【摘 要】
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目的 基于定位于线粒体上的Keima(mt-Keima)荧光蛋白研究去氧紫草素对小鼠神经元线粒体自噬的影响.方法 分离mt-Keima转基因和C57BL/6野生型胚胎小鼠大脑皮质神经元(分别命名为mt-Keima神经元和C57BL/6神经元).用激光共聚焦显微镜观察mt-Keima神经元在561和458 nm激发波长下荧光信号,鉴定mt-Keima神经元mt-Keima荧光蛋白的表达.用自噬抑制剂巴弗洛霉素A1100 nmol·L-1处理mt-Keima神经元24 h,用激光共聚焦显微镜观察神经元内的荧光
【机 构】
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国家生物医学分析中心,北京 100850
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目的 基于定位于线粒体上的Keima(mt-Keima)荧光蛋白研究去氧紫草素对小鼠神经元线粒体自噬的影响.方法 分离mt-Keima转基因和C57BL/6野生型胚胎小鼠大脑皮质神经元(分别命名为mt-Keima神经元和C57BL/6神经元).用激光共聚焦显微镜观察mt-Keima神经元在561和458 nm激发波长下荧光信号,鉴定mt-Keima神经元mt-Keima荧光蛋白的表达.用自噬抑制剂巴弗洛霉素A1100 nmol·L-1处理mt-Keima神经元24 h,用激光共聚焦显微镜观察神经元内的荧光信号,分析561和458 nm激发波长下荧光强度比值,检测mt-Keima神经元评价线粒体自噬的可靠性.去氧紫草素100 nmol·L-1处理mt-Keima神经元24 h,用激光共聚焦显微镜观察神经元荧光变化,分析561和458 nm激发波长下荧光强度比值,评价去氧紫草素对线粒体自噬活性的影响.去氧紫草素100 nmol·L-1处理C57BL/6神经元24 h,免疫荧光法检测C57BL/6神经元线粒体外膜受体蛋白Tom20的表达,四甲罗丹明甲酯染料染色后用激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位的变化.结果 激光共聚焦显微镜结果显示,分离的mt-Keima神经元表达mt-Keima蛋白.与二甲亚砜(DMSO)对照组相比,巴弗洛霉素A1100 nmol·L-1处理组561和458 nm激发波长下的荧光强度比值下降(P<0.01),表明线粒体自噬水平降低,mt-Keima神经元可用于检测神经元线粒体自噬活性.与DMSO对照组相比,去氧紫草素100 nmol·L-1处理组mt-Keima神经元在561和458 nm激发波长下荧光强度比值增强(P<0.01),表明mt-Keima神经元线粒体自噬水平增加.免疫荧光结果表明,去氧紫草素100 nmol·L-1处理,可使C57BL/6神经元Tom20蛋白表达降低(P<0.01);激光共聚焦显微镜观察结果显示,去氧紫草素100 nmol·L-1处理,对C57LB/6神经元线粒体膜电位无明显影响.结论 去氧紫草素在不造成线粒体损伤的前提下可促进小鼠原代神经元线粒体自噬.
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