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摘 要： 大量高质量且能再生的原生质体是真菌遗传转化、基因修饰的重要保证。本试验选用苹果腐烂病菌强致病力菌株SDAU11-175，从酶种类、菌丝年龄、酶解时间、渗透压稳定剂及再生培养基五个方面对原生质体制备及再生条件进行了优化。结果显示：获得苹果腐烂病菌原生质体最大产量的条件是菌丝年龄54 h、3%崩溃酶和3%裂解酶组合、0.7 mol/L NaCl作为渗透压稳定剂、28℃酶解3 h，所得原生质体在YPS培养基上再生效果最好，再生率可达42.21%。
关键词： 苹果腐烂病菌；原生质体；制备；再生
中图分类号： S436.611.1+1 文献标识号：A 文章编号： 1001 - 4942（2014）08 - 0109 - 04
Optimization of Protoplast Preparation and Regeneration Conditions
of Valsa mali var. mali
Chen Liang1， Lun Yingying1， Sun Gengwu1， Zhao Yingtong1，
He Bangling1， Wang Hongkai2*， Liu Huixiang1*
（1. College of Plant Protection， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China；
2. Biotechnology Institute， Zhejiang University， Hangzhou 310058， China）
Abstract Protoplasts with high quality and high regeneration rate are essential in genetic transformation and gene modification of fungi. Using highly pathogenic Valsa mali var. mali strain SDAU11-175 as research object， the protoplast preparation and regeneration conditions were optimized from five aspects of enzyme types， mycelia age， enzymolysis time， osmotic stabilizer and regeneration medium. The results showed that the conditions to obtain the maximum protoplast output were culturing mycelia for 54 hours and treating them with 3% driselase and 3% lysing enzymes for 3 hours at 28℃ using 0.7 mol/L NaCl as osmotic stabilizer. The protoplasts regenerated best on YPS medium with the regeneration rate as 42.21%.
Key words Valsa mali var. mali； Protoplast； Preparation； Regeneration
苹果腐烂病（Apple Valsa Canker）又称烂皮病、臭皮病，是苹果的重要病害之一，其病原主要为 Valsa mali var. mali。 该病菌可引起许多落叶树木的腐烂病[1]，对于苹果树主要通过树体伤口进行侵染，引起树木皮层腐烂溃疡，主枝和较大的侧枝顶梢枯死乃至整株树木死亡，是制约中国、日本以及朝鲜半岛苹果产量的重要因素[2～4]。
目前国内对于苹果腐烂病菌的防控主要从化学、生物及物理防治[5～8]等方面开展了研究，但这些方法都不能很好地控制该病菌。利用遗传操作方法对该病菌进行转化，构建突变体库，寻找致病基因，可以了解其致病机制，提供更好的防控手段。此外利用转化的方法转入报告基因，例如利用 gfp 基因的表达，可以有效地示踪病原菌的侵染过程、定植过程以及与寄主的互作过程[9]，大量高质量且能够再生的原生质体是实现上述转化的必要和关键。对于真菌的原生质体的制备技术，国内外文献均有记载[10～12]，但由于不同真菌细胞壁组成成分有所不同，因此酶解的条件差异较大。本研究首次对苹果腐烂病菌原生质体的制备及再生条件进行了优化，获得了一种高效制备苹果腐烂病菌原生质体的方法，为建立该病菌的遗传转化及其他相关研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌株及试剂 供试菌株为苹果腐烂病菌 （Valsa mali var. mali） SDAU11-175菌株，由本实验室保存。试剂为崩溃酶（Driselase）和溶壁酶（Lyzing Enzymes），美国Sigma公司产品。
1.1.2 培养基 PDA培养基（常规方法），PDB培养基（PDA配方中不添加琼脂粉），PDS培养基（PDA基配方的基础上添加1 mol/L蔗糖），YPD培养基（Yeast extract peptone dextrose medium，酵母提取物 3.5 g，蛋白胨 5 g，葡萄糖 10 g，琼脂粉15 g，加水至1 L），YPS培养基（Yeast extract peptone sucrose medium，YPD配方基础上添加1 mol/L蔗糖）。STC配方：1.2 mol/L山梨醇，10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，50 mmol/L CaCl2。 1.2 试验方法
1.2.1 酶解液的配制 配制0.7 mol/L NaCl溶液，经高温灭菌后，室温存贮备用。6%的酶解液（崩溃酶∶ 溶壁酶=1∶ 1）用上述NaCl溶液进行溶解，待酶完全溶解后，用0.25 μm的微孔滤膜过滤除菌后，4℃保存备用。
1.2.2 菌丝体的制备 取纯培养后的苹果腐烂病菌株接种到PDA平板上，28℃培养3 d后，在菌落上加入3 mL无菌水，用灭菌的涂布器打断菌丝，将菌丝转移到盛有200 mL PDB的三角瓶中，在28 ℃、120 r/min的摇床震荡培养54 h。菌丝体用4层灭菌纱布过滤，并用0.7 mol/L NaCl冲洗3次后收集菌丝体，灭菌滤纸上吸干水分。
1.2.3 原生质体的制备过程 称取1.0 g上述鲜菌丝，盛于50 mL的离心管中，加入10 mL按1.2.1方法配制好的酶解液，在28 ℃、100 r/min的摇床上震荡酶解3 h后，用2层灭菌擦镜纸过滤酶解液， 用0.7 mol/L NaCl溶液冲洗2次，4℃、3 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀即为原生质体，加入适量STC溶液悬浮原生质体，在同样条件下离心2次后，弃上清收获原生质体，用1 mL的STC溶液悬浮原生质体计算产量后，再用STC稀释原生质体到合适的浓度，分装保存在-80℃冰箱备用。
率随酶解时间下降，但综合考虑酶解时间对原生质体产量和再生率影响，3 h为最佳酶解时间。
3 结论与讨论
本试验对细胞壁降解酶、菌丝年龄、酶解时间和渗透压稳定剂4种影响原生质体制备过程的因素以及原生质体的再生进行了研究，获得了一种高效制备苹果腐烂病菌原生质体的方法：菌丝在PDB培养基中培养54 h，用3%崩溃酶和3%裂解酶组合在0.7 mol/L NaCl的渗透压稳定剂中酶解3 h，原生质体在YPS培养基上再生效果最好。
原生质体的制备过程包括两个重要的关键点：一是细胞壁的去除，另外一个是维持原生质体内外的渗透压平衡。试验中两种酶的混合处理比单一酶解效果好，这可能与不同酶间的协同作用有关，混合酶能够更好地降解细胞壁，增加产量[13，14]。渗透压稳定剂是原生质体制备的另一关键因素，本试验中0.7 mol/L的 NaCl作为渗透压稳定剂效果最好，在其他真菌的原生质体制备中KCl、蔗糖、山梨醇都曾被选用作为最佳渗透压稳定剂，但在本试验中效果都不如NaCl，具体原因尚未清楚。
大量高质量且再生率高的原生质体是建立真菌遗传转化体系的基础。本试验优化建立的一套高效苹果腐烂病菌原生质体制备方法，为建立该病菌的遗传转化及其他相关研究奠定了基础。
参 考 文 献：
[1] Kobayashi T. Taxonomic studies of Japanese Diaportliaccac with special reference to their life-histories [J]. Bull. For. Exp. Stn.， Meguro， Tokyo， 1970，231：27-44.
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[3] 曹克强， 国立耘， 李保华， 等. 中国苹果树腐烂病发生和防治情况调查[J]. 植物保护， 2009， 35（2）： 114-117.
[4] Lee D H， Lee S W， Choi K H， et al. Survey on the occurrence of apple diseases in Korea from 1992 to 2000 [J]. Plant Pathology Journal， 2006， 22（4）： 375-380.
[5] 黄银宝. 6 种药剂对苹果腐烂病的防治效果[J]. 甘肃农业科技， 2009 （3）： 34-35.
[6] 邓振山， 赵龙飞， 张薇薇， 等. 银杏内生真菌的分离及其对苹果腐烂病病原菌的拮抗作用[J]. 西北植物学报， 2009， 29（3）： 608-613.
[7] 雷明霞， 王喜平. 蜂胶浸出液在预防苹果腐烂病中的应用探析 [J]. 养蜂科技， 2003 （3）： 40-41.
[8] 李军民. 苹果腐烂病的防控技术[J]. 安徽农学通报， 2011， 17（16）： 111-112.
[9] Lu Z， Tombolini R， Woo S， et al. In vivo study of Trichoderma -pathogen-plant interactions， using constitutive and inducible green fluorescent protein reporter systems[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2004， 70（5）： 3073- 3081.
[10] Feng L， Li C， Xu C， et al. Protoplast formation and regeneration of Rhodococcus sp. BX2[J]. Information Technology and Agricultural Engineering，2012，134：113-120.
[11] 杨迎青，李明海，杨媚，等.水稻纹枯病菌原生质体制备与再生条件的优化[J].华中农业大学学报，2010，29（5）：546- 551.
[12] Liu T H， Lin M J， Ko W H. Factors affecting protoplast formation by Rhizoctonia solani [J]. New Biotechnology， 2010， 27（1）： 64-69.
[13] Tilburn J， Scazzocchio C， Taylor G G， et al. Transformation by integration in Aspergillus nidulans [J]. Gene， 1983， 26（2）： 205-221.
[14] Solis S， Flores M E， Huitron C. Protoplasts from pectinolytic fungi： isolation， regeneration and pectinolytic enzyme production [J]. Letters in Applied Microbiology， 1996， 23（1）： 36- 42.
关键词： 苹果腐烂病菌；原生质体；制备；再生
中图分类号： S436.611.1+1 文献标识号：A 文章编号： 1001 - 4942（2014）08 - 0109 - 04
Optimization of Protoplast Preparation and Regeneration Conditions
of Valsa mali var. mali
Chen Liang1， Lun Yingying1， Sun Gengwu1， Zhao Yingtong1，
He Bangling1， Wang Hongkai2*， Liu Huixiang1*
（1. College of Plant Protection， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China；
2. Biotechnology Institute， Zhejiang University， Hangzhou 310058， China）
Abstract Protoplasts with high quality and high regeneration rate are essential in genetic transformation and gene modification of fungi. Using highly pathogenic Valsa mali var. mali strain SDAU11-175 as research object， the protoplast preparation and regeneration conditions were optimized from five aspects of enzyme types， mycelia age， enzymolysis time， osmotic stabilizer and regeneration medium. The results showed that the conditions to obtain the maximum protoplast output were culturing mycelia for 54 hours and treating them with 3% driselase and 3% lysing enzymes for 3 hours at 28℃ using 0.7 mol/L NaCl as osmotic stabilizer. The protoplasts regenerated best on YPS medium with the regeneration rate as 42.21%.
Key words Valsa mali var. mali； Protoplast； Preparation； Regeneration
苹果腐烂病（Apple Valsa Canker）又称烂皮病、臭皮病，是苹果的重要病害之一，其病原主要为 Valsa mali var. mali。 该病菌可引起许多落叶树木的腐烂病[1]，对于苹果树主要通过树体伤口进行侵染，引起树木皮层腐烂溃疡，主枝和较大的侧枝顶梢枯死乃至整株树木死亡，是制约中国、日本以及朝鲜半岛苹果产量的重要因素[2～4]。
目前国内对于苹果腐烂病菌的防控主要从化学、生物及物理防治[5～8]等方面开展了研究，但这些方法都不能很好地控制该病菌。利用遗传操作方法对该病菌进行转化，构建突变体库，寻找致病基因，可以了解其致病机制，提供更好的防控手段。此外利用转化的方法转入报告基因，例如利用 gfp 基因的表达，可以有效地示踪病原菌的侵染过程、定植过程以及与寄主的互作过程[9]，大量高质量且能够再生的原生质体是实现上述转化的必要和关键。对于真菌的原生质体的制备技术，国内外文献均有记载[10～12]，但由于不同真菌细胞壁组成成分有所不同，因此酶解的条件差异较大。本研究首次对苹果腐烂病菌原生质体的制备及再生条件进行了优化，获得了一种高效制备苹果腐烂病菌原生质体的方法，为建立该病菌的遗传转化及其他相关研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
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1.1.2 培养基 PDA培养基（常规方法），PDB培养基（PDA配方中不添加琼脂粉），PDS培养基（PDA基配方的基础上添加1 mol/L蔗糖），YPD培养基（Yeast extract peptone dextrose medium，酵母提取物 3.5 g，蛋白胨 5 g，葡萄糖 10 g，琼脂粉15 g，加水至1 L），YPS培养基（Yeast extract peptone sucrose medium，YPD配方基础上添加1 mol/L蔗糖）。STC配方：1.2 mol/L山梨醇，10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，50 mmol/L CaCl2。 1.2 试验方法
1.2.1 酶解液的配制 配制0.7 mol/L NaCl溶液，经高温灭菌后，室温存贮备用。6%的酶解液（崩溃酶∶ 溶壁酶=1∶ 1）用上述NaCl溶液进行溶解，待酶完全溶解后，用0.25 μm的微孔滤膜过滤除菌后，4℃保存备用。
1.2.2 菌丝体的制备 取纯培养后的苹果腐烂病菌株接种到PDA平板上，28℃培养3 d后，在菌落上加入3 mL无菌水，用灭菌的涂布器打断菌丝，将菌丝转移到盛有200 mL PDB的三角瓶中，在28 ℃、120 r/min的摇床震荡培养54 h。菌丝体用4层灭菌纱布过滤，并用0.7 mol/L NaCl冲洗3次后收集菌丝体，灭菌滤纸上吸干水分。
1.2.3 原生质体的制备过程 称取1.0 g上述鲜菌丝，盛于50 mL的离心管中，加入10 mL按1.2.1方法配制好的酶解液，在28 ℃、100 r/min的摇床上震荡酶解3 h后，用2层灭菌擦镜纸过滤酶解液， 用0.7 mol/L NaCl溶液冲洗2次，4℃、3 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀即为原生质体，加入适量STC溶液悬浮原生质体，在同样条件下离心2次后，弃上清收获原生质体，用1 mL的STC溶液悬浮原生质体计算产量后，再用STC稀释原生质体到合适的浓度，分装保存在-80℃冰箱备用。
率随酶解时间下降，但综合考虑酶解时间对原生质体产量和再生率影响，3 h为最佳酶解时间。
3 结论与讨论
本试验对细胞壁降解酶、菌丝年龄、酶解时间和渗透压稳定剂4种影响原生质体制备过程的因素以及原生质体的再生进行了研究，获得了一种高效制备苹果腐烂病菌原生质体的方法：菌丝在PDB培养基中培养54 h，用3%崩溃酶和3%裂解酶组合在0.7 mol/L NaCl的渗透压稳定剂中酶解3 h，原生质体在YPS培养基上再生效果最好。
原生质体的制备过程包括两个重要的关键点：一是细胞壁的去除，另外一个是维持原生质体内外的渗透压平衡。试验中两种酶的混合处理比单一酶解效果好，这可能与不同酶间的协同作用有关，混合酶能够更好地降解细胞壁，增加产量[13，14]。渗透压稳定剂是原生质体制备的另一关键因素，本试验中0.7 mol/L的 NaCl作为渗透压稳定剂效果最好，在其他真菌的原生质体制备中KCl、蔗糖、山梨醇都曾被选用作为最佳渗透压稳定剂，但在本试验中效果都不如NaCl，具体原因尚未清楚。
大量高质量且再生率高的原生质体是建立真菌遗传转化体系的基础。本试验优化建立的一套高效苹果腐烂病菌原生质体制备方法，为建立该病菌的遗传转化及其他相关研究奠定了基础。
参 考 文 献：
[1] Kobayashi T. Taxonomic studies of Japanese Diaportliaccac with special reference to their life-histories [J]. Bull. For. Exp. Stn.， Meguro， Tokyo， 1970，231：27-44.
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[4] Lee D H， Lee S W， Choi K H， et al. Survey on the occurrence of apple diseases in Korea from 1992 to 2000 [J]. Plant Pathology Journal， 2006， 22（4）： 375-380.
[5] 黄银宝. 6 种药剂对苹果腐烂病的防治效果[J]. 甘肃农业科技， 2009 （3）： 34-35.
[6] 邓振山， 赵龙飞， 张薇薇， 等. 银杏内生真菌的分离及其对苹果腐烂病病原菌的拮抗作用[J]. 西北植物学报， 2009， 29（3）： 608-613.
[7] 雷明霞， 王喜平. 蜂胶浸出液在预防苹果腐烂病中的应用探析 [J]. 养蜂科技， 2003 （3）： 40-41.
[8] 李军民. 苹果腐烂病的防控技术[J]. 安徽农学通报， 2011， 17（16）： 111-112.
[9] Lu Z， Tombolini R， Woo S， et al. In vivo study of Trichoderma -pathogen-plant interactions， using constitutive and inducible green fluorescent protein reporter systems[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2004， 70（5）： 3073- 3081.
[10] Feng L， Li C， Xu C， et al. Protoplast formation and regeneration of Rhodococcus sp. BX2[J]. Information Technology and Agricultural Engineering，2012，134：113-120.
[11] 杨迎青，李明海，杨媚，等.水稻纹枯病菌原生质体制备与再生条件的优化[J].华中农业大学学报，2010，29（5）：546- 551.
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[13] Tilburn J， Scazzocchio C， Taylor G G， et al. Transformation by integration in Aspergillus nidulans [J]. Gene， 1983， 26（2）： 205-221.
[14] Solis S， Flores M E， Huitron C. Protoplasts from pectinolytic fungi： isolation， regeneration and pectinolytic enzyme production [J]. Letters in Applied Microbiology， 1996， 23（1）： 36- 42.