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【摘要】目的 建立覆盆子配方颗粒指纹图谱检测方法。方法 采用HPLC对覆盆子配方颗粒中指纹图谱的检测方法进行研究，并建立覆盆子配方颗粒指纹图谱。结果 通过考察色谱柱、流动相、检测波长、供试品溶剂等因素，确定了覆盆子指纹图谱的最优色谱条件。在此条件下，对10批次覆盆子配方颗粒指纹图谱进行考察，结果显示供试品在鞣花酸、椴树苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷3个对照品相应位置，都有清晰的色谱峰，各批次之间指纹图谱相似度在97.3%以上。结论 本研究完成了覆盆子配方颗粒指纹图谱检测方法的开发，并制定了相关的质量标准要求，可应用于覆盆子配方颗粒的质量控制。
【关键词】覆盆子;配方颗粒;HPLC;鞣花酸;山柰酚-3-O-芸香糖苷;指纹图谱
【中图分类号】R97 【文献标识码】A 【文章编号】2026-5328（2021）09--02
覆盆子，又名树莓，是蔷薇科植物华东覆盆子 Rubus chingii Hu 的干燥果实，夏初果实由绿变绿黄时采收。具有益肾固精缩尿，养肝明目的功效。用于遗精滑精，遗尿尿频，阳痿早泄，目暗昏花[1]。现代药理研究表明覆盆子有显著的抗肿瘤、抗氧化、降低血糖血脂、抗衰老、抗炎和免疫增强等药理作用[2-3]。鞣花酸和山柰酚-3-O-芸香糖苷为2015年版药典规定覆盆子含量测定的指标成分，椴树苷为薄层鉴别的标志成分。鞣花酸具有抑制癌变和清除致癌毒素的作用;椴树苷具有消炎、强心、利尿和抗氧化等药理活性;山柰酚-3-O-芸香糖苷在适宜剂量时具有急性应激诱导的作用 [4-5]。除此之外，覆盆子还被世界粮农组织（FAO）推荐为第三代黄金水果[6]，在国内外市场上应用前景非常广阔，价格也逐年走高[7]。中药配方颗粒作为中药饮片的补充，因其携带方便，免煎服用等优点逐渐被临床认可[8-9]。覆盆子作为一个常用的大宗药材，兼具药食两用的功能，其配方颗粒的应用也非常广泛。本研究参照中国药典2015年版一部覆盆子项下的规定，以覆盆子配方颗粒为原料，通过高效液相色谱等技术对覆盆子配方颗粒的特征图谱进行研究，为其质量控制提供依据。
1 仪器与试剂
Agilent 1200系列高效液相色谱仪（Agilent），Waters 2695型高效液相色谱仪（Waters）;AB135-S型十万分之一电子天平（梅特勒-托利多）;Option-Q系列纯水机（ELGA）;ZF-90型暗箱式紫外分析仪（上海五相仪器仪表有限公司）。
鞣花酸对照品（批号111959-201501，含量97.0%）、椴树苷对照品（批号112000-201501，含量98.0%），均购自中国食品药品检定研究院;山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品（批号16070401，含量98.0%）购自成都普菲德生物技术有限公司;乙腈、磷酸为色谱纯;其他试剂均为分析纯;10批覆盆子配方颗粒（批号：P20160907，P20160908，P20160909，P20160913，P20160914，P20160917，P20160918，P20160919，P20160921，P20160922，劲牌持正堂药业有限公司）;覆盆子饮片（批号：160101，湖北正光九资河药业有限公司。经中南民族大学药学院梅之南教授鉴定为：蔷薇科植物华东覆盆子 Rubus chingii Hu的干燥果实覆盆子）。
2 方法与结果
2.1 检测方法概要
色谱条件与系统适应性实验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-0.1%磷酸水溶液按下表进行梯度洗脱，检测波长为270nm，进样体积为10?l。理论板数按鞣花酸峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备 分别取鞣花酸对照品、椴树苷对照品、山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品适量，精密称定，加20%甲醇分别制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品粉末约100 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加入20%甲醇溶解，定容，混匀，以针头过滤器过滤，即得。
2.2 流动相考察 分别选择乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%醋酸水溶液進行梯度洗脱，通过比较不同洗脱系统的指纹图谱，最终选择乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相。
2.3 检测波长的考察 根据覆盆子中有效成分紫外吸收的吸收峰特征，分别测定了不同波长为250nm、270nm、290nm、360nm的图谱。从图谱可知270nm的响应值相对较好，所以确定覆盆子配方颗粒的指纹图谱检测波长为270nm。
2.4 溶剂的考察 分别选择20%甲醇、50%甲醇、水、20%乙醇、50%乙醇溶解样品，考察最佳溶解溶剂。从图谱可知20%甲醇溶解指纹图谱效果相对较好，所以确定覆盆子配方颗粒的溶剂为20%甲醇。
2.5 专属性试验 取对照品溶液及供试品溶液，按上述色谱条件进行分析。结果表明，供试品溶液与对照品溶液在相同的保留时间上都有色谱峰，该方法专属性良好。
2.6 仪器精密度试验 取同一供试品溶液按上述色谱条件连续进样6次，结果相似度都在99.8%以上，表明仪器精密度良好。
2.7 重复性试验 取同一批号的覆盆子配方颗粒，按“2.1”项下方法制备供试品溶液6份，在上述色谱条件下测定，结果相似度都在99.9%以上，表明该方法重现性较好。
2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液分别在0 h，2.5 h，5 h，10 h，15 h，20 h进样，结果相似度都在99.7%以上，表明20 h内测定，样品溶液稳定。
2.9 耐用性考察 采用同一台仪器Agilent 1260系列高效液相色谱仪、相同的色谱分析条件，不同的色谱柱对同一样品进行色谱分析。分析用的色谱柱如下：Waters T3 色谱柱（4.6×250mm，5?m）、Sepax HP-C18色谱柱（4.6×250mm，5?m）、Agilent SB-Aq C18色谱柱（4.6×250mm，5?m）。由谱图可知，从分离效果来看，Waters T3色谱柱的分离效果最佳。 2.10 样品的检测 对收集的10批覆盆子配方颗粒样品按照上述色谱条件进行了指纹图谱考察，其叠加图谱见图4。通过对照品比对确认了鞣花酸、椴树苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷共3个特征共有峰，生成的对照指纹图谱见下图4。结果表明，各批次的覆盆子配方颗粒相互之间的相似度均在97.3%以上，说明各批次覆盆子配方颗粒稳定性良好，并且具备整体系统性和单味覆盆子配方颗粒的特征性。
3 讨论
根据目前的文献报道，覆盆子中的主要化学成分有二萜（ 苷） 、三萜（ 苷） 、黄酮（ 苷） 、甾体、生物碱等。本方法参考《中国药典》2020年版一部覆盆子【含量测定】项下方法，通过考察色谱柱、流动相、检测波长、供试品溶剂等因素，确定了覆盆子指纹图谱的最优色谱条件。在此条件下，对10批次覆盆子配方颗粒指纹图谱进行考察，结果显示供试品在鞣花酸、椴树苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷3个对照品相应位置，都有清晰的色谱峰。
采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统（2012版）》，以S1液相图谱为参照图谱，将10批覆盆子配方颗粒HPLC图谱色谱峰进行自动匹配，形成共有峰模式图，结果10批覆盆子配方颗粒干膏粉供试品中均呈现出多个共有峰，各批次之间相似度良好（均在97.3%以上），具有良好的稳定性和特征性。据此，暂定覆盆子配方颗粒指纹图谱相似度≥90%。
综上所述，本研究完成了覆盆子指纹图谱检测方法地开发，并制定了相关的质量标准和限度要求，可应用于覆盆子配方颗粒的质量控制。
参考文献：
[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典： 2015年版一部[S].北京： 中国医药科技出版社，2015.
[2] 程丹，李洁，周斌等. 覆盆子化学成分与药理作用研究进展[J]. 中药材， 2012， 35（11）： 1873-1876.
[3] 程丽珍. 覆盆子的质量标准研究[D]. 合肥：安徽中医药大学，2013.
[4] 郭卿，付辉政，周国平等. 覆盆子药材质量标准研究[J]. 江西中医药大学学报，2014，26（3）：51-54
[5] 郭卿.覆盆子化学成分及质量标准研究[D]. 南昌：江西中医药大学，2015.
[6] 刘明学， 牛靖娥. 覆盆子研究進展及其资源开发利用[J]. 科技视界， 2014， 08（22）： 26-27.
[7] 孙健， 沈晓霞. 覆盆子的药用研究进展与鲜食产业分析[J]. 科技通报， 2017， 33（6）： 82-85.
[8] 仇法新， 高福君. 中药配方颗粒的发展现状及应用前景[J]. 中国药房， 2007， 18（3）： 163-165.
[9] 胡辉，龙林，刘重阳等. 盐杜仲配方颗粒的质量标准[J]. 医药导报， 2018， 37（2）： 219-222.
[10] 胡辉，翟红伟，刘源才. 地肤子配方颗粒的质量标准[J]. 医药导报， 2019， 38（5）： 626-631.
第一作者：龙林，男，硕士，工程师，研究方向：中药资源与中药制剂，E-mail：364003726@qq.com
通讯作者：胡辉，男，学士，工程师，研究方向：中药资源与中药制剂，E-mail：15972368370@qq.com
基金项目：湖北省重点研发计划项目（2020ACA019）
【关键词】覆盆子;配方颗粒;HPLC;鞣花酸;山柰酚-3-O-芸香糖苷;指纹图谱
【中图分类号】R97 【文献标识码】A 【文章编号】2026-5328（2021）09--02
覆盆子，又名树莓，是蔷薇科植物华东覆盆子 Rubus chingii Hu 的干燥果实，夏初果实由绿变绿黄时采收。具有益肾固精缩尿，养肝明目的功效。用于遗精滑精，遗尿尿频，阳痿早泄，目暗昏花[1]。现代药理研究表明覆盆子有显著的抗肿瘤、抗氧化、降低血糖血脂、抗衰老、抗炎和免疫增强等药理作用[2-3]。鞣花酸和山柰酚-3-O-芸香糖苷为2015年版药典规定覆盆子含量测定的指标成分，椴树苷为薄层鉴别的标志成分。鞣花酸具有抑制癌变和清除致癌毒素的作用;椴树苷具有消炎、强心、利尿和抗氧化等药理活性;山柰酚-3-O-芸香糖苷在适宜剂量时具有急性应激诱导的作用 [4-5]。除此之外，覆盆子还被世界粮农组织（FAO）推荐为第三代黄金水果[6]，在国内外市场上应用前景非常广阔，价格也逐年走高[7]。中药配方颗粒作为中药饮片的补充，因其携带方便，免煎服用等优点逐渐被临床认可[8-9]。覆盆子作为一个常用的大宗药材，兼具药食两用的功能，其配方颗粒的应用也非常广泛。本研究参照中国药典2015年版一部覆盆子项下的规定，以覆盆子配方颗粒为原料，通过高效液相色谱等技术对覆盆子配方颗粒的特征图谱进行研究，为其质量控制提供依据。
1 仪器与试剂
Agilent 1200系列高效液相色谱仪（Agilent），Waters 2695型高效液相色谱仪（Waters）;AB135-S型十万分之一电子天平（梅特勒-托利多）;Option-Q系列纯水机（ELGA）;ZF-90型暗箱式紫外分析仪（上海五相仪器仪表有限公司）。
鞣花酸对照品（批号111959-201501，含量97.0%）、椴树苷对照品（批号112000-201501，含量98.0%），均购自中国食品药品检定研究院;山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品（批号16070401，含量98.0%）购自成都普菲德生物技术有限公司;乙腈、磷酸为色谱纯;其他试剂均为分析纯;10批覆盆子配方颗粒（批号：P20160907，P20160908，P20160909，P20160913，P20160914，P20160917，P20160918，P20160919，P20160921，P20160922，劲牌持正堂药业有限公司）;覆盆子饮片（批号：160101，湖北正光九资河药业有限公司。经中南民族大学药学院梅之南教授鉴定为：蔷薇科植物华东覆盆子 Rubus chingii Hu的干燥果实覆盆子）。
2 方法与结果
2.1 检测方法概要
色谱条件与系统适应性实验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-0.1%磷酸水溶液按下表进行梯度洗脱，检测波长为270nm，进样体积为10?l。理论板数按鞣花酸峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备 分别取鞣花酸对照品、椴树苷对照品、山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品适量，精密称定，加20%甲醇分别制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品粉末约100 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加入20%甲醇溶解，定容，混匀，以针头过滤器过滤，即得。
2.2 流动相考察 分别选择乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%醋酸水溶液進行梯度洗脱，通过比较不同洗脱系统的指纹图谱，最终选择乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相。
2.3 检测波长的考察 根据覆盆子中有效成分紫外吸收的吸收峰特征，分别测定了不同波长为250nm、270nm、290nm、360nm的图谱。从图谱可知270nm的响应值相对较好，所以确定覆盆子配方颗粒的指纹图谱检测波长为270nm。
2.4 溶剂的考察 分别选择20%甲醇、50%甲醇、水、20%乙醇、50%乙醇溶解样品，考察最佳溶解溶剂。从图谱可知20%甲醇溶解指纹图谱效果相对较好，所以确定覆盆子配方颗粒的溶剂为20%甲醇。
2.5 专属性试验 取对照品溶液及供试品溶液，按上述色谱条件进行分析。结果表明，供试品溶液与对照品溶液在相同的保留时间上都有色谱峰，该方法专属性良好。
2.6 仪器精密度试验 取同一供试品溶液按上述色谱条件连续进样6次，结果相似度都在99.8%以上，表明仪器精密度良好。
2.7 重复性试验 取同一批号的覆盆子配方颗粒，按“2.1”项下方法制备供试品溶液6份，在上述色谱条件下测定，结果相似度都在99.9%以上，表明该方法重现性较好。
2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液分别在0 h，2.5 h，5 h，10 h，15 h，20 h进样，结果相似度都在99.7%以上，表明20 h内测定，样品溶液稳定。
2.9 耐用性考察 采用同一台仪器Agilent 1260系列高效液相色谱仪、相同的色谱分析条件，不同的色谱柱对同一样品进行色谱分析。分析用的色谱柱如下：Waters T3 色谱柱（4.6×250mm，5?m）、Sepax HP-C18色谱柱（4.6×250mm，5?m）、Agilent SB-Aq C18色谱柱（4.6×250mm，5?m）。由谱图可知，从分离效果来看，Waters T3色谱柱的分离效果最佳。 2.10 样品的检测 对收集的10批覆盆子配方颗粒样品按照上述色谱条件进行了指纹图谱考察，其叠加图谱见图4。通过对照品比对确认了鞣花酸、椴树苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷共3个特征共有峰，生成的对照指纹图谱见下图4。结果表明，各批次的覆盆子配方颗粒相互之间的相似度均在97.3%以上，说明各批次覆盆子配方颗粒稳定性良好，并且具备整体系统性和单味覆盆子配方颗粒的特征性。
3 讨论
根据目前的文献报道，覆盆子中的主要化学成分有二萜（ 苷） 、三萜（ 苷） 、黄酮（ 苷） 、甾体、生物碱等。本方法参考《中国药典》2020年版一部覆盆子【含量测定】项下方法，通过考察色谱柱、流动相、检测波长、供试品溶剂等因素，确定了覆盆子指纹图谱的最优色谱条件。在此条件下，对10批次覆盆子配方颗粒指纹图谱进行考察，结果显示供试品在鞣花酸、椴树苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷3个对照品相应位置，都有清晰的色谱峰。
采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统（2012版）》，以S1液相图谱为参照图谱，将10批覆盆子配方颗粒HPLC图谱色谱峰进行自动匹配，形成共有峰模式图，结果10批覆盆子配方颗粒干膏粉供试品中均呈现出多个共有峰，各批次之间相似度良好（均在97.3%以上），具有良好的稳定性和特征性。据此，暂定覆盆子配方颗粒指纹图谱相似度≥90%。
综上所述，本研究完成了覆盆子指纹图谱检测方法地开发，并制定了相关的质量标准和限度要求，可应用于覆盆子配方颗粒的质量控制。
参考文献：
[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典： 2015年版一部[S].北京： 中国医药科技出版社，2015.
[2] 程丹，李洁，周斌等. 覆盆子化学成分与药理作用研究进展[J]. 中药材， 2012， 35（11）： 1873-1876.
[3] 程丽珍. 覆盆子的质量标准研究[D]. 合肥：安徽中医药大学，2013.
[4] 郭卿，付辉政，周国平等. 覆盆子药材质量标准研究[J]. 江西中医药大学学报，2014，26（3）：51-54
[5] 郭卿.覆盆子化学成分及质量标准研究[D]. 南昌：江西中医药大学，2015.
[6] 刘明学， 牛靖娥. 覆盆子研究進展及其资源开发利用[J]. 科技视界， 2014， 08（22）： 26-27.
[7] 孙健， 沈晓霞. 覆盆子的药用研究进展与鲜食产业分析[J]. 科技通报， 2017， 33（6）： 82-85.
[8] 仇法新， 高福君. 中药配方颗粒的发展现状及应用前景[J]. 中国药房， 2007， 18（3）： 163-165.
[9] 胡辉，龙林，刘重阳等. 盐杜仲配方颗粒的质量标准[J]. 医药导报， 2018， 37（2）： 219-222.
[10] 胡辉，翟红伟，刘源才. 地肤子配方颗粒的质量标准[J]. 医药导报， 2019， 38（5）： 626-631.
第一作者：龙林，男，硕士，工程师，研究方向：中药资源与中药制剂，E-mail：364003726@qq.com
通讯作者：胡辉，男，学士，工程师，研究方向：中药资源与中药制剂，E-mail：15972368370@qq.com
基金项目：湖北省重点研发计划项目（2020ACA019）