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摘要[目的]研究TGA2在植物系统获得抗性中所起的作用，阐明其作用机制。[方法]通过PCR扩增获得拟南芥中TGA2基因全长CDS序列，克隆至pGADT7酵母表达载体，并转化至AH109酵母菌株中。[结果]重组质粒通过大肠杆菌转化获得了阳性克隆，经过菌落PCR及单、双酶切验证重组质粒构建成功。将重组质粒又转化到AH109酵母菌中，并在相应筛选培养基上成功获得了转酵母菌成功的阳性克隆。[结论]为进一步研究TGA2参与水杨酸诱导抗性基因表达的作用机制奠定了良好的基础。
关键词 AtTGA2；CDS克隆；酵母转化
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）30-10467-02
作者简介何乐（1990- ），女，湖南长沙人，硕士研究生，研究方向：分子抗性。*通讯作者。
TGA转录因子是一类含碱性DNA结合结构域和亮氨酸拉链结构域，可以结合到PR1基因启动子应答性的顺式作用元件。它因含有TGACCG/as1（Activation seguence1）元件而得名[1-2]。该类启动子通过与NPR1 基因协同作用参与植物对病害的防御作用。具体作用方式为NPR1 寡聚体中的半胱氨酸残基分子间二硫键被水解还原，形成NPR1单体，NPR1单体具完整的核定位序列，使其能够转移到细胞核内并与结合在PR1基因启动子区的TGA类转录因子相互作用，调控PR基因的表达和系统性抗性（SAR）的产生[3-6]。不同TGA成员有2种方式与NPR1互作，第一种是TGA与NPR1直接结合，正向调控PR1基因的表达和抗性的产生，两者结合的强度、保持时间与PR基因表达和抗性产生的强度成正比。如在一些植物体内，在防卫反应启动子被激活的过程中，TGA因子能与激活子序列（as1）或类as1启动子元件相结合，如拟南芥中的PR1。连续扫描结果显示PR1启动子包括2个类as1元件，即LS7和LS5。LS7是INA诱导过程中的正调控元件，而LS5是一个弱的负调控元件。DESPRES等以这些顺式作用元件为探针，进行电泳迁移率改变（EMSA）试验，结果表明，TGA2和TGA4均能与LS7结合，而TGA2还能与LS5相结合。第2种作用方式是TGA在细胞内有类似NPR1单体——寡聚糖的变化，从而增强PR基因的表达，提高抗性[7-9] 。
为了研究TGA2在植物系统获得性抗性中的作用，阐明其作用机制，笔者通过构建PGADT7TGA2，利用酵母双杂交技术寻找与TGA2转录辅助因子作用蛋白，为进一步探究TGA2是否参与NPR1转录复合体的构成，以及在水杨酸信号传导途径中的作用奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1质粒与菌株。大肠杆菌DH5α、酵母菌株AH109、表达载体pGADT7均由湖南农业大学脂肪酸代谢实验室提供。
1.1.2试剂。Yeast Nitrogen Base（购自sigma公司）；PEG4000、LiAc、SD/trp DO supplement（购自clontech）；CarrierDNA、EDTA、Glucose、agar powder、yeast extract peptone、DMSO（均购自欧迈生物）；EasyTaq DNA Polymerase、pEASYBlunt Simple Cloning Kit（均购自全式金公司）；质粒提取Kit、DNA胶回收Kit、DNA Maker（购自Ambiogen公司）。
1.2方法
1.2.1引物设计。根据TAIR上已公布的TGA2基因编码区序列，查找到TGA2基因CDS（其中TGA1长1 107，TGA2长993），参照酵母表达载体pGADT7的表达框及多克隆位点，运用Primer Premier5引物设计软件进行设计。引物序列：TGA1F：5′ TCCCCCCGGGGGGA ATGAATTCGACATCGACACA 3′，TGA1R：5′ CGGGATCCCGCTACGTTGGTTCACGATGTC 3′；TGA2F：5′ TCCCCCCGGGGGGA ATGGCTGATACCAGTCCGAG 3′，TGA2R：5′ CGGGATCCCGTCACTCTCTGGGTCGAGCAAG 3′。
1.2.2PCR扩增。 高保真EasyTaq DNA Polymerase PCR的扩增体系为50 μl，正向引物（10 μmol/L）、反向引物（10 μmol/L）各1 μl，dNTP 4 μl，10×EasyTaq Buffer 5 μl，EasyTaq DNA Polymerase 0.5 μl，模板1 μl，ddH2O 22.5 μl。反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，16 ℃保存，扩增30个循环。
1.2.3pEASY载体连接及大肠杆菌转化。连接反应体系（5 μl）：DNA 4 μl，pEASYBlunt Simple Cloning Vector 1 μl。
1.2.4酵母双杂交载体构建。用BamHI和XmaI对连接pEASY载体的TGA2质粒进行双酶切，酶切体系（20 μl）如下：载体pGADT7 14 μl，Buffer 2 μl，酶1 μl，ddH2O 2 μl，琼脂糖电泳后回收目的基因片段和表达载体片段。T4连接酶连接体系中分别将目的基因片段与表达载体片段连接，转入大肠杆菌。挑取阳性克隆进行PCR验证，并提质粒进行酶切验证。
1.2.5重组质粒转化至酵母AH109菌。
1.2.5.1酵母感受态细胞的制备。接种2～3个AH109单菌落于5 ml YPD中，放置于30 ℃、250 r/min的摇床中培养18 h，然后放于50 ml YPD溶液中扩大培养3 h，至OD值为0.5。 1.2.5.2重组质粒的转化。将重组质粒pGADT7TGA2采取PEG/LiAc法转化至酵母菌AH109，30 ℃恒温培养2～3 d。
2结果与分析
2.1PCR扩增拟南芥TGA2基因以58 ℃为退火温度进行PCR扩增，产物经过1.2%琼脂糖凝胶电泳分离出目的片段，大小与预期一致（图1）。
2.2TGA2全长CDS与TVecor连接使用T4连接酶将切胶回收扩增的目的片段分别与pEASYBlunt Simple Cloning Vector 连接，热激法转化至大肠杆菌DH5α，取菌液涂布于含50 mg/ml的氨苄青霉素LB固体培养基上生长至长出菌落。挑取阳性克隆进行菌落PCR检测，获得转化子。
将菌落PCR检测为阳性的单菌落，接种至含50 mg/ml的氨苄青霉素LB液体培养基中，放置于37 ℃摇床，220 r/min振荡培养过夜。提取质粒，利用BamHI和XmaI进行双酶切验证。挑选验证正确后的克隆测序，测序结果与已公布的拟南芥TGA2基因全长CDS序列一致。
2.3酵母表达载体构建将连接在pMD19T上的TGA2片段与载体pGADT7分别经BamHI、XmaI双酶切后，用T4连接酶连接，构建酵母双杂交表达载体pGADT7TGA2。将连接产物转化大肠杆菌DH5α培养，获得阳性克隆，进行单、双酶切验证，电泳得到一条约1 000 bp的条带（图2），表明载体已经构建成功。用BamHI进行单酶切时出现多条带可能是由于单酶切体系中错误识别碱基序列并进行切割或者由于质粒在大肠杆菌中进行复制时出现碱基突变所致。
2.4重组质粒的酵母菌转化将重组质粒pGADT7TGA2转化至AH109菌株中，涂布于SD/Leu培养基上，28 ℃恒温培养2～3 d，酵母菌生长情况见图3。结果证明重组质粒转化成功。
3小结与讨论
在各种植物防御途径中，SA介导的系统获得性抗性（SAR）已有大量报道，且被认为是植物应对细菌性病害过程中十分关键的机制。SAR过程发生在受感染植株的健康部位中。植物局部组织受到病原菌侵染后，一类可移动的信号分子通过维管系统运输至其他部位并启动相应的免疫应答反应，如激素水平提高、防御基因表达、次级代谢物累积、形态学改变等。水杨酸作为SAR信号途径起始位点中心必不可少的一种信号分子，它介导一大类编码具有抗菌作用的蛋白质的基因表达[10-15]。在水杨酸信号传导途径中，NPR1被证明是必需的一个反式作用因子。水杨酸信号导致细胞内氧化还原电势的改变，NPR1被转运进入到细胞核内，并与一些转录因子相互作用，进而调控防御基因的转录。研究表明，NPR1在SA诱导下与一些转录因子结合，形成转录复合体，以启动下游基因表达。据报道，转录复合体可能包含以下蛋白：SABP、SABP2、SABP3、TGA转录因子，WRKY转录因子。转录因子在植物生长和发育期间的转录水平调控上起着重要作用，指导DNA和蛋白质相互作用，从而调控基因的表达。由于TGA类启动子与基础防御基因PR1、NPR1 作用关系紧密，在抗病研究中的关键性与重要性逐渐显现[8，16-19]。
关键词 AtTGA2；CDS克隆；酵母转化
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）30-10467-02
作者简介何乐（1990- ），女，湖南长沙人，硕士研究生，研究方向：分子抗性。*通讯作者。
TGA转录因子是一类含碱性DNA结合结构域和亮氨酸拉链结构域，可以结合到PR1基因启动子应答性的顺式作用元件。它因含有TGACCG/as1（Activation seguence1）元件而得名[1-2]。该类启动子通过与NPR1 基因协同作用参与植物对病害的防御作用。具体作用方式为NPR1 寡聚体中的半胱氨酸残基分子间二硫键被水解还原，形成NPR1单体，NPR1单体具完整的核定位序列，使其能够转移到细胞核内并与结合在PR1基因启动子区的TGA类转录因子相互作用，调控PR基因的表达和系统性抗性（SAR）的产生[3-6]。不同TGA成员有2种方式与NPR1互作，第一种是TGA与NPR1直接结合，正向调控PR1基因的表达和抗性的产生，两者结合的强度、保持时间与PR基因表达和抗性产生的强度成正比。如在一些植物体内，在防卫反应启动子被激活的过程中，TGA因子能与激活子序列（as1）或类as1启动子元件相结合，如拟南芥中的PR1。连续扫描结果显示PR1启动子包括2个类as1元件，即LS7和LS5。LS7是INA诱导过程中的正调控元件，而LS5是一个弱的负调控元件。DESPRES等以这些顺式作用元件为探针，进行电泳迁移率改变（EMSA）试验，结果表明，TGA2和TGA4均能与LS7结合，而TGA2还能与LS5相结合。第2种作用方式是TGA在细胞内有类似NPR1单体——寡聚糖的变化，从而增强PR基因的表达，提高抗性[7-9] 。
为了研究TGA2在植物系统获得性抗性中的作用，阐明其作用机制，笔者通过构建PGADT7TGA2，利用酵母双杂交技术寻找与TGA2转录辅助因子作用蛋白，为进一步探究TGA2是否参与NPR1转录复合体的构成，以及在水杨酸信号传导途径中的作用奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1质粒与菌株。大肠杆菌DH5α、酵母菌株AH109、表达载体pGADT7均由湖南农业大学脂肪酸代谢实验室提供。
1.1.2试剂。Yeast Nitrogen Base（购自sigma公司）；PEG4000、LiAc、SD/trp DO supplement（购自clontech）；CarrierDNA、EDTA、Glucose、agar powder、yeast extract peptone、DMSO（均购自欧迈生物）；EasyTaq DNA Polymerase、pEASYBlunt Simple Cloning Kit（均购自全式金公司）；质粒提取Kit、DNA胶回收Kit、DNA Maker（购自Ambiogen公司）。
1.2方法
1.2.1引物设计。根据TAIR上已公布的TGA2基因编码区序列，查找到TGA2基因CDS（其中TGA1长1 107，TGA2长993），参照酵母表达载体pGADT7的表达框及多克隆位点，运用Primer Premier5引物设计软件进行设计。引物序列：TGA1F：5′ TCCCCCCGGGGGGA ATGAATTCGACATCGACACA 3′，TGA1R：5′ CGGGATCCCGCTACGTTGGTTCACGATGTC 3′；TGA2F：5′ TCCCCCCGGGGGGA ATGGCTGATACCAGTCCGAG 3′，TGA2R：5′ CGGGATCCCGTCACTCTCTGGGTCGAGCAAG 3′。
1.2.2PCR扩增。 高保真EasyTaq DNA Polymerase PCR的扩增体系为50 μl，正向引物（10 μmol/L）、反向引物（10 μmol/L）各1 μl，dNTP 4 μl，10×EasyTaq Buffer 5 μl，EasyTaq DNA Polymerase 0.5 μl，模板1 μl，ddH2O 22.5 μl。反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，16 ℃保存，扩增30个循环。
1.2.3pEASY载体连接及大肠杆菌转化。连接反应体系（5 μl）：DNA 4 μl，pEASYBlunt Simple Cloning Vector 1 μl。
1.2.4酵母双杂交载体构建。用BamHI和XmaI对连接pEASY载体的TGA2质粒进行双酶切，酶切体系（20 μl）如下：载体pGADT7 14 μl，Buffer 2 μl，酶1 μl，ddH2O 2 μl，琼脂糖电泳后回收目的基因片段和表达载体片段。T4连接酶连接体系中分别将目的基因片段与表达载体片段连接，转入大肠杆菌。挑取阳性克隆进行PCR验证，并提质粒进行酶切验证。
1.2.5重组质粒转化至酵母AH109菌。
1.2.5.1酵母感受态细胞的制备。接种2～3个AH109单菌落于5 ml YPD中，放置于30 ℃、250 r/min的摇床中培养18 h，然后放于50 ml YPD溶液中扩大培养3 h，至OD值为0.5。 1.2.5.2重组质粒的转化。将重组质粒pGADT7TGA2采取PEG/LiAc法转化至酵母菌AH109，30 ℃恒温培养2～3 d。
2结果与分析
2.1PCR扩增拟南芥TGA2基因以58 ℃为退火温度进行PCR扩增，产物经过1.2%琼脂糖凝胶电泳分离出目的片段，大小与预期一致（图1）。
2.2TGA2全长CDS与TVecor连接使用T4连接酶将切胶回收扩增的目的片段分别与pEASYBlunt Simple Cloning Vector 连接，热激法转化至大肠杆菌DH5α，取菌液涂布于含50 mg/ml的氨苄青霉素LB固体培养基上生长至长出菌落。挑取阳性克隆进行菌落PCR检测，获得转化子。
将菌落PCR检测为阳性的单菌落，接种至含50 mg/ml的氨苄青霉素LB液体培养基中，放置于37 ℃摇床，220 r/min振荡培养过夜。提取质粒，利用BamHI和XmaI进行双酶切验证。挑选验证正确后的克隆测序，测序结果与已公布的拟南芥TGA2基因全长CDS序列一致。
2.3酵母表达载体构建将连接在pMD19T上的TGA2片段与载体pGADT7分别经BamHI、XmaI双酶切后，用T4连接酶连接，构建酵母双杂交表达载体pGADT7TGA2。将连接产物转化大肠杆菌DH5α培养，获得阳性克隆，进行单、双酶切验证，电泳得到一条约1 000 bp的条带（图2），表明载体已经构建成功。用BamHI进行单酶切时出现多条带可能是由于单酶切体系中错误识别碱基序列并进行切割或者由于质粒在大肠杆菌中进行复制时出现碱基突变所致。
2.4重组质粒的酵母菌转化将重组质粒pGADT7TGA2转化至AH109菌株中，涂布于SD/Leu培养基上，28 ℃恒温培养2～3 d，酵母菌生长情况见图3。结果证明重组质粒转化成功。
3小结与讨论
在各种植物防御途径中，SA介导的系统获得性抗性（SAR）已有大量报道，且被认为是植物应对细菌性病害过程中十分关键的机制。SAR过程发生在受感染植株的健康部位中。植物局部组织受到病原菌侵染后，一类可移动的信号分子通过维管系统运输至其他部位并启动相应的免疫应答反应，如激素水平提高、防御基因表达、次级代谢物累积、形态学改变等。水杨酸作为SAR信号途径起始位点中心必不可少的一种信号分子，它介导一大类编码具有抗菌作用的蛋白质的基因表达[10-15]。在水杨酸信号传导途径中，NPR1被证明是必需的一个反式作用因子。水杨酸信号导致细胞内氧化还原电势的改变，NPR1被转运进入到细胞核内，并与一些转录因子相互作用，进而调控防御基因的转录。研究表明，NPR1在SA诱导下与一些转录因子结合，形成转录复合体，以启动下游基因表达。据报道，转录复合体可能包含以下蛋白：SABP、SABP2、SABP3、TGA转录因子，WRKY转录因子。转录因子在植物生长和发育期间的转录水平调控上起着重要作用，指导DNA和蛋白质相互作用，从而调控基因的表达。由于TGA类启动子与基础防御基因PR1、NPR1 作用关系紧密，在抗病研究中的关键性与重要性逐渐显现[8，16-19]。