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摘 要：建立固相萃取-高效液相色谱法测定熏肠中苯并（α）芘的检测方法。样品经Cleanert BaP-3固相萃取柱净化、浓缩，C18色谱柱进行分离。结果表明：苯并（α）芘在线性范围0.5～10 ng/mL内，相关系数大于0.99，最低检出限为0.06 ?g/kg，相对标准偏差小于5%，回收率97.8%～107.0%。本方法快速简便、重现性好，可以用于熏肠中苯并（α）芘含量的测定。
关键词：苯并（α）芘；熏肠；固相萃取
Abstract： A high performance liquid chromatography with solid-phase extraction method was developed for the determination of benzo（α）pyrene in smoked sausage. The extracted sample was purified on a Cleanert BaP-3 solid-phase extraction column and separated on a C18 column. Benzo（α）pyrene was measured using a fluorescence detector at an excitation wavelength of 384 nm and an emission wavelength of 406 nm. The resultsshowed that benzo（α）pyrene displayed good linearity relationship over the concentration range of 0.5–10 ng/mL， with a coefficient correlation of 0.99. The limit of detection was 0.06 μg/kg， and the precision was below 5%. The average recoveries for blank spiked samples were in the range of 97.8%—107.0%. This method was rapid， simple， reproducible， and applicable for benzo（α）pyrene determination in smoked sausage.
Key words： benzo（α） pyrene； smoked sausage； solid-phase extraction
中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2015）03-0020-03
doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201503005
熏肠是人们生活中非常喜爱的食品，但是在加工过程中，有机物会产生不完全燃烧现象并在肉制品表面沉积，脂肪、蛋白质等有机物在高温下的分解会产生多环芳类物质。现在已知的熏烤肉制品中多环芳烃类物质中苯并（α）芘是一种强致癌物[1-4]，它是多环芳烃类中毒性最大的一种，其毒性超过黄曲霉毒素。它对人体健康危害巨大，被人体的肠道吸收后，容易导致皮肤癌等疾病。许多国家已经规定其相应的膳食摄入量和食品的限量标准，德国规定肉制品中其限量为1.0 μg/kg[5-6]，GB2762—2012《食品中污染物限量》限定其在肉制品中最高残留量为5.0 μg/kg。
由于熏肠中的苯并（α）芘含量较低，含油脂多，基体复杂，干扰成分也多，在分析中干扰现象比较严重[7-9]。目前在实际工作中使用到的检测方法有
GB/T 5009.27—2003《食品中苯并（α）芘的测定》，NY/T 1666—2008《肉制品中苯并（α）芘的测定》，
GB/T 22509—2008《动植物油脂：苯并（α）芘的测定：反相高效液相色谱法》。根据对标准的学习、实验条件的摸索和已有文献的分析，GB/T 5009.27—2003因为使用荧光光度和目测，操作过程中使用的溶剂量大，准确度低[10]；NY/T1666—2008虽然分离效果好，检出限低，但是因为使用多次环己烷反萃取，回收率不高[11]；而
GB/T22509—2008中采用中性氧化铝自装柱，在实验中制作了柱子，但氧化铝等级难以控制，自装柱柱效不稳定，石油醚洗脱过程繁琐，收集的洗脱液旋转蒸发后还继续使用氮吹和再次旋转蒸发，最后使用乙腈-四氢呋喃转移定容，回收率低[12-14]。已有文献报道中提取肉制品中的苯并（α）芘的方法主要有液液萃取法、GPC净化法、C18固相萃取法[15-20]。本实验采用专用的Cleaner tBaP-3固相萃取柱，对原有的方法进行了改进，对国标方法进行优化，回收率稳定、准确度更高、方法的专属性更强。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
熏肠 市购。
苯并（α）芘标准溶液（20 μg/mL）（编号SB05-194-2008） 农业部环境保护科研监测所；正己烷、乙腈、四氢呋喃均为色谱纯 天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
LC-20AT液相色谱仪 日本岛津制作所；KQ-500型超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限公司；氮吹仪 北京五洲东方科技发展有限公司；CleanertBAP-3固相萃取柱 天津博纳艾杰尔科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 标准工作液的配制
吸取100 μL 20μg/mL储备液用甲醇定容到100 mL，配制20 ng/mL的储备液。移取25、50、100、250、500 μL质量浓度为20 ng/mL的储备液，用四氢呋喃稀释成质量浓度为0.5、1、2、5、10 ng/mL的标准工作液，其线性范围为0.5～10 ng/mL。 1.3.2 色谱条件
C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相乙腈∶水体积比为88∶12；流速1.0 mL/min；进样量20 ?L；荧光检测器：发射波长406 nm，激发波长384 nm；柱温40 ℃。
1.3.3 样品处理
1.3.3.1 样品制备
取熏肠样品，放入粉碎机粉碎，准确称取粉碎样品10 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入25 mL正己烷溶解，旋涡混合均匀，超声处理15 min，
5 000 r/min离心5 min，上清液转移至烧杯中，向残渣中再加入25 mL正己烷，重复上述步骤，合并两次上清液，浓缩到5.0 mL待净化。
1.3.3.2 BAP-3固相萃取柱净化
用5 mL二氯甲烷、5 mL正己烷活化固相萃取柱。将1.3.3.1节中待净化液上样到Cleanert BAP-3柱上，然后再用2.0 mL正己烷润洗烧杯，将润洗液也上样到柱上。用10 mL正己烷淋洗，弃去淋洗液。5 mL二氯甲烷洗脱，将洗脱液收集于玻璃试管中。将洗脱液在40 ℃条件下氮气吹干，用1 mL四氢呋喃定容，超声10 s，过0.45 ?m微孔滤膜，收集于2 mL样品瓶中，待测。
2 结果与分析
2.1 洗脱溶剂的选择
根据相关文献报道，选出有代表性的二氯甲烷、正己烷、异丙醇。固定样品的前处理的其他条件，分别用上述3种溶剂对填加了苯并（α）芘的小柱进行洗脱，发现使用二氯甲烷的洗脱力比正己烷和异丙醇更强，因此使用二氯甲烷作为洗脱溶剂。实验中进一步对洗脱溶剂量分析，使用2.0、5.0、8.0、10.0 mL进行洗脱，发现5.0 mL即能对样品进行充分洗脱，因此选用5.0 mL作为洗脱体积。
2.2 固相萃取柱的选择
赵冰等[3]使用Welchrom C18E（200 mg/3 mL）Welchrom BaP萃取柱，回收率在87.6%以上；林慧等[4]使用HiCapt Benzo（500 mg/3 mL）和CleanertBaP的小柱，回收率也在70%以上。上述3 种固相萃取柱是以中性氧化铝作为填料，对基质复杂的样品如香油等出现过回收不稳定的现象。本实验使用CleanertBaP-3采用高分子印记填料，具有更强的专属性，且处理过程中使用5.0 mL二氯甲烷和5.0 mL正己烷作为活化溶剂，上样之后使用10.0 mL正己烷淋洗，最后使用5.0 mL二氯甲烷洗脱，将洗脱液吹干后用乙腈定容，可以直接上机检测。整个过程使用溶剂量减小，且操作简单、样品回收情况较稳定。
2.3 检测结果分析
2.4 检出限和定量限
将标准品溶液储备液适当稀释后制得一系列不同质量浓度的标准品溶液，进样分析，以RSN=3作为检出限，苯并（α）芘的检出限为0.06 μg/kg；以RSN=10作为定量限，苯并（α）芘的定量限为0.2 ?g/kg。
2.5 工作曲线和线性范围
分别吸取标准工作液，按1.3.2节色谱条件上机测定，计算线性回归方程，其中，横坐标为检测样品含量（X），纵坐标为样品检测出峰的峰面积（Y）。得回归方程为Y=2.569×10―5X+2.487×10―2，相关系数为0.990以上。
2.6 回收率
取空白熏肉样品18 份，按0.3、0.6、3.0 μg/kg 3个加标水平加标，按照1.3.3节样品处理方法处理样品，按照1.3.2节色谱条件上机测定，测得苯并（α）芘的加标回收率见表1。加标回收率在97.8%～107.0%，回收结果比较满意，相对标准偏差小于5%。
3 结 论
本研究采用凝胶渗透色谱-固相萃取-高效液相色谱联用技术对熏肠中苯并（α）芘残留量进行测定，以保留时间定性，外标法定量。结果表明：苯并（α）芘在线性范围0.5～10 ng/mL 内，相关系数大于0.99，最低检出限为0.06 ?g/kg，相对标准偏差小于5%，回收率97.8%～107.0%。本方法快速简便、重现性好，可以用于熏肠中苯并（α）芘含量的测定。
参考文献：
[1] 郑睿行， 祝华明， 龚鸿萍， 等. 凝胶渗透色谱高效液相色谱联用测定食用植物油中苯并（α）芘[J]. 食品科学， 2011， 32（22）： 209-212.
[2] 郑睿行， 夏爱萍， 祝华明， 等. 凝胶渗透色谱-液相色谱法测定熏烤肉制品中的苯并（α）芘[J]. 食品研究与开发， 2013， 34（12）： 76-78.
[3] 赵冰， 李素， 戚彪， 等. 索氏提取-固相萃取-高效液相色谱法检测烟熏肉制品中苯并（α）芘[J]. 肉类研究， 2013， 27（11）： 30-32.
[4] 林慧， 颜春荣， 徐春祥， 等. 固相萃取-高效液相色谱法测定肉制品中苯并（α）芘[J]. 肉类研究， 2012， 26（6）： 24-27.
[5] 张巧英， 张龙杰， 唐晓渝， 等. 某大学及周边烤炸食品中亚硝酸盐和苯并芘监测[J]. 现代预防医学， 2010， 37（8）： 1435-1440.
[6] 蔡智鸣， 赵佳， 王振， 等. 烧烤肉类食品中苯并（α）芘的HPLC测定[J]. 同济大学学报： 医学版， 2008， 29（3）： 28-30.
[7] 权美平， 吴梦瑶. 熏烤肉制品中苯并芘的危害及控制措施[J]. 氨基酸和生物资源， 2012， 34（3）： 66-68.
[8] 刘辉， 王维民. 烟熏肉制品中多环芳烃的提取及检测分析[J]. 肉类工业， 2010（4）： 37-39.
[9] 赵欢欢， 刘玉兰， 张小涛， 等. 吸附法脱除芝麻油中苯并芘及脱色效果研究[J]. 粮油食品科技， 2013， 23（4）： 23-27.
[10] 胡奇杰， 沈黎炜， 戚民， 等. 高效液相色谱法测定肉制品中的苯并芘[J]. 食品研究与开发， 2010， 31（6）： 146-149.
[11] 吴丹. 食品中苯并芘污染的危害性及其预防措施[J]. 食品工业科技， 2008， 29（5）： 309-311.
[12] 王广峰. 苯并芘对人体的危害和食品中苯并芘的来源及防控[J]. 菏泽学院学报， 2014， 36（2）： 66-70.
[13] 吴海智， 周丛， 袁列江， 等. 高效液相色谱法快速测定植物油中苯并芘的研究[J]. 安徽农业科学， 2011， 39（10）： 6075-6076.
[14] 胡加文， 李天宝， 王春利， 等. 固相萃取-液相色谱法测定方便面中苯并芘[J]. 化学分析计量， 2014， 23（3）： 25-27.
[15] 黄鸾玉， 黎小正， 秦振发. 固相萃取高效液相色谱荧光法测定水产品中苯并芘[J]. 分析试验室， 2009， 28（12）： 63-66.
[16] 张朝青， 邢雁， 余雷. 高效液相色谱法测定水源中苯并芘的方法研究[J]. 广东化工， 2014， 41（8）： 151-152.
[17] 王红青， 韩里明， 屠海云. 固相萃取-超高效液相色谱荧光法测定植物油中苯并（α）芘[J]. 食品科学， 2012， 33（14）： 216-218.
[18] 赵欢欢， 刘玉兰， 张小涛， 等. 吸附法脱除芝麻油中苯并芘及脱色效果研究[J]. 粮油食品科技， 2013， 21（4）： 23-27.
[19] 吴雪辉， 李叶青， 郑艳艳. 茶油中苯并芘的活性炭吸附工艺研究[J]. 中国食品学报， 2014， 14（9）： 171-175.
[20] 谭亮， 胡风祖. 植物油中苯并芘的提取工艺[J]. 光谱实验室， 2013， 30（3）： 1103-1106.
关键词：苯并（α）芘；熏肠；固相萃取
Abstract： A high performance liquid chromatography with solid-phase extraction method was developed for the determination of benzo（α）pyrene in smoked sausage. The extracted sample was purified on a Cleanert BaP-3 solid-phase extraction column and separated on a C18 column. Benzo（α）pyrene was measured using a fluorescence detector at an excitation wavelength of 384 nm and an emission wavelength of 406 nm. The resultsshowed that benzo（α）pyrene displayed good linearity relationship over the concentration range of 0.5–10 ng/mL， with a coefficient correlation of 0.99. The limit of detection was 0.06 μg/kg， and the precision was below 5%. The average recoveries for blank spiked samples were in the range of 97.8%—107.0%. This method was rapid， simple， reproducible， and applicable for benzo（α）pyrene determination in smoked sausage.
Key words： benzo（α） pyrene； smoked sausage； solid-phase extraction
中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2015）03-0020-03
doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201503005
熏肠是人们生活中非常喜爱的食品，但是在加工过程中，有机物会产生不完全燃烧现象并在肉制品表面沉积，脂肪、蛋白质等有机物在高温下的分解会产生多环芳类物质。现在已知的熏烤肉制品中多环芳烃类物质中苯并（α）芘是一种强致癌物[1-4]，它是多环芳烃类中毒性最大的一种，其毒性超过黄曲霉毒素。它对人体健康危害巨大，被人体的肠道吸收后，容易导致皮肤癌等疾病。许多国家已经规定其相应的膳食摄入量和食品的限量标准，德国规定肉制品中其限量为1.0 μg/kg[5-6]，GB2762—2012《食品中污染物限量》限定其在肉制品中最高残留量为5.0 μg/kg。
由于熏肠中的苯并（α）芘含量较低，含油脂多，基体复杂，干扰成分也多，在分析中干扰现象比较严重[7-9]。目前在实际工作中使用到的检测方法有
GB/T 5009.27—2003《食品中苯并（α）芘的测定》，NY/T 1666—2008《肉制品中苯并（α）芘的测定》，
GB/T 22509—2008《动植物油脂：苯并（α）芘的测定：反相高效液相色谱法》。根据对标准的学习、实验条件的摸索和已有文献的分析，GB/T 5009.27—2003因为使用荧光光度和目测，操作过程中使用的溶剂量大，准确度低[10]；NY/T1666—2008虽然分离效果好，检出限低，但是因为使用多次环己烷反萃取，回收率不高[11]；而
GB/T22509—2008中采用中性氧化铝自装柱，在实验中制作了柱子，但氧化铝等级难以控制，自装柱柱效不稳定，石油醚洗脱过程繁琐，收集的洗脱液旋转蒸发后还继续使用氮吹和再次旋转蒸发，最后使用乙腈-四氢呋喃转移定容，回收率低[12-14]。已有文献报道中提取肉制品中的苯并（α）芘的方法主要有液液萃取法、GPC净化法、C18固相萃取法[15-20]。本实验采用专用的Cleaner tBaP-3固相萃取柱，对原有的方法进行了改进，对国标方法进行优化，回收率稳定、准确度更高、方法的专属性更强。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
熏肠 市购。
苯并（α）芘标准溶液（20 μg/mL）（编号SB05-194-2008） 农业部环境保护科研监测所；正己烷、乙腈、四氢呋喃均为色谱纯 天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
LC-20AT液相色谱仪 日本岛津制作所；KQ-500型超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限公司；氮吹仪 北京五洲东方科技发展有限公司；CleanertBAP-3固相萃取柱 天津博纳艾杰尔科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 标准工作液的配制
吸取100 μL 20μg/mL储备液用甲醇定容到100 mL，配制20 ng/mL的储备液。移取25、50、100、250、500 μL质量浓度为20 ng/mL的储备液，用四氢呋喃稀释成质量浓度为0.5、1、2、5、10 ng/mL的标准工作液，其线性范围为0.5～10 ng/mL。 1.3.2 色谱条件
C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相乙腈∶水体积比为88∶12；流速1.0 mL/min；进样量20 ?L；荧光检测器：发射波长406 nm，激发波长384 nm；柱温40 ℃。
1.3.3 样品处理
1.3.3.1 样品制备
取熏肠样品，放入粉碎机粉碎，准确称取粉碎样品10 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入25 mL正己烷溶解，旋涡混合均匀，超声处理15 min，
5 000 r/min离心5 min，上清液转移至烧杯中，向残渣中再加入25 mL正己烷，重复上述步骤，合并两次上清液，浓缩到5.0 mL待净化。
1.3.3.2 BAP-3固相萃取柱净化
用5 mL二氯甲烷、5 mL正己烷活化固相萃取柱。将1.3.3.1节中待净化液上样到Cleanert BAP-3柱上，然后再用2.0 mL正己烷润洗烧杯，将润洗液也上样到柱上。用10 mL正己烷淋洗，弃去淋洗液。5 mL二氯甲烷洗脱，将洗脱液收集于玻璃试管中。将洗脱液在40 ℃条件下氮气吹干，用1 mL四氢呋喃定容，超声10 s，过0.45 ?m微孔滤膜，收集于2 mL样品瓶中，待测。
2 结果与分析
2.1 洗脱溶剂的选择
根据相关文献报道，选出有代表性的二氯甲烷、正己烷、异丙醇。固定样品的前处理的其他条件，分别用上述3种溶剂对填加了苯并（α）芘的小柱进行洗脱，发现使用二氯甲烷的洗脱力比正己烷和异丙醇更强，因此使用二氯甲烷作为洗脱溶剂。实验中进一步对洗脱溶剂量分析，使用2.0、5.0、8.0、10.0 mL进行洗脱，发现5.0 mL即能对样品进行充分洗脱，因此选用5.0 mL作为洗脱体积。
2.2 固相萃取柱的选择
赵冰等[3]使用Welchrom C18E（200 mg/3 mL）Welchrom BaP萃取柱，回收率在87.6%以上；林慧等[4]使用HiCapt Benzo（500 mg/3 mL）和CleanertBaP的小柱，回收率也在70%以上。上述3 种固相萃取柱是以中性氧化铝作为填料，对基质复杂的样品如香油等出现过回收不稳定的现象。本实验使用CleanertBaP-3采用高分子印记填料，具有更强的专属性，且处理过程中使用5.0 mL二氯甲烷和5.0 mL正己烷作为活化溶剂，上样之后使用10.0 mL正己烷淋洗，最后使用5.0 mL二氯甲烷洗脱，将洗脱液吹干后用乙腈定容，可以直接上机检测。整个过程使用溶剂量减小，且操作简单、样品回收情况较稳定。
2.3 检测结果分析
2.4 检出限和定量限
将标准品溶液储备液适当稀释后制得一系列不同质量浓度的标准品溶液，进样分析，以RSN=3作为检出限，苯并（α）芘的检出限为0.06 μg/kg；以RSN=10作为定量限，苯并（α）芘的定量限为0.2 ?g/kg。
2.5 工作曲线和线性范围
分别吸取标准工作液，按1.3.2节色谱条件上机测定，计算线性回归方程，其中，横坐标为检测样品含量（X），纵坐标为样品检测出峰的峰面积（Y）。得回归方程为Y=2.569×10―5X+2.487×10―2，相关系数为0.990以上。
2.6 回收率
取空白熏肉样品18 份，按0.3、0.6、3.0 μg/kg 3个加标水平加标，按照1.3.3节样品处理方法处理样品，按照1.3.2节色谱条件上机测定，测得苯并（α）芘的加标回收率见表1。加标回收率在97.8%～107.0%，回收结果比较满意，相对标准偏差小于5%。
3 结 论
本研究采用凝胶渗透色谱-固相萃取-高效液相色谱联用技术对熏肠中苯并（α）芘残留量进行测定，以保留时间定性，外标法定量。结果表明：苯并（α）芘在线性范围0.5～10 ng/mL 内，相关系数大于0.99，最低检出限为0.06 ?g/kg，相对标准偏差小于5%，回收率97.8%～107.0%。本方法快速简便、重现性好，可以用于熏肠中苯并（α）芘含量的测定。
参考文献：
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[2] 郑睿行， 夏爱萍， 祝华明， 等. 凝胶渗透色谱-液相色谱法测定熏烤肉制品中的苯并（α）芘[J]. 食品研究与开发， 2013， 34（12）： 76-78.
[3] 赵冰， 李素， 戚彪， 等. 索氏提取-固相萃取-高效液相色谱法检测烟熏肉制品中苯并（α）芘[J]. 肉类研究， 2013， 27（11）： 30-32.
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[10] 胡奇杰， 沈黎炜， 戚民， 等. 高效液相色谱法测定肉制品中的苯并芘[J]. 食品研究与开发， 2010， 31（6）： 146-149.
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[16] 张朝青， 邢雁， 余雷. 高效液相色谱法测定水源中苯并芘的方法研究[J]. 广东化工， 2014， 41（8）： 151-152.
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[18] 赵欢欢， 刘玉兰， 张小涛， 等. 吸附法脱除芝麻油中苯并芘及脱色效果研究[J]. 粮油食品科技， 2013， 21（4）： 23-27.
[19] 吴雪辉， 李叶青， 郑艳艳. 茶油中苯并芘的活性炭吸附工艺研究[J]. 中国食品学报， 2014， 14（9）： 171-175.
[20] 谭亮， 胡风祖. 植物油中苯并芘的提取工艺[J]. 光谱实验室， 2013， 30（3）： 1103-1106.