细胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility,CMS)作物是探究细胞核与细胞质相互作用机理的理想材料,对CMS分子机理进行深入探索,都为育种人员进一步利用杂种优势进行作物育种提供了便利。大量的研究表明,植物CMS的表型与线粒体基因组的变异有关,线粒体基因的异常表达导致了植物细胞质雄性不育。D1型水稻是以江西东乡野生稻为优质资源,培育出的一种独立于野败型的,无花粉型败育的新型孢子体CMS水稻。本实验室前期克隆的线粒体基因orf182为D1型水稻的候选CMS基因。在此基础上,本文利用石蜡切片技术对D1型水稻花药的败育时期及细胞学特点展开了研究,同时利用水稻转基因技术验证了线粒体基因orf182的功能,此外利用原核体系初步研究线粒体orf182基因导致CMS的分子机理。主要结果如下:(1)利用石蜡切片技术分别对水稻不育系(DPA)、保持系(DPB)的小孢子母细胞形成期、小孢子母细胞减数分裂期、单核早中期、单核晚期、二胞及花粉成熟期,共5个花药发育时期的结构进行了观察,结果表明从小孢子母细胞减数分裂时期开始,二者的发育就展现出了差异,与DPB相比,DPA花药中绒毡层的降解发生了推迟。利用荧光定量PCR对TDR、EAT1、OsAP25、OsAP37几个绒毡层发育相关的基因,在DPA和DPB之间的表达差异进行了分析,结果表明4个绒毡层发育相关基因在不育系和保持系中的表达量具有显著差异。(2)为了验证orf182是否能导致D1型水稻的CMS现象,本文将线粒体导肽序列(ATPγ)与orf182序列融合,成功构建了 orf182转基因载体(pCAMBLA1301-orf182),利用农杆菌介导的转化方法,将orf182转入DPA保持系粤泰B(YTB)中。最终共获得12株转基因阳性植株,其中,10株表现出无花粉型败育的特点。利用ORF182抗体,对这些转基因阳性植株进行western-blot 检测,结果表明,在线粒体导肽的作用下,ORF182 蛋白定位于线粒体中。以上结果揭示了线粒体基因orf182导致了 D1型水稻的CMS现象。(3)CMS相关基因的异源表达通常会抑制大肠杆菌的生长。为研究orf182的表达对大肠杆菌生长的影响,本文成功构建orf182基因的原核表达载体(pET-28a-orf182),结果表明,orf182的表达抑制了大肠杆菌的生长,引起了大肠杆菌呼吸速率的下降、ROS的爆发以及ATP含量的下降。(4)在orf182基因的表达菌株中对氧化呼吸链中三个关键酶磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)、柠檬酸合成酶(CS)的酶活性进行检测。结果发现:与对照菌株相比,orf182表达菌株的PFK酶活性降低,而PK和CS酶活性均显著性降低。