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摘要：以BamH Ⅰ和Sal Ⅰ 双酶切pMD18-T-CmSS1和表达载体pBI121，再用T4 DNA连接酶将回收的目的片段反向与pBI121连接。结果证明，CmSS1反向插入到 pBI121 中， 得到了 pBI121-CmSS1的重组质粒；利用农杆菌介导法将反义CmSS1基因转化甜瓜，经PCR检测，得到5株转基因植株。这为以后研究甜瓜蔗糖合成酶的活性调节机制及通过基因工程手段研究甜瓜SS的活性奠定了基础。
关键词：甜瓜；蔗糖合成酶；反义表达载体；遗传转化
中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）04-0004-04
甜瓜（ Cucumis melo L ） 是重要的园艺植物，是世界公认的十大健康水果之一，一直以其独特的风味备受青睐。甜瓜品质主要取决于可溶性糖的种类和含量。成熟甜瓜中大于97%的可溶性固形物是可溶性糖，而蔗糖占60%左右[1]。因此，国内外许多学者对甜瓜果实发育过程中可溶性糖的积累
进行了研究。张明方等[2]研究得出，在完熟的甜瓜果实中，蔗糖含量占了总糖含量的70%以上，因此蔗糖含量的多少决定着甜瓜质量的优劣； Lingle等[3]对网纹甜瓜果实发育的研究表明：甜瓜果实可溶性固形物的含量是衡量网纹甜瓜商品等级的重要标准。目前的研究认为甜瓜中蔗糖的含量主要取决于转化酶（Invertase，Inv）、蔗糖磷酸合成酶（Sucrose Phosphate Synthase，SPS）和蔗糖合成酶（Sucrose Synthase，SS），已经有学者对前两种酶在甜瓜中的具体功能进行了研究，得出这两种酶主要促进蔗糖的合成[4～7]。通过查阅资料得知，SS既可以促进蔗糖合成又可以起分解作用，但是一般认为SS起分解蔗糖的作用。
本试验旨在构建CmSS1的反义植物表达载体，并通过农杆菌介导法转化到甜瓜中，为进一步研究该基因在甜瓜中的表达及生物学功能奠定基础。
1材料与方法
11试验材料
111质粒和菌株大肠杆菌 DH5α、植物表达载体 pBI121 均为山东农业大学园艺学院实验室保存，甜瓜种子由山东农业大学园艺学院实验室提供。
112主要试剂限制性内切酶、T4连接酶、 胶回收试剂盒、pMD18-T 等购自大连宝生物公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。其他试剂为国产分析纯。
113培养基 种子生长培养基：MS固体培养基；（预）共培养： MS+2 mg/L 6-BA；筛选培养基：MS+2 mg/L 6-BA+75 mg/L K+500 mg/L Cef；分化培养基：MS+1 mg/L 6-BA+75 mg/L K+500 mg/L Cef；伸长培养基：MS+05 mg/L 6-BA+50 mg/L K +250 mg/L Cef；生根培养基：MS+05 mg/L IAA+25 mg/L K +125 mg/L Cef[8～10]。上述培养基若加入抗生素，均需将无菌的培养基置于超净工作台上，待培养基冷却至60℃后，再将无菌的抗生素加入。
12试验方法
121SS基因表达载体 PBI121-CmSS1 的构建 按常规碱裂解法提取 pMD18 -T-CmSS1和pBI121 质粒， 分别用BamHⅠ和SalⅠ双酶切， 酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳后， 用胶回收试剂盒分别回收目的基因片段和 pBI121 大片段，将两者以 1∶3 的比例混合， 用T4 DNA连接酶16℃连接过夜， 取 10 μl连接产物转化大肠杆菌DH5α， 将菌液均匀涂布于 LB（Kan 50 mg/L） 平板上， 37℃倒置培养过夜， 碱法提取质粒， 经 PCR验证、BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切验证阳性克隆。
122植物材料的准备选取饱满新鲜的种子，去除坚硬的外皮，用70%酒精处理1 min，无菌水冲洗3遍，然后用07%的NaClO浸泡15 min，用无菌水冲洗后，滤纸吸干，接种到MS固体培养基上，在甜瓜子叶由黄转绿时，将子叶横切一分为二，接种于培养基上，在黑暗与光照条件下预培养2 d，即用于转化。
123外植体的转化[11]①接种已经转入植物表达载体的农杆菌单克隆，在含有Kan的YEP培养基振荡培养过夜，取1 ml菌液转入10 ml不含抗生素的YEP培养基中进行活化。振荡至OD600为02～03，离心收集菌体，用MS液体培养基悬浮稀释10倍。
②将预培养后的外植体侵入农杆菌10 min，放入到培养基中，在黑暗条件下共培养3 d。
③培养的外植体，用灭菌水（含有Kan和头孢霉素）洗3次，再用MS液体培养基洗一次，放入到分化培养基上，28℃下筛选培养。
④待芽体长至1 cm左右时，切下芽体移入培养基中。等芽体长至2～3 cm时，转入到生根培养基中。待根系发育好后，揭开组培瓶的封瓶膜，往瓶中加水以保证适当的湿度。在室内炼苗2～3 d，转入到营养钵中，在大田中进行种植。
124PCR检测①甜瓜幼苗总DNA提取： 取4～5叶龄的转基因植株，按照SDS法提取总DNA。②PCR反应：预变性94℃ 5 min；变性94℃ 1 min，退火55℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，35个循环；延伸72℃ 10 min。反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测。
2结果与分析
2 1甜瓜SS基因表达载体的构建
3小结与讨论
本试验中采用的植物表达载体酶切后的PBI121大小为14 kb，与目的基因比较难连接，因此采用高效率的T4连接酶，同时对目的基因与植物表达载体的连接比例进行优化。最后得出两者的摩尔比为1∶3时效果最佳，这与马乐园等[12]人的研究结果相同。 在转化过程中，农杆菌必须具有很高的活性。因此，我们在试验中使对数期菌液的浓度为02～03，这与陆璐等[13]的研究相同，这样才能保持细菌的活力最高，侵染力最强；一旦浓度过大，超过对数期，细菌的活力就会明显下降，侵染力降低，不利于转化。
外植体浸泡的时间：时间过长，会引起毒害作用；时间过短，转化的频率会降低，因此，在浸泡时，一定要选择一个合适的浸泡时间来提高转化效率。
反义技术在植物育种研究中有着重要应用，根据胡萝卜SS的cDNA在35S CaMV启动子调控下反义表达和转化植株的情况，发现转化植株的SS活性在直根中下降，蔗糖大量积累，同时有少量葡萄糖、果糖、淀粉和纤维素积累；转化植株的表型也有明显变化，植株、叶和根均变小，表明SS有影响植株生长的作用[14]。本试验中的转基因植株也出现了植株、叶片小于对照的现象。对该基因的具体功能正在进一步的验证当中。
参考文献：
[1]王坚中国西瓜甜瓜[M]北京：中国农业出版社，2000，435-436
[2]张明方， 李志凌， 陈昆松， 等网纹甜瓜发育果实糖积累与蔗糖代谢参与酶的关系[J]植物生理与分子生物学学报， 2003， 29（5）：455-462
[3]Lingle S E， Dunlap J R Sucrose metabolism in netted muskmelon fruit during development[J]Plant Physiol， 1987，84（2）：386-389
[4]Yu Xiyan ，Wang Xiufeng ，Zheng Chengchao Antisense suppression of an acid invertase gene in muskmelon alters plant growth and fruit development [J]JExpBot，2008，59（11）：2955-2967
[5]Yu Xiyan，Fan Jide，Kong Qingguo，et al Antisense acid invertase （MAI1） gene alters soluble sugar composition and size in transgenic muskmelon fruit [J] Acta Hort，2007， 763：237-243
[6]樊继德 甜瓜反义酸性转化酶基因表达特性分析及功能鉴定[D]泰安：山东农业大学，2007
[7]田红梅甜瓜蔗糖磷酸合成酶基因的功能鉴定与分析[D]泰安：山东农业大学，2011
[8]王建设， 陈杭 甜瓜再生芽高效诱导方法的研究[J]园艺学报， 2000， 26（5）：339-340
[9]于喜艳， 何启伟， 孔庆国 甜瓜子叶组织培养的研究[J]山东农业科学， 2002，2：22-23
[10]夏海武， 马秀兰， 万永霞甜瓜组织培养与快速繁殖的研究[J]山东农业科学， 2005，2：23-24
[11]王慧中， 李亚南， 赵培洁 根癌农杆菌介导的甜瓜基因转化及其转基因植株的再生[J]浙江大学学报（农业与生命科学版）， 2000， 26（3）： 287- 290
[12]马乐园，于喜艳 甜瓜果实八氢番茄红素合成酶基因的克隆及正义表达载体的构建[J] 山东农业科学，2011，8：4-7
[13]陆璐， 赵长曾， 陆婷 甜瓜“黄旦子”子叶再生完整植株的研究[J]西北农林科技大学学报（自然科学版）， 2005， 33（8）：81-85
[14]Tang G Q，Sturm AAntisense repression of sucrose synthase in carrot（Daucus carota L）affects growth rather than sucrose partitioning[J]Plant MolBiol，1999，41（4）：465-479
关键词：甜瓜；蔗糖合成酶；反义表达载体；遗传转化
中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）04-0004-04
甜瓜（ Cucumis melo L ） 是重要的园艺植物，是世界公认的十大健康水果之一，一直以其独特的风味备受青睐。甜瓜品质主要取决于可溶性糖的种类和含量。成熟甜瓜中大于97%的可溶性固形物是可溶性糖，而蔗糖占60%左右[1]。因此，国内外许多学者对甜瓜果实发育过程中可溶性糖的积累
进行了研究。张明方等[2]研究得出，在完熟的甜瓜果实中，蔗糖含量占了总糖含量的70%以上，因此蔗糖含量的多少决定着甜瓜质量的优劣； Lingle等[3]对网纹甜瓜果实发育的研究表明：甜瓜果实可溶性固形物的含量是衡量网纹甜瓜商品等级的重要标准。目前的研究认为甜瓜中蔗糖的含量主要取决于转化酶（Invertase，Inv）、蔗糖磷酸合成酶（Sucrose Phosphate Synthase，SPS）和蔗糖合成酶（Sucrose Synthase，SS），已经有学者对前两种酶在甜瓜中的具体功能进行了研究，得出这两种酶主要促进蔗糖的合成[4～7]。通过查阅资料得知，SS既可以促进蔗糖合成又可以起分解作用，但是一般认为SS起分解蔗糖的作用。
本试验旨在构建CmSS1的反义植物表达载体，并通过农杆菌介导法转化到甜瓜中，为进一步研究该基因在甜瓜中的表达及生物学功能奠定基础。
1材料与方法
11试验材料
111质粒和菌株大肠杆菌 DH5α、植物表达载体 pBI121 均为山东农业大学园艺学院实验室保存，甜瓜种子由山东农业大学园艺学院实验室提供。
112主要试剂限制性内切酶、T4连接酶、 胶回收试剂盒、pMD18-T 等购自大连宝生物公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。其他试剂为国产分析纯。
113培养基 种子生长培养基：MS固体培养基；（预）共培养： MS+2 mg/L 6-BA；筛选培养基：MS+2 mg/L 6-BA+75 mg/L K+500 mg/L Cef；分化培养基：MS+1 mg/L 6-BA+75 mg/L K+500 mg/L Cef；伸长培养基：MS+05 mg/L 6-BA+50 mg/L K +250 mg/L Cef；生根培养基：MS+05 mg/L IAA+25 mg/L K +125 mg/L Cef[8～10]。上述培养基若加入抗生素，均需将无菌的培养基置于超净工作台上，待培养基冷却至60℃后，再将无菌的抗生素加入。
12试验方法
121SS基因表达载体 PBI121-CmSS1 的构建 按常规碱裂解法提取 pMD18 -T-CmSS1和pBI121 质粒， 分别用BamHⅠ和SalⅠ双酶切， 酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳后， 用胶回收试剂盒分别回收目的基因片段和 pBI121 大片段，将两者以 1∶3 的比例混合， 用T4 DNA连接酶16℃连接过夜， 取 10 μl连接产物转化大肠杆菌DH5α， 将菌液均匀涂布于 LB（Kan 50 mg/L） 平板上， 37℃倒置培养过夜， 碱法提取质粒， 经 PCR验证、BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切验证阳性克隆。
122植物材料的准备选取饱满新鲜的种子，去除坚硬的外皮，用70%酒精处理1 min，无菌水冲洗3遍，然后用07%的NaClO浸泡15 min，用无菌水冲洗后，滤纸吸干，接种到MS固体培养基上，在甜瓜子叶由黄转绿时，将子叶横切一分为二，接种于培养基上，在黑暗与光照条件下预培养2 d，即用于转化。
123外植体的转化[11]①接种已经转入植物表达载体的农杆菌单克隆，在含有Kan的YEP培养基振荡培养过夜，取1 ml菌液转入10 ml不含抗生素的YEP培养基中进行活化。振荡至OD600为02～03，离心收集菌体，用MS液体培养基悬浮稀释10倍。
②将预培养后的外植体侵入农杆菌10 min，放入到培养基中，在黑暗条件下共培养3 d。
③培养的外植体，用灭菌水（含有Kan和头孢霉素）洗3次，再用MS液体培养基洗一次，放入到分化培养基上，28℃下筛选培养。
④待芽体长至1 cm左右时，切下芽体移入培养基中。等芽体长至2～3 cm时，转入到生根培养基中。待根系发育好后，揭开组培瓶的封瓶膜，往瓶中加水以保证适当的湿度。在室内炼苗2～3 d，转入到营养钵中，在大田中进行种植。
124PCR检测①甜瓜幼苗总DNA提取： 取4～5叶龄的转基因植株，按照SDS法提取总DNA。②PCR反应：预变性94℃ 5 min；变性94℃ 1 min，退火55℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，35个循环；延伸72℃ 10 min。反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测。
2结果与分析
2 1甜瓜SS基因表达载体的构建
3小结与讨论
本试验中采用的植物表达载体酶切后的PBI121大小为14 kb，与目的基因比较难连接，因此采用高效率的T4连接酶，同时对目的基因与植物表达载体的连接比例进行优化。最后得出两者的摩尔比为1∶3时效果最佳，这与马乐园等[12]人的研究结果相同。 在转化过程中，农杆菌必须具有很高的活性。因此，我们在试验中使对数期菌液的浓度为02～03，这与陆璐等[13]的研究相同，这样才能保持细菌的活力最高，侵染力最强；一旦浓度过大，超过对数期，细菌的活力就会明显下降，侵染力降低，不利于转化。
外植体浸泡的时间：时间过长，会引起毒害作用；时间过短，转化的频率会降低，因此，在浸泡时，一定要选择一个合适的浸泡时间来提高转化效率。
反义技术在植物育种研究中有着重要应用，根据胡萝卜SS的cDNA在35S CaMV启动子调控下反义表达和转化植株的情况，发现转化植株的SS活性在直根中下降，蔗糖大量积累，同时有少量葡萄糖、果糖、淀粉和纤维素积累；转化植株的表型也有明显变化，植株、叶和根均变小，表明SS有影响植株生长的作用[14]。本试验中的转基因植株也出现了植株、叶片小于对照的现象。对该基因的具体功能正在进一步的验证当中。
参考文献：
[1]王坚中国西瓜甜瓜[M]北京：中国农业出版社，2000，435-436
[2]张明方， 李志凌， 陈昆松， 等网纹甜瓜发育果实糖积累与蔗糖代谢参与酶的关系[J]植物生理与分子生物学学报， 2003， 29（5）：455-462
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[6]樊继德 甜瓜反义酸性转化酶基因表达特性分析及功能鉴定[D]泰安：山东农业大学，2007
[7]田红梅甜瓜蔗糖磷酸合成酶基因的功能鉴定与分析[D]泰安：山东农业大学，2011
[8]王建设， 陈杭 甜瓜再生芽高效诱导方法的研究[J]园艺学报， 2000， 26（5）：339-340
[9]于喜艳， 何启伟， 孔庆国 甜瓜子叶组织培养的研究[J]山东农业科学， 2002，2：22-23
[10]夏海武， 马秀兰， 万永霞甜瓜组织培养与快速繁殖的研究[J]山东农业科学， 2005，2：23-24
[11]王慧中， 李亚南， 赵培洁 根癌农杆菌介导的甜瓜基因转化及其转基因植株的再生[J]浙江大学学报（农业与生命科学版）， 2000， 26（3）： 287- 290
[12]马乐园，于喜艳 甜瓜果实八氢番茄红素合成酶基因的克隆及正义表达载体的构建[J] 山东农业科学，2011，8：4-7
[13]陆璐， 赵长曾， 陆婷 甜瓜“黄旦子”子叶再生完整植株的研究[J]西北农林科技大学学报（自然科学版）， 2005， 33（8）：81-85
[14]Tang G Q，Sturm AAntisense repression of sucrose synthase in carrot（Daucus carota L）affects growth rather than sucrose partitioning[J]Plant MolBiol，1999，41（4）：465-479