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[摘要]目的 探讨异氟烷（ISO）预处理对脑缺血再灌注（I/R）损伤的影响及其机制。方法 用线栓法构建I/R模型，将50只大鼠随机分为5组：假手术组（A组）、I/R组（B组）、I/R+ISO组（C组）、I/R+ISO+吡咯烷二硫代氨基甲酸铵（PDTC）组（D组）和I/R+ISO+二甲基亚砜（DMSO）组（E组），每组10只。用Longa评分法评估各组大鼠神经功能损伤评分和TMS评分，TTC法检测脑组织梗死面积，TUNEL法检测神经细胞凋亡率，ELISA法检测脑组织中肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β）的含量，Western blot检测脑组织中Bcl-2、Cleaved Caspase-3和NF-κB p65蛋白的表达。结果 与A组相比较，B、C、D和E组的TMS评分、Bcl-2表达水平均明显降低，而神经功能损伤评分、神经细胞凋亡率和脑组织梗死面积、NF-κB p65和Cleaved Caspase-3表达水平、TNF-α和IL-1β含量均明显升高（P<0.05）。与B组相比，C、D和E组以上各指标有不同程度的逆转（P<0.05）。而C组和D组比较、C组与E组比较差异无显著性（P>0.05）。结论 ISO预处理可保护脑I/R损伤，其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路减少神经细胞凋亡和减轻炎症反应有关。
[关键词]再灌注損伤;脑梗死;异氟醚;细胞凋亡;炎症;NF-κB信号通路;大鼠
[中图分类号]R977.6;R364.1
[文献标志码]A
[文章编号]2096-5532（2021）02-0255-05
[ABSTRACT]Objective To investigate the effect and mechanism of isoflurane （ISO） preconditioning on cerebral ischemia/reperfusion （I/R） injury. Methods The suture method was used to establish an I/R model， and 50 rats were randomly divided into sham-operation group （group A）， I/R group （group B）， I/R+ISO group （group C）， I/R+ISO+pyrrolidine dithiocarbamate （PDTC） group （group D）， and I/R+ISO+dimethyl sulfoxide （DMSO） group （group E）， with 10 rats in each group. The Longa scoring method was used to evaluate the neurological deficit score of each group; the TTC method was used to measure brain infarct area; the TUNEL method was used to measure the apoptosis rate of neural cells; the ELISA method was used to measure the content of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-1β （IL-1β） in brain tissue; Western blot was used to measure the protein expression of Bcl-2， cleaved caspase-3， and NF-κB p65 in brain tissue. Results Compared with group A， groups B， C， D， and E had significant reductions in TMS score and the expression level of Bcl-2 and significant increases in neurological deficit score， apoptosis rate of neural cells， brain infarct area， expression levels of NF-κB p65 and cleaved caspase-3， and levels of TNF-α and IL-1β （P<0.05）. Compared with group B， groups C， D， and E had varying degrees of reversal of the above indices （P<0.05）. There were no significant differences between group C and group D and between group C and group E （P>0.05）. Conclusion ISO pretreatment can protect the brain against I/R injury， possibly by inhibiting the NF-κB signaling pathway to reduce neural cell apoptosis and alleviate inflammatory response.
[KEY WORDS]reperfusion injury; brain infarction; isoflurane; apoptosis; inflammation; NF-kappa B signaling pathway; rats 脑缺血再灌注（I/R）损伤是一种由多种因素引起的病理过程，与脑细胞凋亡和炎症反应等密切相关[1-3]。NF-κB信号通路是一种与细胞凋亡和炎症反应关系密切的经典信号传导途径[4-6]。有研究发现，异氟烷（ISO）预处理可通过抑制脑细胞凋亡和减弱炎症反应等机制改善脑I/R损伤[7-8]。但NF-κB信号通路是否与ISO的保护机制有关尚不清楚。因此，本研究旨在探究ISO对I/R损伤的影响以及对NF-κB信号通路的调控作用。本研究利用NF-κB信号通路抑制剂，通过观察ISO对I/R大鼠脑细胞凋亡、炎症反应及NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响，探讨ISO保护脑I/R损伤的作用机制是否与NF-κB信号通路有关。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
SD雄性大鼠（体质量260～300 g，2～3周龄）购于空军军医大学实验动物中心，ISO购于美国Baxter公司。细胞裂解液、硝酸纤维素膜、显影液、定影液和BCA蛋白浓度测定试剂盒购于上海碧云天生物技术研究所，NF-κB p65兔多克隆抗体购于美国MILLIPORE公司，B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）兔多克隆抗体和兔源二抗购于美国Cell Signaling公司。NF-κB信号通路抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸铵（PDTC）购于美国Sigma公司，肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β）ELISA试剂盒购于德国R&D Germany公司。
1.2 实验方法
1.2.1 I/R模型的制备、ISO预处理与实验分组
I/R模型的制备：以腹腔注射30 g/L戊巴比妥钠的方法麻醉大鼠，固定大鼠去除颈前毛，并以体积分数0.75乙醇溶液对颈部皮肤进行消毒。在颈正中做切口，分离右侧颈总动脉以及颈内外动脉，将尼龙线栓（直径0.38 mm）从颈外动脉残端插入颈内动脉（约长20 mm）直至有阻力感。在缺血90 min后，拔出线栓，进行再灌注24 h。I/R大鼠模型制备成功的判断参照LONGA等[9]的标准。预处理方法：ISO组在I/R前进行ISO预处理，将大鼠置于自制密闭的实验舱中，头端分别连接进气孔和连接麻醉气体监测仪。维持箱内温度35～37 ℃，经麻醉机输送体积分数0.015的ISO气体至实验舱内，并调节氧体积分数为0.70左右，逐渐升高麻醉气体浓度，根据Datex气体检测仪调节实验舱内ISO浓度为体积分数0.015时，维持以上浓度稳定15 min后放入大鼠进行预处理。连续5 d吸入体积分数0.015的ISO气体，每天1 h。吸入ISO气体过程中分别监测脉搏氧分压（SpO2）和脉率。末次预处理24 h后行I/R。
实验分组：将50只大鼠随机分为5组，每组10只。①假手术组（A组）：分离血管后不插入线栓。②I/R组（B组）：参照I/R模型的制备方法制备脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）大鼠模型，在缺血90 min后再灌注。③I/R+ISO组（C组）：在缺血前60 min给予体积分数0.02的ISO诱导30 min，之后行I/R。④I/R+ISO+PDTC组（D组）：缺血前60 min给予体积分数0.02的ISO诱导30 min，并于侧脑注射10 μL的NF-κB信号通路特异性抑制剂PDTC（以二甲基亚砜（DMSO）溶解，0.3 mg/kg），然后再行I/R。⑤I/R+ISO+DMSO組（E组）：缺血前60 min给予体积分数0.02的ISO诱导30 min，并于侧脑注射10 μL的DMSO，再行I/R。
1.2.2 神经功能损伤和TMS评分 采用Longa评分法对缺血再灌注后24 h的各组大鼠进行神经功能评估。神经功能损伤评分：无神经损伤记为0分，左前肢出现伸展障碍记为1分，向左打圈记为2分，行走时向左侧倾斜记为3分，意识昏迷记为4分，死亡记为5分;评分越高神经功能损伤程度越严重。TMS评分：各组大鼠在再灌注后2 h进行TMS评分，参照LONGA等[9]报道的方法对大鼠抓屏、抓绳和平衡木等3个项目的检测，评分越高表明神经运动功能越好。
1.2.3 TTC法检测梗死面积 在各组大鼠处理结束后，脱臼处死大鼠。取脑组织，并做厚度为2 mm的冠状组织切片，以10 g/L的TC溶液染色15～20 min，其中呈红色的为正常脑组织，呈白色的为梗死区域脑组织。以40 g/L多聚甲醛进行固定。采用Image-Pro Plus 6.0软件对染色切片进行分析。梗死面积（%）=白色区域面积/（白色区域面积+红色区域面积）×100%。
1.2.4 TUNEL法检测神经细胞凋亡 采用40 g/L多聚甲醛对各组大鼠脑组织固定后，以石蜡进行包埋切片。根据TUNEL试剂盒说明书步骤进行染色。其中，呈绿色荧光的为阳性细胞。在400倍光镜下随机选取5个视野统计阳性细胞数，以阳性细胞数与总细胞数的比值表示神经细胞的凋亡率。
1.2.5 Western blot检测海马组织中NF-κB p65、Bcl-2和Cleaved Caspase-3蛋白的表达 向各组脑组织匀浆中加入细胞裂解液提取总蛋白，经BCA法定量总蛋白后，将蛋白样品上样至SDS-PAGE凝胶中进行电泳。待完全分离后，结束电泳。恒流转至硝酸纤维素膜后，加入1∶1 000的特异性一抗（NF-κB p65、Bcl-2和Cleaved Caspase-3）4 ℃下孵育2 h。次日，加入1∶2 000的辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育2 h。暗室内显影曝光后，以GAPDH为对照，采用凝胶成像系统扫描分析。
1.2.6 ELISA法检测脑组织中TNF-α和IL-1β的含量 取各组大鼠的脑组织制备匀浆，严格参照ELISA试剂盒说明书步骤检测各组大鼠脑组织中TNF-α和IL-1β的含量。 1.3 统计学处理
采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量资料数据以x2±s形式表示，多组组间数据比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 各组神经功能的比较
与假手术组比较，其余4组的神经功能损伤评分明显升高，而TMS评分明显降低（F=38.626、404.130，P<0.05）;与I/R组相比，I/R+ISO组、I/R+ISO+PDTC组和I/R+ISO+DMSO组的神经功能损伤评分均明显降低，而TMS评分明显升高（q=7.776～15.231，P<0.05）;与I/R+ISO组相比，I/R+ISO+PDTC组的神经功能损伤评分明显降低，而TMS评分明显升高（q=4.030、12.124，P<0.05），但I/R+ISO+DMSO组无显著差异（q=0.403、0.501，P>0.05）。见表1。
2.2 各组大鼠神经细胞凋亡率与脑组织梗死面积的比较
I/R组、I/R+ISO组、I/R+ISO+PDTC组和I/R+ISO+DMSO组大鼠神经细胞凋亡率和脑组织梗死面积较假手术组均明显升高（F=111.952、272.910，P<0.05）。I/R+ISO组、I/R+ISO+PDTC组和I/R+ISO+DMSO组大鼠神经细胞凋亡率和脑组织梗死面积较I/R组均明显降低（q=11.361～19.237，P<0.05）;并且，I/R+ISO+PDTC组明显低于I/R+ISO组（q=5.248、9.211，P<0.05），而I/R+ISO+DMSO组与I/R+ISO组比较差异无显著意义（q=1.040、1.348，P>0.05）。见表2。
2.3 各组大鼠海马组织中NF-κB p65、Bcl-2以及Cleaved Caspase-3蛋白表达的比较
与假手术组大鼠相比，其余4组中NF-κB p65和Cleaved Caspase-3蛋白的表达水平均明显升高，而Bcl-2蛋白的表达水平均明显降低（F=43.929～114.750，P<0.05）。同时，与I/R组相比，除假手术组外的另外3组中NF-κB p65和Cleaved Caspase-3蛋白表达明显降低，Bcl-2蛋白表达明显升高（q=9.192～12.328，P<0.05）;并且，在I/R+ISO+PDTC组中上述变化幅度明显小于I/R+ISO组（q=5.527～9.900，P<0.05），而I/R+ISO组与I/R+ISO+DMSO组无显著差异（q=0.850～1.414，P>0.05）。见图1和表3。
2.4 各组大鼠脑组织中炎症因子TNF-α和IL-1β含量的比较
与假手术组相比，其余4组中TNF-α和IL-1β含量均明显升高（F=20.613、30.197，P<0.05）。I/R+ISO组、I/R+ISO+PDTC组和I/R+ISO+DMSO组中TNF-α和IL-1β含量较I/R组均明显降低（q=5.244～7.381，P<0.05）。同时，I/R+ISO+PDTC组明显低于I/R+ISO组（q=3.580、3.628，P<0.05），而I/R+ISO+DMSO组与I/R+ISO组比较差异无显著性（q=0.218、0.636，P>0.05）。见表4。
3 讨 论
在I/R过程中，中性粒细胞和内皮细胞等可通过释放TNF-α、IL-1β等炎症因子启动炎症反应的发生，加重细胞损伤，而炎症因子的释放受多种信号通路调控[10-13]。另外，神经细胞凋亡是导致脑I/R损伤的重要环节，而信号转导是介导细胞凋亡启动的重要前提[14-15]。因此，寻找有效抑制細胞凋亡和改善炎症反应的信号靶点对减轻脑I/R损伤具有重要意义。
众所周知，NF-κB是广泛存在于细胞内的多效核转录因子，p65是其重要的功能性亚单位，翻译后修饰能够精细地激活NF-κB信号通路，进而调控多种细胞基因，参与细胞的增殖、迁移、凋亡、炎症和免疫反应等过程[16-17]。目前多项研究显示，NF-κB与中枢神经系统疾病、肿瘤和心血管疾病等多种疾病的发生发展密切相关[18-20]，是多种药物介入方面潜在的靶标。
ISO是一种挥发性麻醉剂，一项研究证实ISO预处理可通过激活Akt/mTOR/s6K信号通路减轻I/R损伤诱导的神经功能缺损、梗死体积、脑水肿和细胞凋亡等[7]。PENG等[21]指出，ISO通过TGF-β2/Smad3信号通路增强VEGF和CD34的活化来减轻I/R损伤。此外，ISO还能够有效缓解大鼠脑I/R损伤[22]。ZHAO等[23]研究结果显示，在脑I/R损伤后大鼠脑组织中NF-κB信号通路被激活，脑梗死体积增大和病理改变加重，神经功能障碍明显，而
抑制NF-κB信号通路后，大鼠脑I/R损伤可明显减轻。ZHANG等[24]研究显示，脂联素通过抑制海马中的P38-MAPK信号通路来改善ISO引起的老年大鼠认知功能障碍。另一项研究显示，ISO诱导CUMS小鼠中BDNF-TrkB信号传导产生抗抑郁作用[25]。以上研究提示，ISO能够调控不同信号通路在多种疾病中发挥作用。
本研究通过构建I/R损伤大鼠模型，ISO预处理后I/R损伤大鼠TMS评分、Bcl-2表达水平均明显升高，而神经功能损伤评分、神经细胞凋亡率和脑组织梗死面积、NF-κB p65和Cleaved Caspase-3表达水平、TNF-α和IL-1β含量均明显降低。Bcl-2是公认的抑凋亡基因，Caspase-3是凋亡的关键执行因子，活化的Caspase-3以Cleaved Caspase-3形式存在;两者均在脑I/R损伤的细胞凋亡过程中发挥着重要作用[26-27]。本文结果提示，ISO预处理可通过抑制神经细胞凋亡和减弱炎症反应以发挥保护脑I/R损伤的作用。而以NF-κB信号通路抑制剂PDTC作用后，I/R损伤大鼠的TMS评分、Bcl-2表达水平均进一步升高，而神经功能损伤评分、神经细胞凋亡率和脑组织梗死面积、NF-κB p65和Cleaved Caspase-3表达水平、TNF-α和IL-1β含量进一步降低。本文研究结果表明，ISO对脑I/R损伤的保护作用进一步增强。提示，ISO可通过抑制NF-κB信号通路减少神经细胞凋亡和减轻炎症反应，进而减轻脑I/R损伤发挥神经保护作用。 綜上所述，NF-κB信号通路在脑I/R损伤过程中发挥着重要作用，ISO预处理可通过抑制其激活抑制神经细胞凋亡和炎症反应来减轻脑I/R损伤。本研究为脑I/R损伤发病机制的深入研究提供实验依据，并为ISO用于脑I/R损伤治疗提供一定的理论基础。然而，本实验未涉及ISO是否调控其他信号通路尚显不足，后续研究将对此进行补充和完善，且大鼠体内实验与临床试验也有一定差距，ISO用于脑I/R损伤治疗仍然需要大量的研究。
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（本文編辑 于国艺）
[关键词]再灌注損伤;脑梗死;异氟醚;细胞凋亡;炎症;NF-κB信号通路;大鼠
[中图分类号]R977.6;R364.1
[文献标志码]A
[文章编号]2096-5532（2021）02-0255-05
[ABSTRACT]Objective To investigate the effect and mechanism of isoflurane （ISO） preconditioning on cerebral ischemia/reperfusion （I/R） injury. Methods The suture method was used to establish an I/R model， and 50 rats were randomly divided into sham-operation group （group A）， I/R group （group B）， I/R+ISO group （group C）， I/R+ISO+pyrrolidine dithiocarbamate （PDTC） group （group D）， and I/R+ISO+dimethyl sulfoxide （DMSO） group （group E）， with 10 rats in each group. The Longa scoring method was used to evaluate the neurological deficit score of each group; the TTC method was used to measure brain infarct area; the TUNEL method was used to measure the apoptosis rate of neural cells; the ELISA method was used to measure the content of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-1β （IL-1β） in brain tissue; Western blot was used to measure the protein expression of Bcl-2， cleaved caspase-3， and NF-κB p65 in brain tissue. Results Compared with group A， groups B， C， D， and E had significant reductions in TMS score and the expression level of Bcl-2 and significant increases in neurological deficit score， apoptosis rate of neural cells， brain infarct area， expression levels of NF-κB p65 and cleaved caspase-3， and levels of TNF-α and IL-1β （P<0.05）. Compared with group B， groups C， D， and E had varying degrees of reversal of the above indices （P<0.05）. There were no significant differences between group C and group D and between group C and group E （P>0.05）. Conclusion ISO pretreatment can protect the brain against I/R injury， possibly by inhibiting the NF-κB signaling pathway to reduce neural cell apoptosis and alleviate inflammatory response.
[KEY WORDS]reperfusion injury; brain infarction; isoflurane; apoptosis; inflammation; NF-kappa B signaling pathway; rats 脑缺血再灌注（I/R）损伤是一种由多种因素引起的病理过程，与脑细胞凋亡和炎症反应等密切相关[1-3]。NF-κB信号通路是一种与细胞凋亡和炎症反应关系密切的经典信号传导途径[4-6]。有研究发现，异氟烷（ISO）预处理可通过抑制脑细胞凋亡和减弱炎症反应等机制改善脑I/R损伤[7-8]。但NF-κB信号通路是否与ISO的保护机制有关尚不清楚。因此，本研究旨在探究ISO对I/R损伤的影响以及对NF-κB信号通路的调控作用。本研究利用NF-κB信号通路抑制剂，通过观察ISO对I/R大鼠脑细胞凋亡、炎症反应及NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响，探讨ISO保护脑I/R损伤的作用机制是否与NF-κB信号通路有关。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
SD雄性大鼠（体质量260～300 g，2～3周龄）购于空军军医大学实验动物中心，ISO购于美国Baxter公司。细胞裂解液、硝酸纤维素膜、显影液、定影液和BCA蛋白浓度测定试剂盒购于上海碧云天生物技术研究所，NF-κB p65兔多克隆抗体购于美国MILLIPORE公司，B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）兔多克隆抗体和兔源二抗购于美国Cell Signaling公司。NF-κB信号通路抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸铵（PDTC）购于美国Sigma公司，肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β）ELISA试剂盒购于德国R&D Germany公司。
1.2 实验方法
1.2.1 I/R模型的制备、ISO预处理与实验分组
I/R模型的制备：以腹腔注射30 g/L戊巴比妥钠的方法麻醉大鼠，固定大鼠去除颈前毛，并以体积分数0.75乙醇溶液对颈部皮肤进行消毒。在颈正中做切口，分离右侧颈总动脉以及颈内外动脉，将尼龙线栓（直径0.38 mm）从颈外动脉残端插入颈内动脉（约长20 mm）直至有阻力感。在缺血90 min后，拔出线栓，进行再灌注24 h。I/R大鼠模型制备成功的判断参照LONGA等[9]的标准。预处理方法：ISO组在I/R前进行ISO预处理，将大鼠置于自制密闭的实验舱中，头端分别连接进气孔和连接麻醉气体监测仪。维持箱内温度35～37 ℃，经麻醉机输送体积分数0.015的ISO气体至实验舱内，并调节氧体积分数为0.70左右，逐渐升高麻醉气体浓度，根据Datex气体检测仪调节实验舱内ISO浓度为体积分数0.015时，维持以上浓度稳定15 min后放入大鼠进行预处理。连续5 d吸入体积分数0.015的ISO气体，每天1 h。吸入ISO气体过程中分别监测脉搏氧分压（SpO2）和脉率。末次预处理24 h后行I/R。
实验分组：将50只大鼠随机分为5组，每组10只。①假手术组（A组）：分离血管后不插入线栓。②I/R组（B组）：参照I/R模型的制备方法制备脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）大鼠模型，在缺血90 min后再灌注。③I/R+ISO组（C组）：在缺血前60 min给予体积分数0.02的ISO诱导30 min，之后行I/R。④I/R+ISO+PDTC组（D组）：缺血前60 min给予体积分数0.02的ISO诱导30 min，并于侧脑注射10 μL的NF-κB信号通路特异性抑制剂PDTC（以二甲基亚砜（DMSO）溶解，0.3 mg/kg），然后再行I/R。⑤I/R+ISO+DMSO組（E组）：缺血前60 min给予体积分数0.02的ISO诱导30 min，并于侧脑注射10 μL的DMSO，再行I/R。
1.2.2 神经功能损伤和TMS评分 采用Longa评分法对缺血再灌注后24 h的各组大鼠进行神经功能评估。神经功能损伤评分：无神经损伤记为0分，左前肢出现伸展障碍记为1分，向左打圈记为2分，行走时向左侧倾斜记为3分，意识昏迷记为4分，死亡记为5分;评分越高神经功能损伤程度越严重。TMS评分：各组大鼠在再灌注后2 h进行TMS评分，参照LONGA等[9]报道的方法对大鼠抓屏、抓绳和平衡木等3个项目的检测，评分越高表明神经运动功能越好。
1.2.3 TTC法检测梗死面积 在各组大鼠处理结束后，脱臼处死大鼠。取脑组织，并做厚度为2 mm的冠状组织切片，以10 g/L的TC溶液染色15～20 min，其中呈红色的为正常脑组织，呈白色的为梗死区域脑组织。以40 g/L多聚甲醛进行固定。采用Image-Pro Plus 6.0软件对染色切片进行分析。梗死面积（%）=白色区域面积/（白色区域面积+红色区域面积）×100%。
1.2.4 TUNEL法检测神经细胞凋亡 采用40 g/L多聚甲醛对各组大鼠脑组织固定后，以石蜡进行包埋切片。根据TUNEL试剂盒说明书步骤进行染色。其中，呈绿色荧光的为阳性细胞。在400倍光镜下随机选取5个视野统计阳性细胞数，以阳性细胞数与总细胞数的比值表示神经细胞的凋亡率。
1.2.5 Western blot检测海马组织中NF-κB p65、Bcl-2和Cleaved Caspase-3蛋白的表达 向各组脑组织匀浆中加入细胞裂解液提取总蛋白，经BCA法定量总蛋白后，将蛋白样品上样至SDS-PAGE凝胶中进行电泳。待完全分离后，结束电泳。恒流转至硝酸纤维素膜后，加入1∶1 000的特异性一抗（NF-κB p65、Bcl-2和Cleaved Caspase-3）4 ℃下孵育2 h。次日，加入1∶2 000的辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育2 h。暗室内显影曝光后，以GAPDH为对照，采用凝胶成像系统扫描分析。
1.2.6 ELISA法检测脑组织中TNF-α和IL-1β的含量 取各组大鼠的脑组织制备匀浆，严格参照ELISA试剂盒说明书步骤检测各组大鼠脑组织中TNF-α和IL-1β的含量。 1.3 统计学处理
采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量资料数据以x2±s形式表示，多组组间数据比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 各组神经功能的比较
与假手术组比较，其余4组的神经功能损伤评分明显升高，而TMS评分明显降低（F=38.626、404.130，P<0.05）;与I/R组相比，I/R+ISO组、I/R+ISO+PDTC组和I/R+ISO+DMSO组的神经功能损伤评分均明显降低，而TMS评分明显升高（q=7.776～15.231，P<0.05）;与I/R+ISO组相比，I/R+ISO+PDTC组的神经功能损伤评分明显降低，而TMS评分明显升高（q=4.030、12.124，P<0.05），但I/R+ISO+DMSO组无显著差异（q=0.403、0.501，P>0.05）。见表1。
2.2 各组大鼠神经细胞凋亡率与脑组织梗死面积的比较
I/R组、I/R+ISO组、I/R+ISO+PDTC组和I/R+ISO+DMSO组大鼠神经细胞凋亡率和脑组织梗死面积较假手术组均明显升高（F=111.952、272.910，P<0.05）。I/R+ISO组、I/R+ISO+PDTC组和I/R+ISO+DMSO组大鼠神经细胞凋亡率和脑组织梗死面积较I/R组均明显降低（q=11.361～19.237，P<0.05）;并且，I/R+ISO+PDTC组明显低于I/R+ISO组（q=5.248、9.211，P<0.05），而I/R+ISO+DMSO组与I/R+ISO组比较差异无显著意义（q=1.040、1.348，P>0.05）。见表2。
2.3 各组大鼠海马组织中NF-κB p65、Bcl-2以及Cleaved Caspase-3蛋白表达的比较
与假手术组大鼠相比，其余4组中NF-κB p65和Cleaved Caspase-3蛋白的表达水平均明显升高，而Bcl-2蛋白的表达水平均明显降低（F=43.929～114.750，P<0.05）。同时，与I/R组相比，除假手术组外的另外3组中NF-κB p65和Cleaved Caspase-3蛋白表达明显降低，Bcl-2蛋白表达明显升高（q=9.192～12.328，P<0.05）;并且，在I/R+ISO+PDTC组中上述变化幅度明显小于I/R+ISO组（q=5.527～9.900，P<0.05），而I/R+ISO组与I/R+ISO+DMSO组无显著差异（q=0.850～1.414，P>0.05）。见图1和表3。
2.4 各组大鼠脑组织中炎症因子TNF-α和IL-1β含量的比较
与假手术组相比，其余4组中TNF-α和IL-1β含量均明显升高（F=20.613、30.197，P<0.05）。I/R+ISO组、I/R+ISO+PDTC组和I/R+ISO+DMSO组中TNF-α和IL-1β含量较I/R组均明显降低（q=5.244～7.381，P<0.05）。同时，I/R+ISO+PDTC组明显低于I/R+ISO组（q=3.580、3.628，P<0.05），而I/R+ISO+DMSO组与I/R+ISO组比较差异无显著性（q=0.218、0.636，P>0.05）。见表4。
3 讨 论
在I/R过程中，中性粒细胞和内皮细胞等可通过释放TNF-α、IL-1β等炎症因子启动炎症反应的发生，加重细胞损伤，而炎症因子的释放受多种信号通路调控[10-13]。另外，神经细胞凋亡是导致脑I/R损伤的重要环节，而信号转导是介导细胞凋亡启动的重要前提[14-15]。因此，寻找有效抑制細胞凋亡和改善炎症反应的信号靶点对减轻脑I/R损伤具有重要意义。
众所周知，NF-κB是广泛存在于细胞内的多效核转录因子，p65是其重要的功能性亚单位，翻译后修饰能够精细地激活NF-κB信号通路，进而调控多种细胞基因，参与细胞的增殖、迁移、凋亡、炎症和免疫反应等过程[16-17]。目前多项研究显示，NF-κB与中枢神经系统疾病、肿瘤和心血管疾病等多种疾病的发生发展密切相关[18-20]，是多种药物介入方面潜在的靶标。
ISO是一种挥发性麻醉剂，一项研究证实ISO预处理可通过激活Akt/mTOR/s6K信号通路减轻I/R损伤诱导的神经功能缺损、梗死体积、脑水肿和细胞凋亡等[7]。PENG等[21]指出，ISO通过TGF-β2/Smad3信号通路增强VEGF和CD34的活化来减轻I/R损伤。此外，ISO还能够有效缓解大鼠脑I/R损伤[22]。ZHAO等[23]研究结果显示，在脑I/R损伤后大鼠脑组织中NF-κB信号通路被激活，脑梗死体积增大和病理改变加重，神经功能障碍明显，而
抑制NF-κB信号通路后，大鼠脑I/R损伤可明显减轻。ZHANG等[24]研究显示，脂联素通过抑制海马中的P38-MAPK信号通路来改善ISO引起的老年大鼠认知功能障碍。另一项研究显示，ISO诱导CUMS小鼠中BDNF-TrkB信号传导产生抗抑郁作用[25]。以上研究提示，ISO能够调控不同信号通路在多种疾病中发挥作用。
本研究通过构建I/R损伤大鼠模型，ISO预处理后I/R损伤大鼠TMS评分、Bcl-2表达水平均明显升高，而神经功能损伤评分、神经细胞凋亡率和脑组织梗死面积、NF-κB p65和Cleaved Caspase-3表达水平、TNF-α和IL-1β含量均明显降低。Bcl-2是公认的抑凋亡基因，Caspase-3是凋亡的关键执行因子，活化的Caspase-3以Cleaved Caspase-3形式存在;两者均在脑I/R损伤的细胞凋亡过程中发挥着重要作用[26-27]。本文结果提示，ISO预处理可通过抑制神经细胞凋亡和减弱炎症反应以发挥保护脑I/R损伤的作用。而以NF-κB信号通路抑制剂PDTC作用后，I/R损伤大鼠的TMS评分、Bcl-2表达水平均进一步升高，而神经功能损伤评分、神经细胞凋亡率和脑组织梗死面积、NF-κB p65和Cleaved Caspase-3表达水平、TNF-α和IL-1β含量进一步降低。本文研究结果表明，ISO对脑I/R损伤的保护作用进一步增强。提示，ISO可通过抑制NF-κB信号通路减少神经细胞凋亡和减轻炎症反应，进而减轻脑I/R损伤发挥神经保护作用。 綜上所述，NF-κB信号通路在脑I/R损伤过程中发挥着重要作用，ISO预处理可通过抑制其激活抑制神经细胞凋亡和炎症反应来减轻脑I/R损伤。本研究为脑I/R损伤发病机制的深入研究提供实验依据，并为ISO用于脑I/R损伤治疗提供一定的理论基础。然而，本实验未涉及ISO是否调控其他信号通路尚显不足，后续研究将对此进行补充和完善，且大鼠体内实验与临床试验也有一定差距，ISO用于脑I/R损伤治疗仍然需要大量的研究。
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（本文編辑 于国艺）