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摘 要 选用枇杷野生近缘种‘栎叶枇杷’和栽培种‘早钟6号’、‘香妃’，对其叶绿体基因组trnH-psbA基因间隔区进行PCR克隆与测序，利用生物信息学方法分析其序列特征，并构建苹果亚科内19个属的系统发育树。结果表明：trnH-psbA序列长323～392 bp（GenBank登录号：KF022254、KF022255、KF022256），G+C含量30.10%～33.13%，共有1个核苷酸替换（substitution）和2个插入/缺失（indel）；基于trnH-psbA DNA条形码序列的分子系统进化分析结果表明，苹果亚科内形成2个大的分支，枇杷属与石斑木属的亲缘关系最近（平均遗传距离为0.055）。此结果表明叶绿体基因trnH-psbA序列可有效地进行枇杷属内物种鉴别及属间分类，是枇杷属植物DNA条形码研究的标准基因之一。
关键词 枇杷属；trnH-psbA；DNA条形码；序列分析；系统进化
中图分类号 S667.3 文献标识码 A
Sequence Variation of trnH-psbA Barcode in Two Eriobotrya Plants and Phylogenetic Relationships with Related Genera
HU Wenshun1，2， JIANG Jimou1，2， HUANG Aiping2，3，
XU Qizhi1，2， CHEN Xiuping1，2， ZHENG Shaoquan1，2*
1 Fruit Research Institute， Fujian Academy of Agricultrual Sciences， Fuzhou， Fujian 350013， China
2 Fujian Breeding Engineering Technology Research Center for Longan&Loquat， Fuzhou， Fujian 350013， China
3 Information Institute of Agricultural Economy and Scitechnological， Fujian Academy of Agricultural
Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China
Abstract The chloroplast genome trnH-psbA intergenic regions of three loquat（wild relatives‘E.prinoides’，cultivars‘Zaozhong No.6’and‘Xiangfei’）were cloned and sequenced. The sequence characteristics were analyzed using bioinformatics methods and the phylogeny evolution tree was constructed with 19 genus of Maloideae. The results showed that the length of trnH-psbA sequence was 323～392 bp（GenBank accession number： KF022254， KF022255， KF022256）， and its G+C content was 30.10%～33.13%. A total of 1 substitution and 2 indels were obtained in the data. Molecular phylogenetic anaylised based on the sequence of trnH-psbA DNA barcode reflected the relationship between Eriobotrya and Rhaphiolepis was closer（the average genetic distance was 0.055）， and Maloideae was divided into two large branches. This paper suggested that trnH-psbA DNA barcode could be used as one of the standard gene to identify or classify plants of the Eriobotrya and its relative genus.
Key words Eriobotrya；TtrnH-psbA；DNA barcode；Sequence analysis；Phylogeny evolution
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.003
枇杷属（Eriobotrya）隶于蔷薇科（Rosaceae）苹果亚科（Maloideae），分布于亚洲温带和亚热带地区；属内植物约有30种，其中中国原产的有16个种加5个变种或变型[1-2]。该属植物不仅是一类庭院观赏或绿化树，其栽培种枇杷果实甜酸适度、营养丰富、具有极高的药用价值。由于长期自然繁衍和人工选择，变异类型较多，从形态学鉴别该属所有植物的难度较大[3]。因此，对其准确地鉴别是进行有效保护利用的重要前提。
DNA条形码技术（DNA barcoding）是利用标准的、具有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段对物种进行快速准确的鉴定方法[4]，是近年来动物[5]、微生物[6]、植物[7]等生物多样性及分类研究热点。DNA片段序列在枇杷属植物的种类鉴定和系统发育研究中亦有相关报道。符小敏等[8]应用matK、trnL-F和ITS序列对广东分布的香花枇杷、台湾枇杷、大花枇杷和普通枇杷等4个种的分类地位和系统关系进行研究，结果显示分子DNA序列数据能将香花枇杷和大花枇杷相区别。李平等[9]通过对rbcL、trnL-F、ITS和Adh基因进行序列分析，建立了枇杷属12个种的分子系统发生树。张坤城等[10]利用matK序列及ITS序列探讨台湾枇杷、武威山枇杷及恒春山枇杷之亲缘关系，认为三者在分子亲缘演化上并无明显分化，建议将武威山枇杷及恒春山枇杷处理为台湾枇杷的变型。王云生等[11]对栽培枇杷与野生枇杷叶绿体基因组的TrnS-TrnG和TrnQ-rps16位点进行序列多态性的比较，结果发现栽培枇杷群体在这2个基因位点不存在变异，而野生群体存在替代及插入/缺失变异。叶绿体DNA trnH-psbA片段是进化速率最快的叶绿体基因间隔区之一[12]，具有较高的物种鉴别能力。目前，未见针对枇杷野生种与栽培种的trnH-psbA序列分析及应用报道。 本研究选取枇杷野生近缘种‘栎叶枇杷’和栽培种‘早钟6号’（红肉）、 ‘香妃’（白肉）3份材料，对其trnH-psbA基因片段进行克隆与序列分析，并利用生物信息学方法构建苹果亚科19个属的系统发育树，以探讨trnH-psbA基因序列在枇杷属植物物种鉴定上的有效性，为枇杷属植物的DNA条形码研究和应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
2012年3月在国家果树种质福州枇杷圃采集枇杷[E. japonica（Thunb.）Lindl.]品种‘早钟6号’、‘香妃’及其野生近缘种栎叶枇杷（E. prinoides Rehd. et Wils.）共3份样品的嫩叶。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取及质量检测 试验在福建省龙眼枇杷育种工程技术研究中心实验室进行。称取新鲜叶片0.5 g，加入液氮迅速研磨。基因组DNA提取参照改良的CTAB法[13]，DNA质量和浓度的检测采用1%的琼脂糖电泳。
1.2.2 PCR扩增与测序 trnH-psbA片段扩增引物及反应体系参考Wang等[14]的方法，引物序列trnH5′-ACTGCCTTGATCCACTTGGC-3′和psbA5′-CGAAGCTCCATCTACAAATGG-3′。PCR扩增反应总体积为50 μL，其中DNA模板50～100 ng，1× buffer（含Mg2+），dNTPs 0.8 mmol/L，上下游引物各0.4 μmol/L，EX Taq聚合酶1.0 U。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；72 ℃延伸7 min。
用OMEGA试剂盒（OMEGA BioTek）进行目的片段割胶回收，送样进行直接测序，同时进行克隆测序：pMD18-T载体4 ℃连接过夜，然后转化宿主菌DH5α并37 ℃培养过夜；经蓝白斑筛选、PCR检测后，每个样本挑选阳性克隆3个双向测序。经初步的序列分析，对存在单一突变的样本进行重复PCR和测序，以减少因错配得到的核苷酸变异。获得3条序列的GenBank登录号见表1。
1.2.3 序列统计分析 从GenBank上选取苹果亚科19个属的trnH-psbA序列19条，并与本实验测序的3条序列一起进行ClustalX2.0多重比对后，手工删去两端多余序列及中间插入片段，从而获得长度一致的序列用于比较分析。
采用MEGA5.05计算序列间的碱基组成、变异位点数、转换/颠换数、遗传距离等，并应用邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育树。对分支的可靠性评价使用靴带值（bootstrap， 1 000次重复）分析， K-2P参数遗传距离（kimura-2parameter genetic distance）， 空位（gap）被处理为缺失（missing）。
2 结果与分析
2.1 枇杷trnH-psbA序列测定结果
以3份材料基因组DNA为模板，PCR扩增叶绿体trnH-psbA基因间隔区序列，产物经琼脂糖电泳后在约400 bp处出现一清晰目的条带（图1），片段割胶回收后直接送样测序。
PCR产物直接测序出现双峰或噪值高等问题，结果差。最终通过TA克隆测序获得枇杷属植物叶绿体trnH-psbA序列共3条（图2），将其在NCBI上进行BLAST相似性检索，均有较好的匹配程度，确认所测序列为目标序列，检索比对结果表明测序结果准确可靠。
2.2 枇杷trnH-psbA序列特征及分析
测定获得早钟6号、香妃、栎叶枇杷的cpDNA基因的trnH-psbA片段长度分别为392、392、323 bp（表1）。从表1中可以看出，在trnH-psbA序列中4种碱基频率存在明显偏差，其中C含量最低，T含量最高，G+C含量为30.10%～33.13%，显著低于其相应的A+T含量。由图2可知，2个枇杷品种的trnH-psbA完全相同，而野生种栎叶枇杷与栽培种相比有3个变异位点：在第178 bp位点和第224 bp位点处分别发生18和51 bp的缺失/插入；在第319 bp位点处发生G/T碱基的颠换。
2.3 基于trnH-psbA序列条形码鉴定枇杷属内物种及其近缘属
22条trnH-psbA序列经过ClustalX2.0软件比对排列后长度为250 bp，分析结果显示，样品间遗传距离范围为0～2.008，平均遗传距离为0.346 8；枇杷属普通枇杷种内3个样品之间遗传距离最小为0，欧楂属与石楠属遗传距离最大为2.008；枇杷属与石斑木属植物遗传距离较小为0.006～0.053，推测二者亲缘关系较近；根据trnH-psbA序列条形码的特征性变异位点能全部区分苹果亚科内的19个属植物。
由图3可知，苹果亚科内19个属明显分为2个分支，第Ⅰ分支自展支持率高达99%，包含枇杷属、栒子属、红果树属等17个属，3份普通枇杷以98%的高支持率聚为一小的分支，野生种栎叶枇杷和石斑木属关系最近；第Ⅱ分支为欧楂属和火棘属，与其它属距离均较远，处于最靠近根目录的位置。
3 讨论与结论
本研究对trnH-psbA DNA条形码在枇杷属栽培种和野生近缘种上的序列特征及其适用性进行分析研究。试验初期曾进行PCR扩增产物的直接测序，测序过程出现双峰或信号中断等问题。此外，作者对枇杷属内其它7个种23份材料进行了PCR产物直接测序验证（将另文报道），同样支持进行克隆测序以获得完整的trnH-psbA序列。本试验结果获得的3条trnH-psbA序列在不同种间存在明显的碱基颠换和插入/缺失突变，说明枇杷属植物在长期栽培驯化过程中产生了较大变异。本研究基于trnH-psbA序列构建苹果亚科19个属的系统进化树，DNA序列来自叶绿体基因组的单个基因，其结果会有一定的片面性，但仍具参考意义：如欧楂属和火棘属置于苹果亚科系统演化树的较早分支，这与Eugenia等[15]综合利用叶绿体11个基因和核基因ITS序列分析苹果亚科内27个属331个种的系统发育研的究结果相一致；枇杷属与石斑木属二者亲缘关系较近，这与之前符小敏等[8]、张坤城等[10]、Eugenia等[15]的研究报道相吻合。因此，枇杷属植物叶绿体基因trnH-psbA序列具有长度适中、容易扩增、测序成本较低等优点，能有效地鉴别属内物种及属间分类，可作为DNA条形码标准基因。 植物DNA条形码研究和应用可以分成2个阶段：（1）条形码的选择和确定；（2）将选定的条形码应用于物种鉴定，逐步建立完整的条形码数据库[16-17]。枇杷属植物类群中条形码的研究和应用尚处于探索阶段，充分利用基因组信息寻找理想的DNA条形码候选基因仍是今后一段时间主要的研究任务。通过对枇杷属内多个类群和多个基因的比较，结合传统形态分类学，开展分类群种内和种间差异、物种鉴别的分子变异尺度、不同条形码的使用范围、系统发育相关的进化事件等方面研究工作，最终建立实用的条形码数据库。这不仅可以实现快速、准确的物种鉴定，也为揭示中国枇杷属植物的生物多样性及更好地保护利用提供科学依据。
致谢 本研究部分实验在福州国家水稻改良分中心完成，期间得到了连玲助理研究员、何炜助理研究员的帮助，特此感谢！
参考文献
[1] 邱武陵， 章恢志. 中国果树志（龙眼、 枇杷卷）[M]. 北京：中国林业出版社， 1996： 87-259.
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[17] 任保青， 陈之端. 植物DNA条形码技术[J]. 植物学报， 2010， 45（1）： 1-12.
责任编辑：黄东杰
关键词 枇杷属；trnH-psbA；DNA条形码；序列分析；系统进化
中图分类号 S667.3 文献标识码 A
Sequence Variation of trnH-psbA Barcode in Two Eriobotrya Plants and Phylogenetic Relationships with Related Genera
HU Wenshun1，2， JIANG Jimou1，2， HUANG Aiping2，3，
XU Qizhi1，2， CHEN Xiuping1，2， ZHENG Shaoquan1，2*
1 Fruit Research Institute， Fujian Academy of Agricultrual Sciences， Fuzhou， Fujian 350013， China
2 Fujian Breeding Engineering Technology Research Center for Longan&Loquat， Fuzhou， Fujian 350013， China
3 Information Institute of Agricultural Economy and Scitechnological， Fujian Academy of Agricultural
Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China
Abstract The chloroplast genome trnH-psbA intergenic regions of three loquat（wild relatives‘E.prinoides’，cultivars‘Zaozhong No.6’and‘Xiangfei’）were cloned and sequenced. The sequence characteristics were analyzed using bioinformatics methods and the phylogeny evolution tree was constructed with 19 genus of Maloideae. The results showed that the length of trnH-psbA sequence was 323～392 bp（GenBank accession number： KF022254， KF022255， KF022256）， and its G+C content was 30.10%～33.13%. A total of 1 substitution and 2 indels were obtained in the data. Molecular phylogenetic anaylised based on the sequence of trnH-psbA DNA barcode reflected the relationship between Eriobotrya and Rhaphiolepis was closer（the average genetic distance was 0.055）， and Maloideae was divided into two large branches. This paper suggested that trnH-psbA DNA barcode could be used as one of the standard gene to identify or classify plants of the Eriobotrya and its relative genus.
Key words Eriobotrya；TtrnH-psbA；DNA barcode；Sequence analysis；Phylogeny evolution
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.003
枇杷属（Eriobotrya）隶于蔷薇科（Rosaceae）苹果亚科（Maloideae），分布于亚洲温带和亚热带地区；属内植物约有30种，其中中国原产的有16个种加5个变种或变型[1-2]。该属植物不仅是一类庭院观赏或绿化树，其栽培种枇杷果实甜酸适度、营养丰富、具有极高的药用价值。由于长期自然繁衍和人工选择，变异类型较多，从形态学鉴别该属所有植物的难度较大[3]。因此，对其准确地鉴别是进行有效保护利用的重要前提。
DNA条形码技术（DNA barcoding）是利用标准的、具有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段对物种进行快速准确的鉴定方法[4]，是近年来动物[5]、微生物[6]、植物[7]等生物多样性及分类研究热点。DNA片段序列在枇杷属植物的种类鉴定和系统发育研究中亦有相关报道。符小敏等[8]应用matK、trnL-F和ITS序列对广东分布的香花枇杷、台湾枇杷、大花枇杷和普通枇杷等4个种的分类地位和系统关系进行研究，结果显示分子DNA序列数据能将香花枇杷和大花枇杷相区别。李平等[9]通过对rbcL、trnL-F、ITS和Adh基因进行序列分析，建立了枇杷属12个种的分子系统发生树。张坤城等[10]利用matK序列及ITS序列探讨台湾枇杷、武威山枇杷及恒春山枇杷之亲缘关系，认为三者在分子亲缘演化上并无明显分化，建议将武威山枇杷及恒春山枇杷处理为台湾枇杷的变型。王云生等[11]对栽培枇杷与野生枇杷叶绿体基因组的TrnS-TrnG和TrnQ-rps16位点进行序列多态性的比较，结果发现栽培枇杷群体在这2个基因位点不存在变异，而野生群体存在替代及插入/缺失变异。叶绿体DNA trnH-psbA片段是进化速率最快的叶绿体基因间隔区之一[12]，具有较高的物种鉴别能力。目前，未见针对枇杷野生种与栽培种的trnH-psbA序列分析及应用报道。 本研究选取枇杷野生近缘种‘栎叶枇杷’和栽培种‘早钟6号’（红肉）、 ‘香妃’（白肉）3份材料，对其trnH-psbA基因片段进行克隆与序列分析，并利用生物信息学方法构建苹果亚科19个属的系统发育树，以探讨trnH-psbA基因序列在枇杷属植物物种鉴定上的有效性，为枇杷属植物的DNA条形码研究和应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
2012年3月在国家果树种质福州枇杷圃采集枇杷[E. japonica（Thunb.）Lindl.]品种‘早钟6号’、‘香妃’及其野生近缘种栎叶枇杷（E. prinoides Rehd. et Wils.）共3份样品的嫩叶。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取及质量检测 试验在福建省龙眼枇杷育种工程技术研究中心实验室进行。称取新鲜叶片0.5 g，加入液氮迅速研磨。基因组DNA提取参照改良的CTAB法[13]，DNA质量和浓度的检测采用1%的琼脂糖电泳。
1.2.2 PCR扩增与测序 trnH-psbA片段扩增引物及反应体系参考Wang等[14]的方法，引物序列trnH5′-ACTGCCTTGATCCACTTGGC-3′和psbA5′-CGAAGCTCCATCTACAAATGG-3′。PCR扩增反应总体积为50 μL，其中DNA模板50～100 ng，1× buffer（含Mg2+），dNTPs 0.8 mmol/L，上下游引物各0.4 μmol/L，EX Taq聚合酶1.0 U。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；72 ℃延伸7 min。
用OMEGA试剂盒（OMEGA BioTek）进行目的片段割胶回收，送样进行直接测序，同时进行克隆测序：pMD18-T载体4 ℃连接过夜，然后转化宿主菌DH5α并37 ℃培养过夜；经蓝白斑筛选、PCR检测后，每个样本挑选阳性克隆3个双向测序。经初步的序列分析，对存在单一突变的样本进行重复PCR和测序，以减少因错配得到的核苷酸变异。获得3条序列的GenBank登录号见表1。
1.2.3 序列统计分析 从GenBank上选取苹果亚科19个属的trnH-psbA序列19条，并与本实验测序的3条序列一起进行ClustalX2.0多重比对后，手工删去两端多余序列及中间插入片段，从而获得长度一致的序列用于比较分析。
采用MEGA5.05计算序列间的碱基组成、变异位点数、转换/颠换数、遗传距离等，并应用邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育树。对分支的可靠性评价使用靴带值（bootstrap， 1 000次重复）分析， K-2P参数遗传距离（kimura-2parameter genetic distance）， 空位（gap）被处理为缺失（missing）。
2 结果与分析
2.1 枇杷trnH-psbA序列测定结果
以3份材料基因组DNA为模板，PCR扩增叶绿体trnH-psbA基因间隔区序列，产物经琼脂糖电泳后在约400 bp处出现一清晰目的条带（图1），片段割胶回收后直接送样测序。
PCR产物直接测序出现双峰或噪值高等问题，结果差。最终通过TA克隆测序获得枇杷属植物叶绿体trnH-psbA序列共3条（图2），将其在NCBI上进行BLAST相似性检索，均有较好的匹配程度，确认所测序列为目标序列，检索比对结果表明测序结果准确可靠。
2.2 枇杷trnH-psbA序列特征及分析
测定获得早钟6号、香妃、栎叶枇杷的cpDNA基因的trnH-psbA片段长度分别为392、392、323 bp（表1）。从表1中可以看出，在trnH-psbA序列中4种碱基频率存在明显偏差，其中C含量最低，T含量最高，G+C含量为30.10%～33.13%，显著低于其相应的A+T含量。由图2可知，2个枇杷品种的trnH-psbA完全相同，而野生种栎叶枇杷与栽培种相比有3个变异位点：在第178 bp位点和第224 bp位点处分别发生18和51 bp的缺失/插入；在第319 bp位点处发生G/T碱基的颠换。
2.3 基于trnH-psbA序列条形码鉴定枇杷属内物种及其近缘属
22条trnH-psbA序列经过ClustalX2.0软件比对排列后长度为250 bp，分析结果显示，样品间遗传距离范围为0～2.008，平均遗传距离为0.346 8；枇杷属普通枇杷种内3个样品之间遗传距离最小为0，欧楂属与石楠属遗传距离最大为2.008；枇杷属与石斑木属植物遗传距离较小为0.006～0.053，推测二者亲缘关系较近；根据trnH-psbA序列条形码的特征性变异位点能全部区分苹果亚科内的19个属植物。
由图3可知，苹果亚科内19个属明显分为2个分支，第Ⅰ分支自展支持率高达99%，包含枇杷属、栒子属、红果树属等17个属，3份普通枇杷以98%的高支持率聚为一小的分支，野生种栎叶枇杷和石斑木属关系最近；第Ⅱ分支为欧楂属和火棘属，与其它属距离均较远，处于最靠近根目录的位置。
3 讨论与结论
本研究对trnH-psbA DNA条形码在枇杷属栽培种和野生近缘种上的序列特征及其适用性进行分析研究。试验初期曾进行PCR扩增产物的直接测序，测序过程出现双峰或信号中断等问题。此外，作者对枇杷属内其它7个种23份材料进行了PCR产物直接测序验证（将另文报道），同样支持进行克隆测序以获得完整的trnH-psbA序列。本试验结果获得的3条trnH-psbA序列在不同种间存在明显的碱基颠换和插入/缺失突变，说明枇杷属植物在长期栽培驯化过程中产生了较大变异。本研究基于trnH-psbA序列构建苹果亚科19个属的系统进化树，DNA序列来自叶绿体基因组的单个基因，其结果会有一定的片面性，但仍具参考意义：如欧楂属和火棘属置于苹果亚科系统演化树的较早分支，这与Eugenia等[15]综合利用叶绿体11个基因和核基因ITS序列分析苹果亚科内27个属331个种的系统发育研的究结果相一致；枇杷属与石斑木属二者亲缘关系较近，这与之前符小敏等[8]、张坤城等[10]、Eugenia等[15]的研究报道相吻合。因此，枇杷属植物叶绿体基因trnH-psbA序列具有长度适中、容易扩增、测序成本较低等优点，能有效地鉴别属内物种及属间分类，可作为DNA条形码标准基因。 植物DNA条形码研究和应用可以分成2个阶段：（1）条形码的选择和确定；（2）将选定的条形码应用于物种鉴定，逐步建立完整的条形码数据库[16-17]。枇杷属植物类群中条形码的研究和应用尚处于探索阶段，充分利用基因组信息寻找理想的DNA条形码候选基因仍是今后一段时间主要的研究任务。通过对枇杷属内多个类群和多个基因的比较，结合传统形态分类学，开展分类群种内和种间差异、物种鉴别的分子变异尺度、不同条形码的使用范围、系统发育相关的进化事件等方面研究工作，最终建立实用的条形码数据库。这不仅可以实现快速、准确的物种鉴定，也为揭示中国枇杷属植物的生物多样性及更好地保护利用提供科学依据。
致谢 本研究部分实验在福州国家水稻改良分中心完成，期间得到了连玲助理研究员、何炜助理研究员的帮助，特此感谢！
参考文献
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责任编辑：黄东杰