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摘 要 从NCBI的dbEST数据库中下载假臭草同族植物的EST序列，经EST序列处理及SSR位点查询，首次设计了27对假臭草EST-SSRs引物，以海南省文昌市假臭草DNA为模板，采用单因素和L16（45）正交试验对其EST-SSRs PCR反应体系进行优化。建立了假臭草EST-SSRs最佳20 μLPCR反应体系：Mg2+浓度为2.75 mmol/L，模板DNA用量为35 ng，Tag DNA聚合酶为2.25 U，dNTPs浓度为0.3 mmol/L，引物浓度为0.6 μmmol/L。并用14个不同来源的假臭草样本对其体系进行验证实验，结果均能获得稳定的、清晰明亮的扩增谱带。假臭草EST-SSRs 标记的开发为深入研究其遗传多样性提供了基础。
关键词 假臭草 ；EST-SSRs ；引物设计 ；优化
分类号 Q754 ；S451
Abstract In this study， we download ESTs form dbEST database and first designed 27 primer pairs for Praxelis clematidea after EST pretreatment and SSR locus identification. The sample were collected from Wenchang City in Hainan province as DNA template， and the optimization and establishment of EST-derived SSR-PCR reaction system for Praxelis clematidea was carried out by single factor test and orthogonal experiment design of L16（45）. The result was indicated that the optimal EST-SSRs PCR reaction system （20 μL） was contained 2.75 mmol/L Mg2+， 35 ng DNA template， 2.25 U Tag DNA polymerase， 0.3 mmol/L dNTPs and 0.6 μmol/L primer. This system was tested by 14 Praxelis clematidea from different places， which stable and clear polymorphic bands were acquired. Accordingly， the development of EST-SSRs can be used for the genetic diversity research of Praxelis clematidea.
Keywords Praxelis clematidea ； EST-SSRs ； primer design ； optimization
假臭草（Praxelis clematidea R. M. King & H. Robinson）是菊科（Composite）假臭草属（Praxelis）植物[1]，原产南美洲，传入中国后曾一直被误认为藿香蓟（Ageratum conyzoides linn.）或熊耳草（Ageratum houstonianum Miller）[2-3]。假臭草适应性强，对土壤养分有较强的吸收力，种子具冠毛，易于传播和对其它植物受体有化感作用，对中国华南入侵生境破坏严重[4-5]。假臭草EST-SSRs分子标记的开发，为其遗传多样性研究及其近缘种的鉴定提供了基础。
EST（Expressed sequence tags）是通过对由mRNA逆转录成的cDNA克隆测序得到的一部分序列，代表着一定条件下基因组的部分转录信息[6]，是一段完整的或部分的基因表达序列，相比SSR而言，EST-SSRs在近缘种间具有更高的通用性和保守性[7]。EST-SSRs分子标记是基于PCR的标记手段，PCR结果受到Tag聚合酶﹑Mg2+浓度、DNA模板浓度、dNTPs浓度及引物浓度的相互影响，因此，ESR-SSRs标记的开发必须建立稳定可靠的PCR反应体系。假臭草EST-SSRs标记的开发未见报道，本研究的主要目的为：（1）利用EST-SSRs的可通用性特征[7-8]，以假臭草近缘种的EST序列设计EST-SSRs引物；（2）采用单因素试验设计对PCR反应体系中五因素（Tag DNA聚合酶、Mg2+浓度、DNA模板、dNTPs及引物浓度）设置不同的水平梯度，筛选出最适浓度范围；（3）基于单因素结果，设计L16（45）正交试验，建立假臭草EST-SSRs标记的最佳PCR反应体系。
1 材料和方法
1.1 材料
假臭草样品来源于海南省和广东省不同市县，见表1。采摘新鲜叶片，硅胶封装，转至-20℃冰箱保存、备用。
1.2 方法
1.2.1 假臭草基因组DNA的提取与检测
采用改良的CTAB法提取假臭草基因组DNA[9]。1%琼脂糖凝胶电泳检测，ND-2000超微量紫外分光光度计测出基因组DNA母液浓度（ng/μL）和纯度（A260/A280），并将母液用灭菌ddH2O稀释为10 ng/μL的工作液，-20℃保存备用。
1.2.2 EST-SSRs标记引物的设计和筛选
目前为止，NCBI（National Center for Biotechnology Information）的dbEST数据库中没有公布假臭草EST序列，根据EST-SSRs标记的可通用性特征，分别下载了假臭草同族植物胜红蓟（A. conyzoides）、薇甘菊（Mikania micrantha）和甜叶菊（Stevia rebaudiana）的EST序列设计引物（截止2013年6月）。对下载的EST序列进行预处理：保留长度100～700 bp（5′～3′）的EST序列，用DNA Star软件去除序列中的载体、重复和PolyA/T序列[10-11]，获得最低冗余度的EST序列。SSRIT（Simple Sequence Repeat Identification Tool）软件查找EST中的SSR位点（http：//www.gramene.org /gramene/search es/ssrtool），SSR位点筛选的标准为：含二﹑三﹑四﹑五﹑六核苷酸基元的最小重复数依次为8﹑6﹑5﹑4和3次。用Primer Premer 5.0软件设计EST-SSRs引物，引物设计的主要参数为：（1）退火温度为50～60℃；（2）引物长度为18～24 bp，20 bp最佳；（3）PCR产物长在100～500 bp；（4）GC%含量为40%～60%[12]。首次设计了27对EST-SSRs引物（表2），送往上海生工生物工程有限公司合成。以扩增谱带清晰明亮、具有多态性为标准，对27对引物进行筛选，筛选的反应体系为：20 μL PCR反应体系中，Mg2+浓度为2.5 mmol/L，模板DNA用量为20 ng，Tag DNA聚合酶为1.5 U，dNTPs浓度为0.25 mmol/L，引物浓度为0.6 μmol/L，PCR扩增反应程序：94℃。预变性5 min，然后按94℃变性50 s，53℃退火40 S，72℃延伸70 S，40次循环；72℃延伸5 min[13]。根据实验结果，筛选得出最优的引物作为PCR反应体系的引物。 1.2.3 EST-SSRs标记PCR反应的单因素试验
分别对模板Mg2+、dNTPs、引物、Tag酶及DNA模板进行梯度试验，筛选最佳适宜浓度范围。Mg2+浓度试验中设0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50、2.75、3.00 mmol/L 10个梯度；dNTPs浓度试验中设0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mmol/L 8个梯度；引物浓度设0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 μmol/L 8个梯度；Tag酶浓度设0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50、2.75、3.00 U/20μL 11个梯度；DNA模板量设10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、80、100 ng/20μL 12个梯度。PCR反应程序同1.2.2。
1.2.4 EST-SSRs标记PCR反应因素水平的正交试验设计
基于1.2.3筛选出的EST-SSRs标记PCR反应体系中模板DNA、Tag酶、Mg2+、引物及dNTPs浓度五因素的适宜浓度范围，运用正交辅助软件构建L16（45）正交试验表，设计模板DNA、Mg2+、引物、dNTPs及Tag酶五因素和不同浓度的4水平正交试验（表3）。根据表3，制备总体积为20 μL的PCR反应体系，除了表中的五因素外，加入2.0 μL 10×PCR buffer，不足20 μL用灭菌dd H2O补足，PCR反应程序同1.2.2。
1.2.5 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染
对单因素试验和正交试验设计的PCR扩增产物进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，DL2000为Marker，220 V电压下电泳2 h。电泳完后，用蒸馏水清洗凝胶2次，放入500 mL的0.1%硝酸银染色液中浸泡10 min，取出凝胶并再次用蒸馏水清洗2次，放入500 mL的显影液中显影。银染结果用数码相机拍照保存。
1.2.6 数据处理
根据扩增条带的敏感性与特异性即条带强弱及杂带的多少作1～16分记分，分数越高，表示敏感性、特异性越好[14]。3次重复独立打分，根据得分计算各因素同一水平的试验值之和（Ki）和该水平下的数据平均值（ki），并计算同一因素不同水平间的极差R。每一因素水平下的数据平均值ki反映了因素各水平间对PCR反应体系的影响情况，PCR反应体系优化时，应选取ki最大值对应的最适浓度水平。
2 结果与分析
2.1 CTAB法提取假臭草基因组DNA
从琼脂糖凝胶电泳图（图1）可以看出，提取的假臭草基因组DNA的电泳条带单一，清晰明亮，点样孔无滞留，ND-2000超微量紫外分光光度计检测结果显示DNA的A260/A230比值为1.8～1.9，A260/A230比值为2.2～2.4，满足EST-SSRs标记需求。
2.2 引物筛选
依据扩增条带的敏感性、特异性和数量，筛选出srSSR716作为PCR反应体系的最佳引物。
2.3 EST-SSRs标记PCR反应体系的单因素试验分析
2.3.1 Mg2+浓度对EST-SSRs标记的PCR扩增影响
Mg2+不同水平梯度试验结果显示（图2-A），当Mg2+浓度为0.75～2.25 mmol/L时，有2条扩增谱带，条带清晰但却有一定的弥散和拖尾现象；当Mg2+浓度为2.25～3.00 mmol/L时，有3条扩增普带，条带清晰明亮，弥散和拖尾现象不明显，因此，假臭草EST-SSRs PCR反应 体系中Mg2+浓度的适宜浓度范围为2.25～3.00 mmol/L。
2.3.2 dNTPs浓度对EST-SSRs标记的PCR扩增影响
dNTPs参与新链DNA的合成，直接影响PCR的产量。由图2-B所示，当dNTPs浓度为0.05 mmol/L时，PCR产物产量少，扩增谱带不清晰，DNA条带较弱；当dNTPs浓度为0.05～0.20 mmol/L时，扩增谱带的清晰度与浓度的大小呈正相关性；当dNTPs浓度为0.25～0.40 mmol/L时，扩增谱带清晰完整，但随着dNTPs浓度的增大，DNA条带并没有显著的变化。因此，假臭草EST-SSRs PCR反应体系中dNTPs浓度的适宜浓度范围为0.25～0.40 mmol/L。
2.3.3 引物浓度对EST-SSRs标记的PCR扩增影响
由图2-C可以看出，PCR的产量与引物浓度呈正相关性，当引物浓度为0.1～0.2 μmol/L时，扩增谱带较弱，不清晰；当引物浓度为0.3～0.4 μmol/L时，随着浓度的增加，扩增谱带变得清晰明亮；当引物浓度为0.5～0.7 μmol/L时，扩增谱带清晰明亮，但并没有随着浓度的增加而呈现出明显的变化；当引物浓度为0.8 μmol/L时，扩增谱带开始出现弥散现象。因此，假臭草EST-SSRs PCR反应体系中引物浓度的适宜浓度范围为0.4～0.8 μmol/L。
2.3.4 Tag DNA聚合酶用量对EST-SSRs标记的PCR扩增影响
Tag酶的用量影响PCR扩增的效率。由图2-D 可见，Tag酶用量过低时，PCR扩增效率低下，当Tag酶用量为0.50～2.00 U时，有扩增谱带出现，但同一Tag酶用量下，DNA条带间清晰不一；当Tag酶用量为2.25～3.00 U时，扩增谱带清晰度随Tag酶用量的增加而增大。因此，假臭草EST-SSRs PCR反应体系中Tag DNA聚合酶用量的适宜浓度范围为2.25～3.00 U。
2.3.5 模板DNA量对EST-SSRs标记的PCR扩增影响 模板DNA的质量和用量影响PCR结果的敏感性和扩增效率。由图2-E所示，当模板DNA用量为10、15、20 ng/20μL 时，扩增谱带有缺失的现象，相比其他用量而言，DNA条带较弱；当模板DNA用量为40、45、50、60、80、100 ng/20μL时，随着模板DNA用量的增加，PCR结果的敏感性降低，出现非特异性DNA条带，且存在弥散现象；当模板DNA用量为25、30、35 ng/20 μL 时，扩增谱带清晰明亮。因此，假臭草EST-SSRs PCR反应体系中模板DNA量的适宜浓度范围为25～35 ng/20 μL。
2.4 EST-SSRs标记PCR反应体系的正交试验设计分析
实验数据结果显示，EST-SSRs标记PCR反应体系中5个因素的最佳反应水平为A4B3C3D1E2（表4），并不在正交组合表中出现，但与组合9和组合15接近。
2.5 PCR最佳反应体系的稳定性验证
根据正交设计数据分析及PCR扩增产物电泳结果（图3），结合经济原则，选择组合15为最优反应体系，对海南和广东地区的14个假臭草样本进行PCR扩增的结果（图4）显示，扩增谱带清晰明亮，稳定性好，具有多态性。
3 讨论与结论
3.1 EST-SSRs引物的设计
引物的设计是一个复杂的问题：涉及目的条带的长度大小（如大片段的cDNA，小片段的点突变基因及其侧翼序列）；模板DNA的复杂程度[11]；引物设计的软件（Premier Primer、Oligo、Dnastar、Primer-BLAST等）[16]；以及主要参数的差异（引物长度、Tm值、GC%含量、预产物长度），都会导致引物设计结果的变化。
3.2 假臭草EST-SSRs标记PCR反应体系优化
单因素设计仅对PCR反应体系进行优化，不能检测PCR反应体系中各因素间的交互作用，可能会导致亚优化结果的产生[17]，而正交设计试验可以弥补这一缺点，可以了解各因素间的内在规律，找到最佳的水平组合。另外，EST序列中缺乏内含子序列，EST-SSRs标记的对象是基因组DNA，因此，基因组DNA中未识别的内含子剪接位点会干扰引物与模板的结合，导致扩增失败，引物结合位点之间的内含子会导致扩增产物过长，或者扩增失败[8]，如图4中显示，HWC的扩增产物过长。在类群间，内含子位点是相对保守的，同时可以通过与模式植物，如拟南芥或水稻的基因组序列校准提高引物的效率。
本实验中Mg2+浓度对PCR扩增的特异性和产量具有显著影响，PCR反应体系中的Tag DNA聚合酶需要 Mg2+来激活，适量的Mg2+浓度可以提高Tag酶的活性，浓度过高则抑制Tag酶的活性，过低则无法彻底激活Tag酶的活性[18]。dNTPs作为PCR反应的原料，其浓度的大小直接影响PCR的产量，浓度过低，扩增谱带较弱甚至无带，过高则与Tag酶发生竞争性抑制，争夺Mg2+，抑制PCR反应[19]。从单因素试验结果来看，引物浓度超过一定值后，随着浓度的增加，PCR结果并没有明显的变化，相对于PCR反应体系中其他4个因素而言，引物的优化应偏向于经济角度考虑[20]。Tag酶的用量直接影响PCR的扩增效率，酶量过多，不仅增加实验成本，同时也会提高错配率，引起非特异性扩增，用量过低则导致酶与引物无法完美的结合。模板DNA的质量和用量影响PCR的敏感性和扩增效率，图2-E所示，模板DNA用量不同，其扩增结果有显著差异，用量过多时，扩增谱带出现弥散和变弱的现象。正交直观分析结果显示的最佳PCR反应体系并不在正交组合中，但与组合9和组合15接近，然而与组合15相比，组合9中对Tag酶和引物的需求量较多，从经济角度考虑，节约成本，最终选择组合15为假臭草EST-SSRs标记的PCR最优反应体系，即在20 μL的反应体系中，Mg2+浓度为2.75 mmol/L，模板DNA用量为35 ng，Tag DNA聚合酶为2.25 U，dNTPs 浓度为0.3 mmol/L，引物浓度为0.6 μmol/L。与甘蔗[21]、茄子[22]以及蔷薇科植物[23]相比，假臭草EST-SSRs PCR最优反应体系中的Tag酶用量偏高，这可能是由于研究对象以及样品处理方式的差异所导致的。
3.3 EST-SSRs标记的可通用性研究
目前，关于EST-SSRs标记的可通用性研究已取得了一定的成果。Malay等[24]研究发现，苇状羊茅（Festuca arundinacea Schreb.）的EST-SSRs引物在11种禾本科植物间产生清晰的扩增谱带，可用于羊茅属和黑麦草属的遗传研究。 Gasic等[23]研究苹果EST-SSRs引物在50种蔷薇科植物间的通用性，其通用能力为25%（杏子）～59%（梨），其中11对引物可进一步用于蔷薇科植物间的通用性研究。小麦[25]、茄子[22]等也有EST-SSRs通用性研究的相关报道。本研究开发的EST-SSRs标记在14个假臭草样本的稳定性验证结果同样表明，使用胜红蓟、薇甘菊和甜叶菊EST序列建立起来的EST-SSRs标记也可用于研究近缘种假臭草的遗传多样性。
致 谢 感谢国家标本平台教学标本子平台资助（http：//mnh.scu.edu.cn/）。
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关键词 假臭草 ；EST-SSRs ；引物设计 ；优化
分类号 Q754 ；S451
Abstract In this study， we download ESTs form dbEST database and first designed 27 primer pairs for Praxelis clematidea after EST pretreatment and SSR locus identification. The sample were collected from Wenchang City in Hainan province as DNA template， and the optimization and establishment of EST-derived SSR-PCR reaction system for Praxelis clematidea was carried out by single factor test and orthogonal experiment design of L16（45）. The result was indicated that the optimal EST-SSRs PCR reaction system （20 μL） was contained 2.75 mmol/L Mg2+， 35 ng DNA template， 2.25 U Tag DNA polymerase， 0.3 mmol/L dNTPs and 0.6 μmol/L primer. This system was tested by 14 Praxelis clematidea from different places， which stable and clear polymorphic bands were acquired. Accordingly， the development of EST-SSRs can be used for the genetic diversity research of Praxelis clematidea.
Keywords Praxelis clematidea ； EST-SSRs ； primer design ； optimization
假臭草（Praxelis clematidea R. M. King & H. Robinson）是菊科（Composite）假臭草属（Praxelis）植物[1]，原产南美洲，传入中国后曾一直被误认为藿香蓟（Ageratum conyzoides linn.）或熊耳草（Ageratum houstonianum Miller）[2-3]。假臭草适应性强，对土壤养分有较强的吸收力，种子具冠毛，易于传播和对其它植物受体有化感作用，对中国华南入侵生境破坏严重[4-5]。假臭草EST-SSRs分子标记的开发，为其遗传多样性研究及其近缘种的鉴定提供了基础。
EST（Expressed sequence tags）是通过对由mRNA逆转录成的cDNA克隆测序得到的一部分序列，代表着一定条件下基因组的部分转录信息[6]，是一段完整的或部分的基因表达序列，相比SSR而言，EST-SSRs在近缘种间具有更高的通用性和保守性[7]。EST-SSRs分子标记是基于PCR的标记手段，PCR结果受到Tag聚合酶﹑Mg2+浓度、DNA模板浓度、dNTPs浓度及引物浓度的相互影响，因此，ESR-SSRs标记的开发必须建立稳定可靠的PCR反应体系。假臭草EST-SSRs标记的开发未见报道，本研究的主要目的为：（1）利用EST-SSRs的可通用性特征[7-8]，以假臭草近缘种的EST序列设计EST-SSRs引物；（2）采用单因素试验设计对PCR反应体系中五因素（Tag DNA聚合酶、Mg2+浓度、DNA模板、dNTPs及引物浓度）设置不同的水平梯度，筛选出最适浓度范围；（3）基于单因素结果，设计L16（45）正交试验，建立假臭草EST-SSRs标记的最佳PCR反应体系。
1 材料和方法
1.1 材料
假臭草样品来源于海南省和广东省不同市县，见表1。采摘新鲜叶片，硅胶封装，转至-20℃冰箱保存、备用。
1.2 方法
1.2.1 假臭草基因组DNA的提取与检测
采用改良的CTAB法提取假臭草基因组DNA[9]。1%琼脂糖凝胶电泳检测，ND-2000超微量紫外分光光度计测出基因组DNA母液浓度（ng/μL）和纯度（A260/A280），并将母液用灭菌ddH2O稀释为10 ng/μL的工作液，-20℃保存备用。
1.2.2 EST-SSRs标记引物的设计和筛选
目前为止，NCBI（National Center for Biotechnology Information）的dbEST数据库中没有公布假臭草EST序列，根据EST-SSRs标记的可通用性特征，分别下载了假臭草同族植物胜红蓟（A. conyzoides）、薇甘菊（Mikania micrantha）和甜叶菊（Stevia rebaudiana）的EST序列设计引物（截止2013年6月）。对下载的EST序列进行预处理：保留长度100～700 bp（5′～3′）的EST序列，用DNA Star软件去除序列中的载体、重复和PolyA/T序列[10-11]，获得最低冗余度的EST序列。SSRIT（Simple Sequence Repeat Identification Tool）软件查找EST中的SSR位点（http：//www.gramene.org /gramene/search es/ssrtool），SSR位点筛选的标准为：含二﹑三﹑四﹑五﹑六核苷酸基元的最小重复数依次为8﹑6﹑5﹑4和3次。用Primer Premer 5.0软件设计EST-SSRs引物，引物设计的主要参数为：（1）退火温度为50～60℃；（2）引物长度为18～24 bp，20 bp最佳；（3）PCR产物长在100～500 bp；（4）GC%含量为40%～60%[12]。首次设计了27对EST-SSRs引物（表2），送往上海生工生物工程有限公司合成。以扩增谱带清晰明亮、具有多态性为标准，对27对引物进行筛选，筛选的反应体系为：20 μL PCR反应体系中，Mg2+浓度为2.5 mmol/L，模板DNA用量为20 ng，Tag DNA聚合酶为1.5 U，dNTPs浓度为0.25 mmol/L，引物浓度为0.6 μmol/L，PCR扩增反应程序：94℃。预变性5 min，然后按94℃变性50 s，53℃退火40 S，72℃延伸70 S，40次循环；72℃延伸5 min[13]。根据实验结果，筛选得出最优的引物作为PCR反应体系的引物。 1.2.3 EST-SSRs标记PCR反应的单因素试验
分别对模板Mg2+、dNTPs、引物、Tag酶及DNA模板进行梯度试验，筛选最佳适宜浓度范围。Mg2+浓度试验中设0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50、2.75、3.00 mmol/L 10个梯度；dNTPs浓度试验中设0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mmol/L 8个梯度；引物浓度设0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 μmol/L 8个梯度；Tag酶浓度设0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50、2.75、3.00 U/20μL 11个梯度；DNA模板量设10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、80、100 ng/20μL 12个梯度。PCR反应程序同1.2.2。
1.2.4 EST-SSRs标记PCR反应因素水平的正交试验设计
基于1.2.3筛选出的EST-SSRs标记PCR反应体系中模板DNA、Tag酶、Mg2+、引物及dNTPs浓度五因素的适宜浓度范围，运用正交辅助软件构建L16（45）正交试验表，设计模板DNA、Mg2+、引物、dNTPs及Tag酶五因素和不同浓度的4水平正交试验（表3）。根据表3，制备总体积为20 μL的PCR反应体系，除了表中的五因素外，加入2.0 μL 10×PCR buffer，不足20 μL用灭菌dd H2O补足，PCR反应程序同1.2.2。
1.2.5 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染
对单因素试验和正交试验设计的PCR扩增产物进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，DL2000为Marker，220 V电压下电泳2 h。电泳完后，用蒸馏水清洗凝胶2次，放入500 mL的0.1%硝酸银染色液中浸泡10 min，取出凝胶并再次用蒸馏水清洗2次，放入500 mL的显影液中显影。银染结果用数码相机拍照保存。
1.2.6 数据处理
根据扩增条带的敏感性与特异性即条带强弱及杂带的多少作1～16分记分，分数越高，表示敏感性、特异性越好[14]。3次重复独立打分，根据得分计算各因素同一水平的试验值之和（Ki）和该水平下的数据平均值（ki），并计算同一因素不同水平间的极差R。每一因素水平下的数据平均值ki反映了因素各水平间对PCR反应体系的影响情况，PCR反应体系优化时，应选取ki最大值对应的最适浓度水平。
2 结果与分析
2.1 CTAB法提取假臭草基因组DNA
从琼脂糖凝胶电泳图（图1）可以看出，提取的假臭草基因组DNA的电泳条带单一，清晰明亮，点样孔无滞留，ND-2000超微量紫外分光光度计检测结果显示DNA的A260/A230比值为1.8～1.9，A260/A230比值为2.2～2.4，满足EST-SSRs标记需求。
2.2 引物筛选
依据扩增条带的敏感性、特异性和数量，筛选出srSSR716作为PCR反应体系的最佳引物。
2.3 EST-SSRs标记PCR反应体系的单因素试验分析
2.3.1 Mg2+浓度对EST-SSRs标记的PCR扩增影响
Mg2+不同水平梯度试验结果显示（图2-A），当Mg2+浓度为0.75～2.25 mmol/L时，有2条扩增谱带，条带清晰但却有一定的弥散和拖尾现象；当Mg2+浓度为2.25～3.00 mmol/L时，有3条扩增普带，条带清晰明亮，弥散和拖尾现象不明显，因此，假臭草EST-SSRs PCR反应 体系中Mg2+浓度的适宜浓度范围为2.25～3.00 mmol/L。
2.3.2 dNTPs浓度对EST-SSRs标记的PCR扩增影响
dNTPs参与新链DNA的合成，直接影响PCR的产量。由图2-B所示，当dNTPs浓度为0.05 mmol/L时，PCR产物产量少，扩增谱带不清晰，DNA条带较弱；当dNTPs浓度为0.05～0.20 mmol/L时，扩增谱带的清晰度与浓度的大小呈正相关性；当dNTPs浓度为0.25～0.40 mmol/L时，扩增谱带清晰完整，但随着dNTPs浓度的增大，DNA条带并没有显著的变化。因此，假臭草EST-SSRs PCR反应体系中dNTPs浓度的适宜浓度范围为0.25～0.40 mmol/L。
2.3.3 引物浓度对EST-SSRs标记的PCR扩增影响
由图2-C可以看出，PCR的产量与引物浓度呈正相关性，当引物浓度为0.1～0.2 μmol/L时，扩增谱带较弱，不清晰；当引物浓度为0.3～0.4 μmol/L时，随着浓度的增加，扩增谱带变得清晰明亮；当引物浓度为0.5～0.7 μmol/L时，扩增谱带清晰明亮，但并没有随着浓度的增加而呈现出明显的变化；当引物浓度为0.8 μmol/L时，扩增谱带开始出现弥散现象。因此，假臭草EST-SSRs PCR反应体系中引物浓度的适宜浓度范围为0.4～0.8 μmol/L。
2.3.4 Tag DNA聚合酶用量对EST-SSRs标记的PCR扩增影响
Tag酶的用量影响PCR扩增的效率。由图2-D 可见，Tag酶用量过低时，PCR扩增效率低下，当Tag酶用量为0.50～2.00 U时，有扩增谱带出现，但同一Tag酶用量下，DNA条带间清晰不一；当Tag酶用量为2.25～3.00 U时，扩增谱带清晰度随Tag酶用量的增加而增大。因此，假臭草EST-SSRs PCR反应体系中Tag DNA聚合酶用量的适宜浓度范围为2.25～3.00 U。
2.3.5 模板DNA量对EST-SSRs标记的PCR扩增影响 模板DNA的质量和用量影响PCR结果的敏感性和扩增效率。由图2-E所示，当模板DNA用量为10、15、20 ng/20μL 时，扩增谱带有缺失的现象，相比其他用量而言，DNA条带较弱；当模板DNA用量为40、45、50、60、80、100 ng/20μL时，随着模板DNA用量的增加，PCR结果的敏感性降低，出现非特异性DNA条带，且存在弥散现象；当模板DNA用量为25、30、35 ng/20 μL 时，扩增谱带清晰明亮。因此，假臭草EST-SSRs PCR反应体系中模板DNA量的适宜浓度范围为25～35 ng/20 μL。
2.4 EST-SSRs标记PCR反应体系的正交试验设计分析
实验数据结果显示，EST-SSRs标记PCR反应体系中5个因素的最佳反应水平为A4B3C3D1E2（表4），并不在正交组合表中出现，但与组合9和组合15接近。
2.5 PCR最佳反应体系的稳定性验证
根据正交设计数据分析及PCR扩增产物电泳结果（图3），结合经济原则，选择组合15为最优反应体系，对海南和广东地区的14个假臭草样本进行PCR扩增的结果（图4）显示，扩增谱带清晰明亮，稳定性好，具有多态性。
3 讨论与结论
3.1 EST-SSRs引物的设计
引物的设计是一个复杂的问题：涉及目的条带的长度大小（如大片段的cDNA，小片段的点突变基因及其侧翼序列）；模板DNA的复杂程度[11]；引物设计的软件（Premier Primer、Oligo、Dnastar、Primer-BLAST等）[16]；以及主要参数的差异（引物长度、Tm值、GC%含量、预产物长度），都会导致引物设计结果的变化。
3.2 假臭草EST-SSRs标记PCR反应体系优化
单因素设计仅对PCR反应体系进行优化，不能检测PCR反应体系中各因素间的交互作用，可能会导致亚优化结果的产生[17]，而正交设计试验可以弥补这一缺点，可以了解各因素间的内在规律，找到最佳的水平组合。另外，EST序列中缺乏内含子序列，EST-SSRs标记的对象是基因组DNA，因此，基因组DNA中未识别的内含子剪接位点会干扰引物与模板的结合，导致扩增失败，引物结合位点之间的内含子会导致扩增产物过长，或者扩增失败[8]，如图4中显示，HWC的扩增产物过长。在类群间，内含子位点是相对保守的，同时可以通过与模式植物，如拟南芥或水稻的基因组序列校准提高引物的效率。
本实验中Mg2+浓度对PCR扩增的特异性和产量具有显著影响，PCR反应体系中的Tag DNA聚合酶需要 Mg2+来激活，适量的Mg2+浓度可以提高Tag酶的活性，浓度过高则抑制Tag酶的活性，过低则无法彻底激活Tag酶的活性[18]。dNTPs作为PCR反应的原料，其浓度的大小直接影响PCR的产量，浓度过低，扩增谱带较弱甚至无带，过高则与Tag酶发生竞争性抑制，争夺Mg2+，抑制PCR反应[19]。从单因素试验结果来看，引物浓度超过一定值后，随着浓度的增加，PCR结果并没有明显的变化，相对于PCR反应体系中其他4个因素而言，引物的优化应偏向于经济角度考虑[20]。Tag酶的用量直接影响PCR的扩增效率，酶量过多，不仅增加实验成本，同时也会提高错配率，引起非特异性扩增，用量过低则导致酶与引物无法完美的结合。模板DNA的质量和用量影响PCR的敏感性和扩增效率，图2-E所示，模板DNA用量不同，其扩增结果有显著差异，用量过多时，扩增谱带出现弥散和变弱的现象。正交直观分析结果显示的最佳PCR反应体系并不在正交组合中，但与组合9和组合15接近，然而与组合15相比，组合9中对Tag酶和引物的需求量较多，从经济角度考虑，节约成本，最终选择组合15为假臭草EST-SSRs标记的PCR最优反应体系，即在20 μL的反应体系中，Mg2+浓度为2.75 mmol/L，模板DNA用量为35 ng，Tag DNA聚合酶为2.25 U，dNTPs 浓度为0.3 mmol/L，引物浓度为0.6 μmol/L。与甘蔗[21]、茄子[22]以及蔷薇科植物[23]相比，假臭草EST-SSRs PCR最优反应体系中的Tag酶用量偏高，这可能是由于研究对象以及样品处理方式的差异所导致的。
3.3 EST-SSRs标记的可通用性研究
目前，关于EST-SSRs标记的可通用性研究已取得了一定的成果。Malay等[24]研究发现，苇状羊茅（Festuca arundinacea Schreb.）的EST-SSRs引物在11种禾本科植物间产生清晰的扩增谱带，可用于羊茅属和黑麦草属的遗传研究。 Gasic等[23]研究苹果EST-SSRs引物在50种蔷薇科植物间的通用性，其通用能力为25%（杏子）～59%（梨），其中11对引物可进一步用于蔷薇科植物间的通用性研究。小麦[25]、茄子[22]等也有EST-SSRs通用性研究的相关报道。本研究开发的EST-SSRs标记在14个假臭草样本的稳定性验证结果同样表明，使用胜红蓟、薇甘菊和甜叶菊EST序列建立起来的EST-SSRs标记也可用于研究近缘种假臭草的遗传多样性。
致 谢 感谢国家标本平台教学标本子平台资助（http：//mnh.scu.edu.cn/）。
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