468mg的对照品溶液。
2.1.2 标准曲线 精密量取“2.1.1”项下对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，分别置25mL量瓶中，加乙醇至6mL，依次加入5%亚硝酸钠溶液1mL、10%硝酸铝溶液1mL，每次加入后均摇匀并放置6min，再加入4%氢氧化钠溶液10mL，加水至刻度，摇匀后放置15min，以随行试剂为空白，于505nm处测定吸光度，得方程A=15.1364C-0.0163，r=0.9993，线性范围0.009 36～0.056 16mg/mL，式中A为吸光度、C为浓度。
2.1.3 供试品溶液 取牛大力药材粉末约1g，精密称定，按照“2.2”项下的实验方法制备供试品溶液。
2.1.4 样品测定 精密量取“2.1.3”项下供试品溶液5mL，照“2.1.2”项下的方法，测定吸光度，计算总黄酮含量。 2.2 Box-Behnken效应面法实验设计[11] 根据前期的单因素试验结果，采用超声提取法，功率500 W，温度60 ℃，提取2次，选取乙醇浓度A、乙醇体积B、提取时间C为考察因素，以牛大力总黄酮的提取率为响应值，Box-Behnken效应面法的实验设计及结果见表1。
采用Design Expert 7.0.0軟件对表1实验数据进行多元线性回归拟合，得二次多项回归模型方程：Y=-16.052 19+0.198 12A+0.554 58B+0.197 63C+1.500 00×10-3AB-1.500 00×10-4AC+8.333 33×10-5BC-1.387 50×10-3A2-0.015 139B2-1.612 50×10-3C2。结果显示，相关系数R2为0.987 6，变异系数C.V.为1.29%，模型拟合良好。由表2可知，3个考察因素A、B、C的一次项和二次项均达极显著水平（P<0.01），失拟项不显著（P>0.05）。为了直观反映分析结果，采用Design Expert软件作出相应的等高线图和效应面图，如图1、2所示。
2.3 验证试验 根据“2.2”项下的回归方程确定最优工艺：乙醇浓度81.07%，乙醇体积21.63倍，超声提取2次、每次52.51 min，温度60 ℃。在此条件下，牛大力总黄酮理论提取率为3.821 1 mg/g。对最佳提取工艺进行3次验证试验，结果总黄酮平均提取率3.81 mg/g （RSD=0.961%）。验证试验表明，所优选的提取工艺稳定可行、重复性良好。
3 讨论
实验采用Box-Behnken效应面法进行实验设计，优选牛大力总黄酮的提取工艺。Box-Behnken效应面法具有实验次数少，结果预测精度高的特点，很好地解决了多变量问题。在实验设计中，Center Points per Block设定为5，即中心点选择5次重复，用以估计实验误差。
根据前期的单因素试验结果，本次实验选择超声提取法，固定超声功率为500 W、超声温度为60 ℃、提取次数为2次，选取对实验结果影响较大的3个因素（乙醇浓度、乙醇体积和提取时间）进行考察，以减少Box-Behnken效应面法的试验次数。由结果可知，每个因素的交互作用较小，其1次项和2次项对牛大力总黄酮提取率贡献较大。回归模型通过显著性检验及方差分析，具有统计学意义（P<0.01），回归模型可信度好。利用回归模型算出最佳工艺参数，通过验证试验，相对标准偏差RSD值为0.961%，理论值和实验值之间高度吻合，为牛大力的综合利用提供实验依据。
参考文献
[1]广东省食品药品监督管理局. 广东省中药材标准（第一册）[S]. 广州：广东科技出版社，2004：40.
[2]王祝年，赖富丽，王茂媛，等. 牛大力根的化学成分研究[J]. 热带作物学报，2011，32（12）：2378-2380.
[3]王春华，王英，王国才，等. 牛大力的化学成分研究[J]. 中草药，2008，39（7）：972-975.
[4]王呈文，陈光英，宋小平，等. 牛大力的化学成分研究[J]. 中草药，2014，45（11）：1515-1520.
[5]郑元升，蒲含林，麻建军. 牛大力多糖对小鼠T淋巴细胞增殖的双向调节作用[J]. 广东药学院学报，2008，24（1）：58-61.
[6]黄翔，王晓平，陈晓白. 中药牛大力抗疲劳抗应激作用的实验研究[J]. 玉林师范学院学报，2014，35（2）：55-58.
[7]王呈文，纪明慧，舒火明，等. 牛大力总黄酮提取工艺及不同萃取物的抗氧化活性研究[J]. 化学研究与应用，2013，25（5）：713-717.
[8]周添浓，刘丹丹，唐立海，等. 牛大力对四氯化碳及酒精所致小鼠急性肝损伤的保护作用[J]. 时珍国医国药，2009，20（10）：2585-2587.
[9]丁新爱. 独一味提取工艺研究[J]. 河南中医学院学报，2006，21（2）：40.
[10]张峻菁，冯珊娜. 正交设计法优选蒲桃中总黄酮的提取工艺[J]. 今日药学，2015，25（8）：571-573.
[11]丘思兰，谭志灿，黄洁靖，等. Box-Behnken效应面法优化侧柏叶总黄酮提取工艺[J]. 云南中医学院学报，2015，38（1）：31-37.
（收稿日期：2019-01-27 编辑：陶希睿）
作者简介：谭志灿（1985-），男，汉族，硕士，讲师，研究方向为中药相关课程的教学工作。E-mail： tanzhican@163.com
通信作者：丘思兰（1985-），女，汉族，本科，主管中药师，研究方向为医院制剂。E-mail： tanzhican@126.com
【摘 要】 目的：优化牛大力总黄酮提取工艺。方法：采用超声提取法，以总黄酮提取率为评价指标，以乙醇浓度、乙醇体积、提取时间为考察因素，利用Box-Behnken效应面法优化提取工艺。结果：最佳工艺为乙醇浓度81.07%、乙醇体积21.63倍、超声提取2次、每次52.51 min，温度60℃。在此条件下，牛大力总黄酮提取率达3.81 mg/g。结论：Box-Behnken效应面法优选的提取工艺稳定可行，实验值与预测值相吻合。
【关键词】 Box-Behnken效应面法;牛大力;总黄酮;提取工艺
【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2019）7-0033-03
Abstract：Objective To optimize extraction technology of totals flavonoids from Radix Millettia speciosa. Method On the basis of single factor experiment， ultrasonic extraction method was adopted. Ethanol concentration， solvent volume and extraction time were used to examine the yield of total flavonoids by Box-Behnken response surface methodology. Result The optimum conditions of extraction process consisted of 81.07% ethanol for 21.63 times， 52.51 min extraction time， and twice ultrasonic with 60 ℃， while the extraction rate of totals flavonoids was 3.81 mg/g. Conclusion This optimized technology was stable and feasible by Box-Behnken response surface methodology， which the predictive value and the experimental observation value was fitted.
Keywords：Box-Behnken Response Surface Methodology; Radix Millettia Speciosa; Totals Flavonoids; Extraction Technology
牛大力，別名大力牛、甜牛大力、大力薯、扒山虎、血藤、金钟根、倒吊金锤等，原植物为攀缘灌木，为豆科植物美丽崖豆藤Millettia speciosa Champ.的干燥根[1]。全年均可采挖，以夏、秋季为佳，整理洗净，除去芦头和须根，切厚片或切段，晒干即可。主产于广东、广西、海南、福建、湖南、云南、贵州等地，生于灌木林丛、路边或疏林中。牛大力味甘、性平，归肺、脾、肾经，能补虚润肺、强筋活络，用于病后虚弱、阴虚咳嗽等症。现代研究表明，牛大力主要含有生物碱类化合物、黄酮类化合物、三萜类化合物、多糖类化合物和植物甾醇等多种成分[2-4]，具有镇咳、祛痰、平喘、保肝、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、提高免疫功能等作用[5-8]。本实验的研究对象为具有抗氧化活性的总黄酮[7]，采用Box-Behnken效应面法优选牛大力总黄酮提取工艺，为牛大力的综合利用提供实验依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器 SP-756PC型紫外-可见分光光度计（上海光谱仪器）;CJ-100ST功率可调加温定时型超声波清洗机（深圳市超洁科技）;AL104型电子分析天平（上海梅特勒托利多仪器）。
1.2 材料 牛大力（批号1803001，广州市岭南中药饮片有限公司）经鉴定为豆科植物美丽崖豆藤Millettia speciosa Champ.的干燥根;芦丁对照品（批号100086-201755，中国食品药品检定研究院）。
2 方法与结果
2.1 含量测定[9-10]
2.1.1 对照品溶液 取芦丁对照品适量，精密称定，置25mL量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得每1mL含芦丁0.468mg的对照品溶液。
2.1.2 标准曲线 精密量取“2.1.1”项下对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，分别置25mL量瓶中，加乙醇至6mL，依次加入5%亚硝酸钠溶液1mL、10%硝酸铝溶液1mL，每次加入后均摇匀并放置6min，再加入4%氢氧化钠溶液10mL，加水至刻度，摇匀后放置15min，以随行试剂为空白，于505nm处测定吸光度，得方程A=15.1364C-0.0163，r=0.9993，线性范围0.009 36～0.056 16mg/mL，式中A为吸光度、C为浓度。
2.1.3 供试品溶液 取牛大力药材粉末约1g，精密称定，按照“2.2”项下的实验方法制备供试品溶液。
2.1.4 样品测定 精密量取“2.1.3”项下供试品溶液5mL，照“2.1.2”项下的方法，测定吸光度，计算总黄酮含量。 2.2 Box-Behnken效应面法实验设计[11] 根据前期的单因素试验结果，采用超声提取法，功率500 W，温度60 ℃，提取2次，选取乙醇浓度A、乙醇体积B、提取时间C为考察因素，以牛大力总黄酮的提取率为响应值，Box-Behnken效应面法的实验设计及结果见表1。
采用Design Expert 7.0.0軟件对表1实验数据进行多元线性回归拟合，得二次多项回归模型方程：Y=-16.052 19+0.198 12A+0.554 58B+0.197 63C+1.500 00×10-3AB-1.500 00×10-4AC+8.333 33×10-5BC-1.387 50×10-3A2-0.015 139B2-1.612 50×10-3C2。结果显示，相关系数R2为0.987 6，变异系数C.V.为1.29%，模型拟合良好。由表2可知，3个考察因素A、B、C的一次项和二次项均达极显著水平（P<0.01），失拟项不显著（P>0.05）。为了直观反映分析结果，采用Design Expert软件作出相应的等高线图和效应面图，如图1、2所示。
2.3 验证试验 根据“2.2”项下的回归方程确定最优工艺：乙醇浓度81.07%，乙醇体积21.63倍，超声提取2次、每次52.51 min，温度60 ℃。在此条件下，牛大力总黄酮理论提取率为3.821 1 mg/g。对最佳提取工艺进行3次验证试验，结果总黄酮平均提取率3.81 mg/g （RSD=0.961%）。验证试验表明，所优选的提取工艺稳定可行、重复性良好。
3 讨论
实验采用Box-Behnken效应面法进行实验设计，优选牛大力总黄酮的提取工艺。Box-Behnken效应面法具有实验次数少，结果预测精度高的特点，很好地解决了多变量问题。在实验设计中，Center Points per Block设定为5，即中心点选择5次重复，用以估计实验误差。
根据前期的单因素试验结果，本次实验选择超声提取法，固定超声功率为500 W、超声温度为60 ℃、提取次数为2次，选取对实验结果影响较大的3个因素（乙醇浓度、乙醇体积和提取时间）进行考察，以减少Box-Behnken效应面法的试验次数。由结果可知，每个因素的交互作用较小，其1次项和2次项对牛大力总黄酮提取率贡献较大。回归模型通过显著性检验及方差分析，具有统计学意义（P<0.01），回归模型可信度好。利用回归模型算出最佳工艺参数，通过验证试验，相对标准偏差RSD值为0.961%，理论值和实验值之间高度吻合，为牛大力的综合利用提供实验依据。
参考文献
[1]广东省食品药品监督管理局. 广东省中药材标准（第一册）[S]. 广州：广东科技出版社，2004：40.
[2]王祝年，赖富丽，王茂媛，等. 牛大力根的化学成分研究[J]. 热带作物学报，2011，32（12）：2378-2380.
[3]王春华，王英，王国才，等. 牛大力的化学成分研究[J]. 中草药，2008，39（7）：972-975.
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[5]郑元升，蒲含林，麻建军. 牛大力多糖对小鼠T淋巴细胞增殖的双向调节作用[J]. 广东药学院学报，2008，24（1）：58-61.
[6]黄翔，王晓平，陈晓白. 中药牛大力抗疲劳抗应激作用的实验研究[J]. 玉林师范学院学报，2014，35（2）：55-58.
[7]王呈文，纪明慧，舒火明，等. 牛大力总黄酮提取工艺及不同萃取物的抗氧化活性研究[J]. 化学研究与应用，2013，25（5）：713-717.
[8]周添浓，刘丹丹，唐立海，等. 牛大力对四氯化碳及酒精所致小鼠急性肝损伤的保护作用[J]. 时珍国医国药，2009，20（10）：2585-2587.
[9]丁新爱. 独一味提取工艺研究[J]. 河南中医学院学报，2006，21（2）：40.
[10]张峻菁，冯珊娜. 正交设计法优选蒲桃中总黄酮的提取工艺[J]. 今日药学，2015，25（8）：571-573.
[11]丘思兰，谭志灿，黄洁靖，等. Box-Behnken效应面法优化侧柏叶总黄酮提取工艺[J]. 云南中医学院学报，2015，38（1）：31-37.
（收稿日期：2019-01-27 编辑：陶希睿）