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我国是水产品生产、贸易和消费大国，近年来随着人们生活水平的不断提高，斑点叉尾鮰、龙利鱼和巴沙鱼等水产品的消费量逐年增大，进出口贸易量持续增加。这几种水产品主要以加工鱼片的形式进行贸易，在肉质和外观形态上都极其相似，难以辨认，市场上以次充好和国外贸易技术壁垒事件层出不穷。
本实验根据3种鱼的特异性保守基因，设计合成3对特异性引物和探针，建立了斑点叉尾鮰、半滑舌鳎和低眼无齿巨鲶三重荧光PCR鉴定方法，然后进行PCR反应特异性和灵敏性验证。结果表明，本检测方法简单、快速、灵敏度高，检测灵敏度可达到2.25×10-8μg/mL，整个检测时间在2.5h以内，可以同时检测3种易混淆鱼制品，为相关鱼肉制品源性鉴别提供了科学依据，可广泛应用于食品卫生检测以及临床检验等领域。
一、材料与仪器
1.样品来源。实验检测所用的革胡子鲶、南方大口鲶、长丝巨鲇、黄颡鱼、鳗鱼、草鱼、鲤鱼小黄鱼、短吻红舌鳎、斑点叉尾鮰、半滑舌鳎和低眼无齿巨鲶均从农贸市场、超市和网络平台购买。
2.主要试剂。广谱型基因组DNA小量纯化试剂盒，宝生物工程（大连）有限公司;qPCR Master Mix（2×），西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司;引物与探针，武汉天一辉远生物科技有限公司合成。
3.仪器设备。qubit4.0荧光定量仪，Thermo Fisher， 美国;QuantStudio 7 Flex实时荧光定量PCR系统，Thermo Fisher，美国;5417 R型高速離心机，Eppendorf，德国。
二、实验与方法
1.DNA提取。所有动物样品参照广谱型基因组DNA小量纯化试剂盒中的操作说明提取DNA，用qubit4.0荧光定量仪检测DNA浓度及纯度。提取的DNA置于-20℃保存。
2.引物设计。根据Gen Bank数据库中已公布的斑点叉尾鮰、半滑舌鳎和低眼无齿巨鲶基因序列，使用Clustal X软件进行序列比对，筛选出种属相关的保守序列。利用Primer3Plus设计各种特异性荧光PCR引物和探针，引物和探针序列如下：低眼无齿巨鲶P.h-F：cagttcgtgtgtggagacaga，P.h-R：tgaagctgtagtggccagttc，P.h-P：cttcccatggtgcatgctgagtgctaacaggt;半滑舌鳎C.s-F：agctttctctgcatgtgaggc，C.s-R：catcgaagggtggttagtgagt，C.s-P：aacccacggggccgccaacctca;斑点叉尾鮰I.p-F：ccagccactgaacaacact，I.p-R：tagaagtcaaacagggctatct，I.p-P：tcaaaacttctttccaaaccgcatcctt。
3.三重荧光PCR体系的优化。为了确定三重荧光PCR反应中引物和探针比例，固定每对引物比例为1︰1，把3对引物和3条探针作为6个因素，采用正交设计L25（56），在5个水平（引物为：0.1、0.3、0.5、0.7、0.9μM，探针为：0.05、0.1、0.2、0.3、0.5μM）上进行试验以确定最佳比例。其他反应体系和条件如下：qPCR Master Mix（2×）12.5μL，模板2μL，dd H2O补足至25μL;95℃预变性5min，40个循环（95℃变性10s，60℃退火40s）。
4.三重荧光PCR特异性验证。分别以革胡子鲶、南方大口鲶、长丝巨鲇、黄颡鱼、鳗鱼、草鱼、鲤鱼小黄鱼、短吻红舌鳎、斑点叉尾鮰、半滑舌鳎和低眼无齿巨鲶的DNA为模板，按照优化好的三重荧光PCR反应条件进行PCR反应，从而验证引物的特异性。
5.三重荧光PCR灵敏性验证。将包含3个目的基因片段的质粒DNA从起始2.25×10-1μg/mL进行10倍比稀释，稀释8个梯度，用优化的三重荧光PCR体系进行扩增，分析绝对灵敏度，每个反应设置3个平行。
三、结果与分析
1.三重PCR体系的优化。按L25（56）正交设计的25个实验进行三重荧光PCR反应，结果见图1。根据各反应Ct值大小以及反应曲线斜率和荧光值确定最优引物和探针比例。由图1可以看出，在25个实验组合中扩增Ct值均无较大差异，但其中8实验扩增效率和扩增荧光值均较高，因此选用8实验为最佳体系，即在25μL反应体系中：qPCR Master Mix（2×）12.5μL，模板2μL;P.h-F和P.h-R各0.5μL，P.h-P为0.3μL;C.s-F和C.s-R各0.3μL，C.s-P为0.1μL;I.p-F和I.p-R各0.9μL，I.p-P为0.2μL;dd H2O补足至25μL。
2.特异性分析。由图2可知，斑点叉尾鮰、半滑舌鳎和低眼无齿巨鲶均出现典型的扩增曲线，检测结果为阳性;其他物种均无扩增曲线，检测结果为阴性。这表明所设计引物和探针均具有很好的特异性。
3.灵敏性分析。当质粒DNA质量浓度达到2.25× 10-9μg/mL（对应质粒DNA拷贝数浓度为2.07×103 copies/mL）时，重复实验没有全部出现扩增，3个重复里仅1个反应出现明显扩增，判定为不能检出。当质粒DNA质量浓度≥2.25×10-8μg/mL（对应质粒DNA拷贝数浓度大于或等于2.07×104copies/mL）时，重复实验均出现明显扩增曲线，判定为可以检出（图3A）。每个实时荧光PCR反应体系中模板加入量为2μL，则三重荧光PCR最低检测限为42copies。相对于斑点叉尾鮰、半滑舌鳎和低眼无齿巨鲶的单独荧光PCR的检出限（图3B-D），三重荧光PCR的检出限一致，并未出现明显的下降。
实验证实，此方法针对低眼无齿巨鲶、半滑舌鳎和斑点叉尾鮰的引物和探针的特异性良好。经验证，三重荧光PCR中低眼无齿巨鲶、半滑舌鳎和斑点叉尾鮰检测限与单重荧光PCR一致，达到2.25×10-8μg/mL。
本方法特异性强、灵敏度高，填补了低眼无齿巨鲶、半滑舌鳎和斑点叉尾鮰成分检测的空白，为水产食品企业把控产品质量提供了有效方法，也为监管部门对水产食品行业进行监督管理提供了科学依据。
作者简介：郑剑（1981-），男，汉族，湖北武汉人，硕士研究生，研究方向为物种成分鉴定。
本实验根据3种鱼的特异性保守基因，设计合成3对特异性引物和探针，建立了斑点叉尾鮰、半滑舌鳎和低眼无齿巨鲶三重荧光PCR鉴定方法，然后进行PCR反应特异性和灵敏性验证。结果表明，本检测方法简单、快速、灵敏度高，检测灵敏度可达到2.25×10-8μg/mL，整个检测时间在2.5h以内，可以同时检测3种易混淆鱼制品，为相关鱼肉制品源性鉴别提供了科学依据，可广泛应用于食品卫生检测以及临床检验等领域。
一、材料与仪器
1.样品来源。实验检测所用的革胡子鲶、南方大口鲶、长丝巨鲇、黄颡鱼、鳗鱼、草鱼、鲤鱼小黄鱼、短吻红舌鳎、斑点叉尾鮰、半滑舌鳎和低眼无齿巨鲶均从农贸市场、超市和网络平台购买。
2.主要试剂。广谱型基因组DNA小量纯化试剂盒，宝生物工程（大连）有限公司;qPCR Master Mix（2×），西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司;引物与探针，武汉天一辉远生物科技有限公司合成。
3.仪器设备。qubit4.0荧光定量仪，Thermo Fisher， 美国;QuantStudio 7 Flex实时荧光定量PCR系统，Thermo Fisher，美国;5417 R型高速離心机，Eppendorf，德国。
二、实验与方法
1.DNA提取。所有动物样品参照广谱型基因组DNA小量纯化试剂盒中的操作说明提取DNA，用qubit4.0荧光定量仪检测DNA浓度及纯度。提取的DNA置于-20℃保存。
2.引物设计。根据Gen Bank数据库中已公布的斑点叉尾鮰、半滑舌鳎和低眼无齿巨鲶基因序列，使用Clustal X软件进行序列比对，筛选出种属相关的保守序列。利用Primer3Plus设计各种特异性荧光PCR引物和探针，引物和探针序列如下：低眼无齿巨鲶P.h-F：cagttcgtgtgtggagacaga，P.h-R：tgaagctgtagtggccagttc，P.h-P：cttcccatggtgcatgctgagtgctaacaggt;半滑舌鳎C.s-F：agctttctctgcatgtgaggc，C.s-R：catcgaagggtggttagtgagt，C.s-P：aacccacggggccgccaacctca;斑点叉尾鮰I.p-F：ccagccactgaacaacact，I.p-R：tagaagtcaaacagggctatct，I.p-P：tcaaaacttctttccaaaccgcatcctt。
3.三重荧光PCR体系的优化。为了确定三重荧光PCR反应中引物和探针比例，固定每对引物比例为1︰1，把3对引物和3条探针作为6个因素，采用正交设计L25（56），在5个水平（引物为：0.1、0.3、0.5、0.7、0.9μM，探针为：0.05、0.1、0.2、0.3、0.5μM）上进行试验以确定最佳比例。其他反应体系和条件如下：qPCR Master Mix（2×）12.5μL，模板2μL，dd H2O补足至25μL;95℃预变性5min，40个循环（95℃变性10s，60℃退火40s）。
4.三重荧光PCR特异性验证。分别以革胡子鲶、南方大口鲶、长丝巨鲇、黄颡鱼、鳗鱼、草鱼、鲤鱼小黄鱼、短吻红舌鳎、斑点叉尾鮰、半滑舌鳎和低眼无齿巨鲶的DNA为模板，按照优化好的三重荧光PCR反应条件进行PCR反应，从而验证引物的特异性。
5.三重荧光PCR灵敏性验证。将包含3个目的基因片段的质粒DNA从起始2.25×10-1μg/mL进行10倍比稀释，稀释8个梯度，用优化的三重荧光PCR体系进行扩增，分析绝对灵敏度，每个反应设置3个平行。
三、结果与分析
1.三重PCR体系的优化。按L25（56）正交设计的25个实验进行三重荧光PCR反应，结果见图1。根据各反应Ct值大小以及反应曲线斜率和荧光值确定最优引物和探针比例。由图1可以看出，在25个实验组合中扩增Ct值均无较大差异，但其中8实验扩增效率和扩增荧光值均较高，因此选用8实验为最佳体系，即在25μL反应体系中：qPCR Master Mix（2×）12.5μL，模板2μL;P.h-F和P.h-R各0.5μL，P.h-P为0.3μL;C.s-F和C.s-R各0.3μL，C.s-P为0.1μL;I.p-F和I.p-R各0.9μL，I.p-P为0.2μL;dd H2O补足至25μL。
2.特异性分析。由图2可知，斑点叉尾鮰、半滑舌鳎和低眼无齿巨鲶均出现典型的扩增曲线，检测结果为阳性;其他物种均无扩增曲线，检测结果为阴性。这表明所设计引物和探针均具有很好的特异性。
3.灵敏性分析。当质粒DNA质量浓度达到2.25× 10-9μg/mL（对应质粒DNA拷贝数浓度为2.07×103 copies/mL）时，重复实验没有全部出现扩增，3个重复里仅1个反应出现明显扩增，判定为不能检出。当质粒DNA质量浓度≥2.25×10-8μg/mL（对应质粒DNA拷贝数浓度大于或等于2.07×104copies/mL）时，重复实验均出现明显扩增曲线，判定为可以检出（图3A）。每个实时荧光PCR反应体系中模板加入量为2μL，则三重荧光PCR最低检测限为42copies。相对于斑点叉尾鮰、半滑舌鳎和低眼无齿巨鲶的单独荧光PCR的检出限（图3B-D），三重荧光PCR的检出限一致，并未出现明显的下降。
实验证实，此方法针对低眼无齿巨鲶、半滑舌鳎和斑点叉尾鮰的引物和探针的特异性良好。经验证，三重荧光PCR中低眼无齿巨鲶、半滑舌鳎和斑点叉尾鮰检测限与单重荧光PCR一致，达到2.25×10-8μg/mL。
本方法特异性强、灵敏度高，填补了低眼无齿巨鲶、半滑舌鳎和斑点叉尾鮰成分检测的空白，为水产食品企业把控产品质量提供了有效方法，也为监管部门对水产食品行业进行监督管理提供了科学依据。
作者简介：郑剑（1981-），男，汉族，湖北武汉人，硕士研究生，研究方向为物种成分鉴定。