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摘要：目的 研究平胃散治疗湿阻中焦证的作用机理。方法 采用免疫组织化学染色检测AQP1的分布，采用酶联免疫法（ELISA）测定AQP1的含量。结果 AQP1主要分布在贲门和胃中的粘膜层。模型组AQP1表达降低；经平胃散干预后，与自然恢复组比较，AQP1的表达增加。结论 对AQP1的调控是平胃散调节湿阻中焦证模型大鼠体内水湿的作用机制之一。
关键词：平胃散 湿阻中焦证 水通道蛋白（AQP1） 大鼠
中图分类号：R322.4+4 文献标识码：A 文章编号：1005-0515（2013）3-018-02
中医临床辨证发现，众多疾患常伴湿阻中焦证，致使治疗难度增大，易加重或变生他证[1]。经典方平胃散具有“燥湿运脾，行气和胃”的功效，常用于对证治疗。近年来，对湿阻中焦证的研究主要集中在胃肠道等器官激素以及超微结构的变化等方面[2-4]，而对水通道蛋白的相关研究报道较少。本实验通过研究湿阻中焦证模型中胃组织水通道蛋白APQ1的表达异常，探明平胃散参与调控体内水液代谢的作用机理。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组 SD大鼠50只，雌雄各半，体重180～220g，检疫后备用。20只常规饲养，30只造模。
1.2 湿阻中焦证大鼠造模
造模箱环境18～25℃，湿度90%±5，模拟“久居湿地，外湿过盛”；造模大鼠单日禁食并灌胃4℃冰水一次（2ml/只），双日供应充足饲料并灌胃熟猪油一次（4ml/只），模拟“饮食不节，饥饱失常”；每日9：00～16：00置大鼠予4cm深的水中，控制睡眠时间7h，打乱生物钟，模拟“情志不遂”。连续20日。
造模结束当日，常规饲养组随机分为空白组和空白给药组，造模组随机分为湿阻中焦证模型组（模型组）、平胃散治疗组（平胃散组）和自然恢复组，每组10只；并把空白组和模型组大鼠处死取材。次日空白给药组和平胃散组给予平胃散汤剂灌胃（10ml/Kg），同时自然恢复组给予0.9%生理盐水灌胃（10ml/Kg），3日后处死取材。
1.3 试剂 PBS缓冲液（博士德生物公司）；AQPS试剂盒，由四川大学华西医学中心基础同位素室提供。
1.4 标本收集与制备 取大鼠胃贲门、胃体中间组织，用甲醛固定后，石蜡包埋，切片。
1.5 测定AQP1的分布 采用免疫组织化学染色检测AQP1[5]。形态学评分标准：分5级，0或-表示阴性，无表达；1或±表示略阳性，似有表达；2或+表示阳性范围小，有表达；3或++表示阳性范围近一半，表达明显；4或+++表示阳性分布接近整个区域，表达十分明显。
1.6 测定AQP1的含量 采用酶联免疫法（ELISA）测定。
1.7 数据统计 数据处理用统计软件spss13.0进行分析，数据以（ ±S）表示，采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 一般情况 空白组大鼠始终毛色光亮，肥壮，食量好，活动灵活，未见大便溏泻等病理现象。模型组体重减轻，活动量小，皮毛色泽晦暗，毛发打络，造模第一周见脂肪包被样和脂肪样便；第二周见脂肪样便和黄褐色稀溏便，体重增长停止甚至下降，饮水、采食量明显下降；第三周，大便以黄褐色软便为主，粪质较前稍干，体重有增长趋势，饮水、进食量基本持平。造模结束后，平胃散组与自然恢复组体重增长明显。
2.2 AQP1在胃组织层中的分布
2.3 胃粘膜下组织AQP1测定
由表2可知，胃贲门粘膜下组织AQP1水平与空白组比较，模型组和空白给药组均降低，差异极其显著（P<0.001）；与模型组比较，自然恢复组显著降低（P<0.05）；与自然恢复组比较，平胃散组AQP1表达水平有升高的趋势。
胃体中段粘膜AQP1的水平与空白组比较，模型组和空白给药组无明显差异（P>0.05），但空白给药组有升高趋势；与模型组比较，自然恢复组表达降低，与自然恢复组比较，平胃散组表达升高，两组差异极其显著（P<0.001）。
3 讨论
湿阻中焦证是指湿邪困阻脾胃，阻遏气机所表现的证候[6]。根据中医学“诸湿肿满，皆属于脾”等理论，该证主要表现为脏腑调节水液代谢失常，即脾主运化水液失常，形成体内津液输布不利，聚而为湿困阻脾胃。水通道蛋白（AQP）是一族广泛存在于人类各种组织细胞中，介导水跨膜转运的膜蛋白，是维持体内水液代谢平衡的分子学基础[7]。
检测AQP1在胃部的分布主要集中在贲门和胃中的粘膜层。造模后，粘膜层中的表达跟空白组相比，均有不同程度的降低，经自然恢复三天仍继续下降，符合湿邪“重浊粘腻、胶着难祛”特性。湿阻中焦证影响大鼠AQP1的表达的表达，形成组织细胞膜上水的跨膜转运障碍，使得水液在细胞内潴留，这可能是湿阻中焦证形成水钠潴留的病理机制之一。给予平胃散治疗后，与自然恢复组相比，AQP1的表达增加，可能平胃散燥湿醒脾的作用能恢复AQP1的表达，病理性水湿得以排出体外。说明对AQP1的调控是平胃散治疗湿阻中焦证的作用机制之一。
参考文献：
[1]李连成.湿阻的流行病学调查[J].中医杂志，1992，（6）：44-45.
[2]王昕，张永志，孙跃余，等.伤湿所致大白鼠脾阳虚证动物模型及其机理研究[J].辽宁中医杂志，1995，22（4）：18.
[3]张六通，梅永俊，黄志红，等.外湿大鼠关节、肺、大小肠和肝病理学研究[J].中国中医基础医学杂志，1996，2（3）：35.
[4]黄秀深，罗玉熙，沈涛，等.胃苓汤调节湿困脾胃证大鼠脑组织Na+_K+_ATP酶活性的实验研究[M].方剂的现代研究，中医古籍出版社出版，2006：151-154.
[5]赵二军等， AQP6和AQP5在人下颌下腺上的免疫组化定位[J].现代口腔医学杂志，2010，5：370-372.
[6]邓中甲.方剂学[M].北京：中国中医药出版社，2003：23.
[7]Denker BM，Smith BL，Kubejda FP，et al.Identification purification，and partial characterization of anovel Mr 28000 integral membrane protein from erythrocytes and renal tubules[J].J Biol Chem，1988，2639（30）：15634-15642.
第一作者简介：秦玉花，（1982- ），女，汉 ，讲师，中西医结合博士研究生，成都中医药大学基础医学院病原生物学与免疫学教研室，四川成都。研究方向：证候的基础研究，医学微生物与免疫学， E-mail：sinesister0328@163.com本文受国家自然科学基金资助。项目：“平胃散调控湿阻中焦证致水通道蛋白异常表达的机制研究”，编号：30973713。
通讯作者：黄秀深，（1955-），男，汉，教授，成都中医药大学基础医学院方剂学教研室，四川成都。研究方向：脏腑病机与复方配伍规律。
关键词：平胃散 湿阻中焦证 水通道蛋白（AQP1） 大鼠
中图分类号：R322.4+4 文献标识码：A 文章编号：1005-0515（2013）3-018-02
中医临床辨证发现，众多疾患常伴湿阻中焦证，致使治疗难度增大，易加重或变生他证[1]。经典方平胃散具有“燥湿运脾，行气和胃”的功效，常用于对证治疗。近年来，对湿阻中焦证的研究主要集中在胃肠道等器官激素以及超微结构的变化等方面[2-4]，而对水通道蛋白的相关研究报道较少。本实验通过研究湿阻中焦证模型中胃组织水通道蛋白APQ1的表达异常，探明平胃散参与调控体内水液代谢的作用机理。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组 SD大鼠50只，雌雄各半，体重180～220g，检疫后备用。20只常规饲养，30只造模。
1.2 湿阻中焦证大鼠造模
造模箱环境18～25℃，湿度90%±5，模拟“久居湿地，外湿过盛”；造模大鼠单日禁食并灌胃4℃冰水一次（2ml/只），双日供应充足饲料并灌胃熟猪油一次（4ml/只），模拟“饮食不节，饥饱失常”；每日9：00～16：00置大鼠予4cm深的水中，控制睡眠时间7h，打乱生物钟，模拟“情志不遂”。连续20日。
造模结束当日，常规饲养组随机分为空白组和空白给药组，造模组随机分为湿阻中焦证模型组（模型组）、平胃散治疗组（平胃散组）和自然恢复组，每组10只；并把空白组和模型组大鼠处死取材。次日空白给药组和平胃散组给予平胃散汤剂灌胃（10ml/Kg），同时自然恢复组给予0.9%生理盐水灌胃（10ml/Kg），3日后处死取材。
1.3 试剂 PBS缓冲液（博士德生物公司）；AQPS试剂盒，由四川大学华西医学中心基础同位素室提供。
1.4 标本收集与制备 取大鼠胃贲门、胃体中间组织，用甲醛固定后，石蜡包埋，切片。
1.5 测定AQP1的分布 采用免疫组织化学染色检测AQP1[5]。形态学评分标准：分5级，0或-表示阴性，无表达；1或±表示略阳性，似有表达；2或+表示阳性范围小，有表达；3或++表示阳性范围近一半，表达明显；4或+++表示阳性分布接近整个区域，表达十分明显。
1.6 测定AQP1的含量 采用酶联免疫法（ELISA）测定。
1.7 数据统计 数据处理用统计软件spss13.0进行分析，数据以（ ±S）表示，采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 一般情况 空白组大鼠始终毛色光亮，肥壮，食量好，活动灵活，未见大便溏泻等病理现象。模型组体重减轻，活动量小，皮毛色泽晦暗，毛发打络，造模第一周见脂肪包被样和脂肪样便；第二周见脂肪样便和黄褐色稀溏便，体重增长停止甚至下降，饮水、采食量明显下降；第三周，大便以黄褐色软便为主，粪质较前稍干，体重有增长趋势，饮水、进食量基本持平。造模结束后，平胃散组与自然恢复组体重增长明显。
2.2 AQP1在胃组织层中的分布
2.3 胃粘膜下组织AQP1测定
由表2可知，胃贲门粘膜下组织AQP1水平与空白组比较，模型组和空白给药组均降低，差异极其显著（P<0.001）；与模型组比较，自然恢复组显著降低（P<0.05）；与自然恢复组比较，平胃散组AQP1表达水平有升高的趋势。
胃体中段粘膜AQP1的水平与空白组比较，模型组和空白给药组无明显差异（P>0.05），但空白给药组有升高趋势；与模型组比较，自然恢复组表达降低，与自然恢复组比较，平胃散组表达升高，两组差异极其显著（P<0.001）。
3 讨论
湿阻中焦证是指湿邪困阻脾胃，阻遏气机所表现的证候[6]。根据中医学“诸湿肿满，皆属于脾”等理论，该证主要表现为脏腑调节水液代谢失常，即脾主运化水液失常，形成体内津液输布不利，聚而为湿困阻脾胃。水通道蛋白（AQP）是一族广泛存在于人类各种组织细胞中，介导水跨膜转运的膜蛋白，是维持体内水液代谢平衡的分子学基础[7]。
检测AQP1在胃部的分布主要集中在贲门和胃中的粘膜层。造模后，粘膜层中的表达跟空白组相比，均有不同程度的降低，经自然恢复三天仍继续下降，符合湿邪“重浊粘腻、胶着难祛”特性。湿阻中焦证影响大鼠AQP1的表达的表达，形成组织细胞膜上水的跨膜转运障碍，使得水液在细胞内潴留，这可能是湿阻中焦证形成水钠潴留的病理机制之一。给予平胃散治疗后，与自然恢复组相比，AQP1的表达增加，可能平胃散燥湿醒脾的作用能恢复AQP1的表达，病理性水湿得以排出体外。说明对AQP1的调控是平胃散治疗湿阻中焦证的作用机制之一。
参考文献：
[1]李连成.湿阻的流行病学调查[J].中医杂志，1992，（6）：44-45.
[2]王昕，张永志，孙跃余，等.伤湿所致大白鼠脾阳虚证动物模型及其机理研究[J].辽宁中医杂志，1995，22（4）：18.
[3]张六通，梅永俊，黄志红，等.外湿大鼠关节、肺、大小肠和肝病理学研究[J].中国中医基础医学杂志，1996，2（3）：35.
[4]黄秀深，罗玉熙，沈涛，等.胃苓汤调节湿困脾胃证大鼠脑组织Na+_K+_ATP酶活性的实验研究[M].方剂的现代研究，中医古籍出版社出版，2006：151-154.
[5]赵二军等， AQP6和AQP5在人下颌下腺上的免疫组化定位[J].现代口腔医学杂志，2010，5：370-372.
[6]邓中甲.方剂学[M].北京：中国中医药出版社，2003：23.
[7]Denker BM，Smith BL，Kubejda FP，et al.Identification purification，and partial characterization of anovel Mr 28000 integral membrane protein from erythrocytes and renal tubules[J].J Biol Chem，1988，2639（30）：15634-15642.
第一作者简介：秦玉花，（1982- ），女，汉 ，讲师，中西医结合博士研究生，成都中医药大学基础医学院病原生物学与免疫学教研室，四川成都。研究方向：证候的基础研究，医学微生物与免疫学， E-mail：sinesister0328@163.com本文受国家自然科学基金资助。项目：“平胃散调控湿阻中焦证致水通道蛋白异常表达的机制研究”，编号：30973713。
通讯作者：黄秀深，（1955-），男，汉，教授，成都中医药大学基础医学院方剂学教研室，四川成都。研究方向：脏腑病机与复方配伍规律。