目的探索新一代高通量二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术在耐药结核病诊断中的应用价值。方法搜集2016—2017年甘肃省结核病耐药基线调查150株临床分离株,排除非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria,NTM)菌株2株,进行比例法药物敏感性试验(简称"药敏试验")及结核分枝杆菌耐药相关基因(包括katG、inhA、embB、rpoB、rpsL、rrs、gyrA和gyrB)的NGS技术检测,剔除测序失败的13株,最后纳入分析菌株135株。以比例法药敏试验结果为参考标准评价二代测序在耐药结核病中的检测效能。结果以药敏试验结果为参考标准,NGS技术检测异烟肼、乙胺丁醇、利福平、链霉素、氧氟沙星耐药的敏感度分别为:88.75%(71/80)、85.71%(18/21)、84.72%(61/72)、73.91%(51/69)、68.97%(20/29),特异度分别为100.00%(55/55)、86.84%(99/114)、96.83%(61/63)、96.97%(64/66)、99.06%(105/106),Kappa值分别为0.87、0.59、0.81、0.71、0.76。异烟肼耐药基因突变主要在katG315位点上,突变频率为97.18%(69/71);乙胺丁醇耐药基因突变主要在embB306位点上,突变频率为88.89%(16/18);利福平耐药基因突变主要在耐药决定区,突变频率为93.65%(59/63);链霉素耐药基因突变主要在rpsL43位点上,突变频率为79.25%(42/53);氧氟沙星耐药基因突变主要在gyrA94位点上,突变频率为76.19%(16/21)。结论抗结核药物相关耐药基因NGS利福平、异烟肼、氧氟沙星耐药检测效能较好,能够满足临床结核病诊断需要。乙胺丁醇、链霉素已知耐药位点NGS耐药检测效能一般,需要对其耐药机制进行进一步的研究。