论文部分内容阅读
[摘要] 目的：探讨华蟾素对兔晶状体上皮细胞(Len epithelial cells, LECs)的增殖及DNA的影响。方法：兔LECs分别与终浓度为0.1 mg•L-1、0.2 mg•L-1及0.3 mg•L-1的华蟾素培养72小时。MTT法测定不同浓度的华蟾素对培养的兔LECs的增殖抑制率；DNA电泳观察华蟾素对LECs DNA结构的影响。结果：0.1 mg•L-1～0.3 mg•L-1的华蟾素能明显抑制兔LECs增殖，增殖抑制率随药物浓度的升高而升高；0.1 mg•L-1 ～0.3 mg•L-1浓度的华蟾素在作用72小时后，DNA凝胶电泳可观察到兔LECs出现典型梯状DNA，而空白对照组则为完整DNA。结论：0.1mg•L-1～0.3mg•L-1的华蟾素能抑制LECs增殖、诱导LECs凋亡，可能成为预防后发性白内障的药物之一。
[关键词] 华蟾素 晶状体上皮细胞 抗增殖 DNA结构 凋亡
华蟾素（Cinobufotalin）为纱蟾蜍科动物中华大蟾蜍（Bufobufo gargarizans Cantor）或黑眶蟾蜍（B.melano stictus Schneider）等的全皮提取制剂, 具有清热解毒，利水消肿，化瘀溃坚等作用，已列为国家级中药保护品种并已广泛应用于临床[1]。本研究通过建立兔晶状体上皮细胞（Len epithelial cells, LECs）的体外培养体系，探讨不同浓度的华蟾素干预兔LECs生长的效应及对DNA结构的影响。
l 材料与方法
1.1 实验材料
华蟾素注射液（Cinobufacini Injection）为安徽金蟾生化股份有限公司生产（批号060228-1）；DMEM/F12培养基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA ，均购自美国Gibco公司；DNA Marker、DNA Ladders凋亡检测试剂盒均购自碧云天生物技术公司。
CO2细胞培养箱（371型，美国），超净工作台（BDHC-1300ⅡA/B，苏州），全自动酶标读数仪（美国BioTek ELX808）,Kodak2000凝胶成像系统（美国柯达公司）。
1.2 实验方法
1.2.1兔LECs培养 无菌条件下，取健康新鲜新西兰白兔眼晶状体前囊膜，用含0.01%EDTA和0.25%胰蛋白酶的混合消化液消化后，收集细胞，放入置于37℃、5%CO2、95%空气、100%湿度的CO2培养箱中孵育培养，按1:2传代，取第3代细胞进行药物干预。
1.2.2实验分组 将对数生长期兔LECs分设不加药物的空白对照组和药物干预组，药物干预组加入华蟾素注射液，使终浓度为0.1mg•L-1、0.2 mg•L-1、0.3mg•L-1,加入药物后继续培养72小时。
1.3 观察指标及方法
1.3.1MTT比色法
将对数生长期兔LECs调整至5×104个／mL．按照上述的实验分组每组6个复孔，药物干预2h后MTT比色法计算细胞增殖抑制率。抑制率=（1-实验组吸光度值／对照组吸光度值）×100％。
1.3.2 DNA Ladders电泳
将细胞以5×105/孔接种于6孔板。经过如上述的实验分组及药物干预处理后，按试剂盒（碧云天生物技术公司）说明书操作。DNA抽提完毕将洗脱液中加入1/4体积的酚兰染色，2%琼脂糖凝胶电泳。电泳2h后，在紫外灯下观察并摄影。
1.4 统计学方法
实验数据采用SPSS 12．0软件进行统计学分析，以P<0.05作为差别有统计学意义的检验标准。
2 结果
2.1 MTT结果
空白对照组和药物干预组的吸光度值见表1，ANOVA分析显示各组吸光度值的组间差异F=215.58, P<0.01，药物对LECs的增殖抑制率与药物浓度之间的Spearman相关分析
组比较, ◆P<0.05；与0.3mg•L-1组比较, ★P<0.05。
2.2 华蟾素对兔LEC DNA结构的影响
正常兔LEC DNA仅在原点附近有一区带，药物干预组的兔LEC DNA均显示细胞凋亡的典型特征：DNA梯带谱，即接近180～200 bp整数倍的DNA条带，且随药物浓度的增高凋亡条带明显增强，见图1所示。
M1:Marker1; M2:Marker2; N:正常对照组; a：0.1 mg•L-1药物浓度组; b: 0.2 mg•L-1药物浓度组; c:0.3 mg•L-1药物浓度组。
图1 DNA电泳
3 讨论
后发性白内障（posterior capsule opacity,PCO）严重影响白内障手术复明的效果。有报道其发生率在术后5年，成人30%～43% ，儿童达100% [2]，其预防具有重要意义。
药物预防是目前PCO防治的重要途径之一。由于组织病理学已经证实白内障术后残留的LECs在囊膜上转分化、增生、移行，产生胶原，是发生后囊膜混浊的主要原因，因此能有效抑制晶状体上皮细胞增殖的药物能有效预防PCO的发生[3]。本研究结果浓度0.1mg•L-1~0.3mg•L-1的华蟾素能有效抑制晶状体上皮细胞增殖，且随药物浓度的升高抑制效果明显增强。
本研究的DNA电泳结果显示0.1mg•L-1~0.3mg•L-1的华蟾素作用晶状体上皮细胞72小时后出现特征性 DNA-1adder,提示华蟾素通过诱导晶状体上皮细胞凋亡的方式来抑制其增殖，MTT及DNA电泳结果提示0.1 mg•L-1～0.3 mg•L-1的华蟾素能有效抑制LECs增殖、诱导LECs凋亡，可能成为预防后发性白内障的药物之一。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部) [M].北京:化学工业出版社,2000：附录26.
[2] Sundelin K,Sjostrand J.Posterior capsule opacification 5 years after extracapsular cataract extraction[J].J Cataract Refract Surg,1999,25(2):246-250.
[3] 徐国兴,胡建章,郑卫东,等.基质金属蛋白酶2和金属蛋白酶2组织抑制因子及转化生长因子β1在糖尿病性白内障患者晶状体上皮细胞的表达及意义[J].中华眼科杂志,2003,39(7):411-414.
[关键词] 华蟾素 晶状体上皮细胞 抗增殖 DNA结构 凋亡
华蟾素（Cinobufotalin）为纱蟾蜍科动物中华大蟾蜍（Bufobufo gargarizans Cantor）或黑眶蟾蜍（B.melano stictus Schneider）等的全皮提取制剂, 具有清热解毒，利水消肿，化瘀溃坚等作用，已列为国家级中药保护品种并已广泛应用于临床[1]。本研究通过建立兔晶状体上皮细胞（Len epithelial cells, LECs）的体外培养体系，探讨不同浓度的华蟾素干预兔LECs生长的效应及对DNA结构的影响。
l 材料与方法
1.1 实验材料
华蟾素注射液（Cinobufacini Injection）为安徽金蟾生化股份有限公司生产（批号060228-1）；DMEM/F12培养基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA ，均购自美国Gibco公司；DNA Marker、DNA Ladders凋亡检测试剂盒均购自碧云天生物技术公司。
CO2细胞培养箱（371型，美国），超净工作台（BDHC-1300ⅡA/B，苏州），全自动酶标读数仪（美国BioTek ELX808）,Kodak2000凝胶成像系统（美国柯达公司）。
1.2 实验方法
1.2.1兔LECs培养 无菌条件下，取健康新鲜新西兰白兔眼晶状体前囊膜，用含0.01%EDTA和0.25%胰蛋白酶的混合消化液消化后，收集细胞，放入置于37℃、5%CO2、95%空气、100%湿度的CO2培养箱中孵育培养，按1:2传代，取第3代细胞进行药物干预。
1.2.2实验分组 将对数生长期兔LECs分设不加药物的空白对照组和药物干预组，药物干预组加入华蟾素注射液，使终浓度为0.1mg•L-1、0.2 mg•L-1、0.3mg•L-1,加入药物后继续培养72小时。
1.3 观察指标及方法
1.3.1MTT比色法
将对数生长期兔LECs调整至5×104个／mL．按照上述的实验分组每组6个复孔，药物干预2h后MTT比色法计算细胞增殖抑制率。抑制率=（1-实验组吸光度值／对照组吸光度值）×100％。
1.3.2 DNA Ladders电泳
将细胞以5×105/孔接种于6孔板。经过如上述的实验分组及药物干预处理后，按试剂盒（碧云天生物技术公司）说明书操作。DNA抽提完毕将洗脱液中加入1/4体积的酚兰染色，2%琼脂糖凝胶电泳。电泳2h后，在紫外灯下观察并摄影。
1.4 统计学方法
实验数据采用SPSS 12．0软件进行统计学分析，以P<0.05作为差别有统计学意义的检验标准。
2 结果
2.1 MTT结果
空白对照组和药物干预组的吸光度值见表1，ANOVA分析显示各组吸光度值的组间差异F=215.58, P<0.01，药物对LECs的增殖抑制率与药物浓度之间的Spearman相关分析
组比较, ◆P<0.05；与0.3mg•L-1组比较, ★P<0.05。
2.2 华蟾素对兔LEC DNA结构的影响
正常兔LEC DNA仅在原点附近有一区带，药物干预组的兔LEC DNA均显示细胞凋亡的典型特征：DNA梯带谱，即接近180～200 bp整数倍的DNA条带，且随药物浓度的增高凋亡条带明显增强，见图1所示。
M1:Marker1; M2:Marker2; N:正常对照组; a：0.1 mg•L-1药物浓度组; b: 0.2 mg•L-1药物浓度组; c:0.3 mg•L-1药物浓度组。
图1 DNA电泳
3 讨论
后发性白内障（posterior capsule opacity,PCO）严重影响白内障手术复明的效果。有报道其发生率在术后5年，成人30%～43% ，儿童达100% [2]，其预防具有重要意义。
药物预防是目前PCO防治的重要途径之一。由于组织病理学已经证实白内障术后残留的LECs在囊膜上转分化、增生、移行，产生胶原，是发生后囊膜混浊的主要原因，因此能有效抑制晶状体上皮细胞增殖的药物能有效预防PCO的发生[3]。本研究结果浓度0.1mg•L-1~0.3mg•L-1的华蟾素能有效抑制晶状体上皮细胞增殖，且随药物浓度的升高抑制效果明显增强。
本研究的DNA电泳结果显示0.1mg•L-1~0.3mg•L-1的华蟾素作用晶状体上皮细胞72小时后出现特征性 DNA-1adder,提示华蟾素通过诱导晶状体上皮细胞凋亡的方式来抑制其增殖，MTT及DNA电泳结果提示0.1 mg•L-1～0.3 mg•L-1的华蟾素能有效抑制LECs增殖、诱导LECs凋亡，可能成为预防后发性白内障的药物之一。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部) [M].北京:化学工业出版社,2000：附录26.
[2] Sundelin K,Sjostrand J.Posterior capsule opacification 5 years after extracapsular cataract extraction[J].J Cataract Refract Surg,1999,25(2):246-250.
[3] 徐国兴,胡建章,郑卫东,等.基质金属蛋白酶2和金属蛋白酶2组织抑制因子及转化生长因子β1在糖尿病性白内障患者晶状体上皮细胞的表达及意义[J].中华眼科杂志,2003,39(7):411-414.