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【摘要】本研究以福建省林业科技试验中心选育的墨兰新品种‘梦之兰’为试验材料，对其种子进行非共生萌发研究，筛选合适的培养基，建立完整的无菌播种萌发技术体系。本研究得出‘梦之兰’种子无菌萌发最佳诱导培养基为：改良MS+6-BA1.5mg·L-1 +NAA0.8mg·L-1；最佳增殖培养基为：改良MS+6-BA1.5mg·L-1+ KT1.5mg·L-1+ NAA0.4mg·L-1；最佳生根培养基为：1/2MS+NAA1.0mg·L-1+IBA1.5mg·L-1+KT1.5mg·L-1。
【关键词】兰花；杂交育种；萌发；组织培养
abstract ：This study takes Meng Zhilan（a new variety of the Cymbidium）， which is chosen and nurtured by forestry science and technology experiment center in Fujian province ， as the experimental material for research on the vitro seed germination without fungus， screening of appropriate culture medium and the establishment of a complete system of aseptic seeding germination technology.This study concluded that the superiorinduction mediumfor aseptic germination of seeds was improved MS+6-BA1.5mg·L-1 +NAA0.8mg·L-1.The best suitable differentiation medium for aseptic germination of seeds was improved MS+6-BA1.5mg·L-1+ KT1.5mg·L-1+ NAA0.4mg·L-1while the best rooting medium for that was 1/2MS+NAA1.0mg·L-1+IBA1.5mg·L-1+KT1.5mg·L-1.
Key Words： orchid； pollination； germination； tissue culture
‘梦之兰’（Cymbidum sinense ‘Mengzhilan’）是2014年12月经福建省林木品种委员会审定通过的墨兰新品种（良种编号：闽R-SC-CS-038-2014）。该品种区别于普通的墨兰品种，其叶片线艺具鹅黄色边沿，花瓣竹叶型外三瓣为金黄色，开花性好，有微香，具有较广阔的市场前景。为加速新品种的扩繁，本研究对其种子进行非共生萌发研究，以期筛选合适的培养基，建立完整的‘梦之兰’无菌播种萌发技术体系。
1 材料与方法
1.1试验材料
本研究选取福建省林业科技试验中心选育的墨兰新品种‘梦之兰’果荚（蒴果）为外植体试验材料。
1.2试验方法
1.2.1外植体消毒处理
选取健康植株上饱满、表面无裂痕、无病害斑点的成熟果荚。先将果荚表面用清水清洗干净，然后用毛笔刷蘸少量洗衣粉，轻轻刷洗果荚表面。刷洗时应避免用力过猛损伤表面，
刷洗完成后，清水冲洗30min，然后置于超净台，先用75%酒精消毒2min，再用0.1%Hgcl2消毒10min，无菌水冲洗5次，吸干水分后，将蒴果纵切为二， 用镊子轻轻夹取着生于侧膜胎座上的种子，均匀铺在培养基上。种子无菌萌发采用的培养基有 MS、 改良MS、KC三种。播种后置于培养室中暗培养， 培养温度为25℃，30d后陆续观察种子萌发情况并记录种子萌发过程中的形态变化。
1.2.2诱导培养基筛选
以MS、改良MS、KC为基本培养基，添加不同的激素（6-BA、NAA），采用4因素3水平（见表1）的正交設计L9（34），共9个处理，每处理10瓶，重复3次，调查统计原球茎平均萌芽数、平均萌发率，再通过方差分析进行显著性检验，最终筛选出最佳的培养基配方。
1.2.3增殖培养基筛选
以MS、改良MS、KC、B5为基本培养基，添加不同的激素（6-BA、KT、NAA），采用5因素4水平（见表2）的正交设计的L16（45），共16个处理，每处理10瓶，重复3次，调查统计其平均增殖倍数，再通过方差分析进行显著性检验。
1.2.4生根培养基筛选
以1/2MS固体培养基为基本培养基，添加不同的生长调节剂（NAA、IBA、KT），采用4因素3水平（见表3）的正交设计L9（34），共9个处理，把杂交果荚无菌播种后的继代小苗（苗高1.0～2.0cm）接种于不同处理的培养基上，每处理3瓶，每瓶接10株小苗，重复3次，调查统计每瓶平均生根数、平均生根率，分析比较不同配方组合处理的生根效果，以筛选出最佳的生根培养基配方。
1.2.5培养条件
在果荚无菌播种后诱导阶段一直进行暗培养，直至分化出原球茎后转入继代增殖培养基中，继代增殖培养与生根培养试验时，外植体接种后，均进行7d暗光培养处理，之后将其置于光照时间为12h·d-1、温度（25+3）℃、光照强度1500Lux～2000Lux的条件下培养。诱导（初代）培养、继代培养糖用量为30g·L-1，生根培养糖用量为20g·L-1，琼脂粉7g·L-1。
1.2.6数据统计与分析
采用 Excel 2007 分析数据，用 SPSS17.0统计软件进行方差分析。 2 结果与分析
2.1不同培养基和激素配比对原球茎萌发的影响
由表4结果分析可以看出，3个因素对其原球茎数和萌发率影响的主次关系为：B（6-BA）>A（培养基）>C（NAA），最优组合为A1B3C3。
由表5方差分析可知，基本培养基对‘梦之兰’原球茎和萌发率的影响显著、6-BA对原球茎的影响极显著而对萌发率影响显著、NAA对‘梦之兰’原球茎、萌发率的影响不显著。
不同培养基组合，其诱导原球茎数不同，高浓度6-BA与NAA的培养基上容易产生原球茎，平均原球茎数随着6-BA和NAA的浓度的升高而增加；适当的NAA浓度，不但萌发的原球茎增多，而且颜色鲜绿、分化效果好。其原球茎数和萌发率均最高的为处理3，平均原球茎数为91个，平均萌发率为89%；其次是处理6，其不定芽数为75个，萌发率为74.4%。综合以上分析，诱导不定芽分化培养基以处理3为最佳。因此，‘梦之兰’种子无菌诱导原球茎萌发的最佳培养基为：改良MS+6-BA1.5mg·L-1 +NAA0.8mg·L-1，能获得分化能力较强的原球茎。
2.2增殖培养基的筛选
本研究中，将诱导培养基中萌发的原球茎转接到增殖培养基上进行培养，表6为40d后统计增殖的原球茎数，由表6结果数据可看出，平均增殖倍数以处理3最高，达6.1；其次为处理4和处理8，平均增殖倍数为5.4；最差的为处理13，平均增殖倍数数2。
由表6结果分析可看出，4个因素对其增殖倍数影响的主次关系为：A→B→D→C，即基本培养基对其增殖倍数影响力（A）>6-BA对其增殖倍数的影响力（B）>NAA对增殖倍数的影响力（D）>KT对增殖倍数的影响力（C）。
由表7方差分析可知，因素A（基本培养基）对增殖倍数影响极显著，因素B（6-BA）、因素C（KT）和因素D（NAA）对增殖倍数的影响显著。说明，不同水平的基本培养基、6-BA、KT、NAA对增殖倍数有不同的影响。因素A（基本培养基）的1水平、因素B（6-BA）、因素C（KT）和因素D（NAA）的3水平对原球茎的增殖效果最好，即最佳的增殖培养基为：改良MS+6-BA1.5mg·L-1+ KT1.5mg·L-1+ NAA0.4mg·L-1。
2.3生根培养基的筛选
采用1/2MS分别附加NAA（0.5、1.0、1.5）、IBA（1.0、1.5、2.0）和KT（0.5、1.0、1.5）进行生根培养，选取无根苗转入生根培养基中培养。30天后调查统计生根情况，结果见表8。结果表明：各处理都能诱导‘梦之兰’小苗生根，但生根率有显著差异（表9）。培养基中添加低浓度的NAA和IBA，并附低浓度的AC的试验处理其诱导生根的效果均好于不加生长素或加入较高浓度生长素的试验处理，说明低浓度的生长素较易诱导‘梦之兰’小苗生根，而高浓度的生长素对‘梦之兰’小苗生根有抑制作用。从表8可看出，处理5的平均生根条数为3.6条，其平均生根率最高为89.6%。因此，处理5，即1/2MS+NAA1.0mg·L-1+IBA1.5mg·L-1+KT0.5mg·L-1为‘梦之兰’组培苗最佳的生根培养基。
3 结论
‘梦之兰’种子无菌诱导原球茎的最佳培养基为：改良MS+6-BA1.5mg·L-1 +NAA0.8mg·L-1，能获得分化能力较强的原球茎，平均萌发率为89%。
增殖培养中，改良MS+6-BA1.5mg·L-1+ KT1.5mg·L-1+ NAA0.4mg·L-1最佳的增殖培养基配方，增殖倍数约达6.1。
生根培养中，以1/2MS+NAA1.0mg·L-1+IBA1.5mg·L-1+KT1.5mg·L-1为最佳的生根培养基配方，生根效果最好，生根率最高，達89.6%。
参考文献：
[1]徐建球，江瑞荣，陈孝丑，等.兰属新品种‘梦之兰’栽培基质筛选.亚热带农业研究， 2015.11（3）：190-193.
[2]张东旭，李承秀，王长宪，等.蕙兰种子的无菌萌发与快速繁殖研究[J].中国农学通报，2009，25（12）： 159-164.
[3]朱根发，王碧青，陈明莉，等.大花蕙兰与兰属植物种间杂交研究[J].植物学通报，2005，22（4）：445-448.
[4]曾宋君，陈之林，吴坤林，等.兜兰无菌播种和组织培养研究进展[J].园艺学报，2007，34（3）： 793-796.
[5]李方，陈昆松，陈汉韬，等.蕙兰、台兰种间杂交种子无菌播种育苗技术研究[J].浙江农业大学学报，1998，24（l）：69-73.
[6]张志胜，何琼英，傅雪琳，等.中国兰花远缘杂交及杂交种子萌发的研究闭.华南农业大学学报， 2001.4（22）2：62-65.
[7]张志胜，谢利，萧爱兴.秋水仙素处理兰花原球茎对其生长和诱变效应的影响IJ].核农学报，2005，19（1）：19-23.
[8]朱根发.大花蕙兰市场发展新动向[J].中国花卉盆景，2004（7）：32-33.
作者简介：李秀娟（1984年—），女，硕士研究生，研究方向：植物分子育种。
【关键词】兰花；杂交育种；萌发；组织培养
abstract ：This study takes Meng Zhilan（a new variety of the Cymbidium）， which is chosen and nurtured by forestry science and technology experiment center in Fujian province ， as the experimental material for research on the vitro seed germination without fungus， screening of appropriate culture medium and the establishment of a complete system of aseptic seeding germination technology.This study concluded that the superiorinduction mediumfor aseptic germination of seeds was improved MS+6-BA1.5mg·L-1 +NAA0.8mg·L-1.The best suitable differentiation medium for aseptic germination of seeds was improved MS+6-BA1.5mg·L-1+ KT1.5mg·L-1+ NAA0.4mg·L-1while the best rooting medium for that was 1/2MS+NAA1.0mg·L-1+IBA1.5mg·L-1+KT1.5mg·L-1.
Key Words： orchid； pollination； germination； tissue culture
‘梦之兰’（Cymbidum sinense ‘Mengzhilan’）是2014年12月经福建省林木品种委员会审定通过的墨兰新品种（良种编号：闽R-SC-CS-038-2014）。该品种区别于普通的墨兰品种，其叶片线艺具鹅黄色边沿，花瓣竹叶型外三瓣为金黄色，开花性好，有微香，具有较广阔的市场前景。为加速新品种的扩繁，本研究对其种子进行非共生萌发研究，以期筛选合适的培养基，建立完整的‘梦之兰’无菌播种萌发技术体系。
1 材料与方法
1.1试验材料
本研究选取福建省林业科技试验中心选育的墨兰新品种‘梦之兰’果荚（蒴果）为外植体试验材料。
1.2试验方法
1.2.1外植体消毒处理
选取健康植株上饱满、表面无裂痕、无病害斑点的成熟果荚。先将果荚表面用清水清洗干净，然后用毛笔刷蘸少量洗衣粉，轻轻刷洗果荚表面。刷洗时应避免用力过猛损伤表面，
刷洗完成后，清水冲洗30min，然后置于超净台，先用75%酒精消毒2min，再用0.1%Hgcl2消毒10min，无菌水冲洗5次，吸干水分后，将蒴果纵切为二， 用镊子轻轻夹取着生于侧膜胎座上的种子，均匀铺在培养基上。种子无菌萌发采用的培养基有 MS、 改良MS、KC三种。播种后置于培养室中暗培养， 培养温度为25℃，30d后陆续观察种子萌发情况并记录种子萌发过程中的形态变化。
1.2.2诱导培养基筛选
以MS、改良MS、KC为基本培养基，添加不同的激素（6-BA、NAA），采用4因素3水平（见表1）的正交設计L9（34），共9个处理，每处理10瓶，重复3次，调查统计原球茎平均萌芽数、平均萌发率，再通过方差分析进行显著性检验，最终筛选出最佳的培养基配方。
1.2.3增殖培养基筛选
以MS、改良MS、KC、B5为基本培养基，添加不同的激素（6-BA、KT、NAA），采用5因素4水平（见表2）的正交设计的L16（45），共16个处理，每处理10瓶，重复3次，调查统计其平均增殖倍数，再通过方差分析进行显著性检验。
1.2.4生根培养基筛选
以1/2MS固体培养基为基本培养基，添加不同的生长调节剂（NAA、IBA、KT），采用4因素3水平（见表3）的正交设计L9（34），共9个处理，把杂交果荚无菌播种后的继代小苗（苗高1.0～2.0cm）接种于不同处理的培养基上，每处理3瓶，每瓶接10株小苗，重复3次，调查统计每瓶平均生根数、平均生根率，分析比较不同配方组合处理的生根效果，以筛选出最佳的生根培养基配方。
1.2.5培养条件
在果荚无菌播种后诱导阶段一直进行暗培养，直至分化出原球茎后转入继代增殖培养基中，继代增殖培养与生根培养试验时，外植体接种后，均进行7d暗光培养处理，之后将其置于光照时间为12h·d-1、温度（25+3）℃、光照强度1500Lux～2000Lux的条件下培养。诱导（初代）培养、继代培养糖用量为30g·L-1，生根培养糖用量为20g·L-1，琼脂粉7g·L-1。
1.2.6数据统计与分析
采用 Excel 2007 分析数据，用 SPSS17.0统计软件进行方差分析。 2 结果与分析
2.1不同培养基和激素配比对原球茎萌发的影响
由表4结果分析可以看出，3个因素对其原球茎数和萌发率影响的主次关系为：B（6-BA）>A（培养基）>C（NAA），最优组合为A1B3C3。
由表5方差分析可知，基本培养基对‘梦之兰’原球茎和萌发率的影响显著、6-BA对原球茎的影响极显著而对萌发率影响显著、NAA对‘梦之兰’原球茎、萌发率的影响不显著。
不同培养基组合，其诱导原球茎数不同，高浓度6-BA与NAA的培养基上容易产生原球茎，平均原球茎数随着6-BA和NAA的浓度的升高而增加；适当的NAA浓度，不但萌发的原球茎增多，而且颜色鲜绿、分化效果好。其原球茎数和萌发率均最高的为处理3，平均原球茎数为91个，平均萌发率为89%；其次是处理6，其不定芽数为75个，萌发率为74.4%。综合以上分析，诱导不定芽分化培养基以处理3为最佳。因此，‘梦之兰’种子无菌诱导原球茎萌发的最佳培养基为：改良MS+6-BA1.5mg·L-1 +NAA0.8mg·L-1，能获得分化能力较强的原球茎。
2.2增殖培养基的筛选
本研究中，将诱导培养基中萌发的原球茎转接到增殖培养基上进行培养，表6为40d后统计增殖的原球茎数，由表6结果数据可看出，平均增殖倍数以处理3最高，达6.1；其次为处理4和处理8，平均增殖倍数为5.4；最差的为处理13，平均增殖倍数数2。
由表6结果分析可看出，4个因素对其增殖倍数影响的主次关系为：A→B→D→C，即基本培养基对其增殖倍数影响力（A）>6-BA对其增殖倍数的影响力（B）>NAA对增殖倍数的影响力（D）>KT对增殖倍数的影响力（C）。
由表7方差分析可知，因素A（基本培养基）对增殖倍数影响极显著，因素B（6-BA）、因素C（KT）和因素D（NAA）对增殖倍数的影响显著。说明，不同水平的基本培养基、6-BA、KT、NAA对增殖倍数有不同的影响。因素A（基本培养基）的1水平、因素B（6-BA）、因素C（KT）和因素D（NAA）的3水平对原球茎的增殖效果最好，即最佳的增殖培养基为：改良MS+6-BA1.5mg·L-1+ KT1.5mg·L-1+ NAA0.4mg·L-1。
2.3生根培养基的筛选
采用1/2MS分别附加NAA（0.5、1.0、1.5）、IBA（1.0、1.5、2.0）和KT（0.5、1.0、1.5）进行生根培养，选取无根苗转入生根培养基中培养。30天后调查统计生根情况，结果见表8。结果表明：各处理都能诱导‘梦之兰’小苗生根，但生根率有显著差异（表9）。培养基中添加低浓度的NAA和IBA，并附低浓度的AC的试验处理其诱导生根的效果均好于不加生长素或加入较高浓度生长素的试验处理，说明低浓度的生长素较易诱导‘梦之兰’小苗生根，而高浓度的生长素对‘梦之兰’小苗生根有抑制作用。从表8可看出，处理5的平均生根条数为3.6条，其平均生根率最高为89.6%。因此，处理5，即1/2MS+NAA1.0mg·L-1+IBA1.5mg·L-1+KT0.5mg·L-1为‘梦之兰’组培苗最佳的生根培养基。
3 结论
‘梦之兰’种子无菌诱导原球茎的最佳培养基为：改良MS+6-BA1.5mg·L-1 +NAA0.8mg·L-1，能获得分化能力较强的原球茎，平均萌发率为89%。
增殖培养中，改良MS+6-BA1.5mg·L-1+ KT1.5mg·L-1+ NAA0.4mg·L-1最佳的增殖培养基配方，增殖倍数约达6.1。
生根培养中，以1/2MS+NAA1.0mg·L-1+IBA1.5mg·L-1+KT1.5mg·L-1为最佳的生根培养基配方，生根效果最好，生根率最高，達89.6%。
参考文献：
[1]徐建球，江瑞荣，陈孝丑，等.兰属新品种‘梦之兰’栽培基质筛选.亚热带农业研究， 2015.11（3）：190-193.
[2]张东旭，李承秀，王长宪，等.蕙兰种子的无菌萌发与快速繁殖研究[J].中国农学通报，2009，25（12）： 159-164.
[3]朱根发，王碧青，陈明莉，等.大花蕙兰与兰属植物种间杂交研究[J].植物学通报，2005，22（4）：445-448.
[4]曾宋君，陈之林，吴坤林，等.兜兰无菌播种和组织培养研究进展[J].园艺学报，2007，34（3）： 793-796.
[5]李方，陈昆松，陈汉韬，等.蕙兰、台兰种间杂交种子无菌播种育苗技术研究[J].浙江农业大学学报，1998，24（l）：69-73.
[6]张志胜，何琼英，傅雪琳，等.中国兰花远缘杂交及杂交种子萌发的研究闭.华南农业大学学报， 2001.4（22）2：62-65.
[7]张志胜，谢利，萧爱兴.秋水仙素处理兰花原球茎对其生长和诱变效应的影响IJ].核农学报，2005，19（1）：19-23.
[8]朱根发.大花蕙兰市场发展新动向[J].中国花卉盆景，2004（7）：32-33.
作者简介：李秀娟（1984年—），女，硕士研究生，研究方向：植物分子育种。