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摘要：探讨高温预处理与不同强度的一次性急性运动共同干预下所诱导的热休克蛋白70，对大鼠海马区自由基以及钙ATP酶的影响。将3月龄SD大鼠48只，分为室温安静组、室温15 m/min运动组、室温27 m/min运动组，高温安静组、高温15 m/min运动组和高温27 m/min运动组等6组，每组8只。高温组大鼠经高温预处理24 h后，与其他运动组进行一次性急性运动60 min后即刻取材检测海马区热休克蛋白Hsp70、丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶SOD、Ca2 -ATPase活性。结果发现室温27 m/min运动组较之室温安静组，其大鼠海马区Hsp70的表达水平明显升高(P<0.05)；高温预处理各组的Hsp70表达水平，显著高于室温各组(P<0.05)；与室温运动组比较，高温预处理运动组海马SOD的活性提高极明显(P<0.01)；各高温组MDA含量随运动强度增大而降低，但组间差异无显著性(P>0.05)；高温预处理各组Ca2 -ATPase活性均显著高于室温各组(P<0.05)。结果说明：高温预处理诱导Hsp70的大量表达可提高运动时海马的SOD活性，降低MDA含量，提高Ca2 -ATPase活性。提示Hsp70可能通过提高抗氧化能力，以减少自由基对海马区的损害，对神经系统具有一定的保护意义。
关键词：运动生物化学；热激蛋白70；高温预处理；海马区；自由基；Ca2 -ATP酶；大鼠
中图分类号：G804.2文献标识码：A文章编号：1006-7116(2012)03-0140-05
当细胞暴露于约比正常生长温度高5 ℃的亚致死温度后，可诱导Hsp70等热激蛋白(The heat shock proteins，HSPs)一类高度保守的保护性蛋白大量表达[1]，使细胞获得更高的热耐受力(Thermotolerance)[2]。除热应激外，细胞也对诸如自由基、缺血、低氧、重金属和细胞毒素等其他应激产生交叉耐受现象(Cross-tolerance)[3]，以减轻受不良环境胁迫所引起的伤害。中枢神经系统的海马区，是与情绪、认知、学习记忆密切相关的关键脑区，对应激变化甚为敏感。运动作为一种应激源，大强度急性运动产生的大量氧自由基是运动机体神经组织损伤的主要原因之一。此外，神经元钙超载是导致神经细胞信号传导异常的主要因素，是脑细胞死亡的中心环节。高温预处理和急性运动的双重干预，对大脑海马区是否产生交叉耐受，进而对神经组织产生保护作用，目前的研究尚没有明确结论。因此，本实验旨在通过预热处理后进行不同强度的一次性急性运动，观察Hsp70的表达对海马区自由基代谢与Ca2 -ATPase的影响，以探讨高温预处理与一次性急性运动对神经系统区的神经保护作用，为科学训练提供新的方法和实验依据。
1材料与方法
1.1实验动物
雄性SD大鼠50只，3月龄，体重300～350 g，SPF级，购自广州中医药大学实验中心，合格证：SCXK(粤)2008-0020。动物购入后适应性饲养1周。室温(22±2) ℃，湿度(60±5) %。昼夜12 h/d节律变化，自由饮食，灭菌水饲养，饲料为标准啮齿类饲料。
1.2实验训练与分组
大鼠进行为期1周的适应性跑台训练，坡度为0°，跑速为10 m/min，1 d/次，每次8 min。训练结束后剔除不合格的大鼠，再随机分6组：室温安静组、室温15 m/min运动组(NS15)、室温27 m/min运动组(NS27)；高温安静组(HS)、高温15 m/min运动组(HS15)、高温27 m/min运动组(HS27)，每组8只，共48只，运动时间为1 h。按Bedford[4]方法改进运动方案：坡度0°，跑速15 m/min，为(50~60)%VO2max中等运动强度；跑速27 m/min，为80%~90% VO2max大运动强度。
1.3高温预处理模型与取材
高温预处理方案：用质量分数为1％戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，将大鼠置于恒温箱(45℃)中，监测肛温升至(42±0.5) ℃并持续15 min。再将大鼠置于室温环境，恢复至正常体温。高温安静组经热预处理24 h后麻醉取材。高温运动组则经热预处理24 h后，与其他运动组大鼠运动1 h，运动后即刻麻醉取材。室温安静组只需麻醉至自行苏醒24 h后再麻醉取材。每只大鼠分离、称取双侧海马0.12 g。经4 ℃预冷的生理盐水清洗，滤纸吸干后锡纸包裹，液氮速冻，于-80 ℃超低温冰箱冻存备用。
1.4主要试剂和实验仪器
鼠抗人Hsp70(小鼠IgG，抗Hsc73和Hsp72)、HRP标记的羊抗鼠IgG(均购自Sigma)，考马斯亮兰蛋白测定试剂盒、Ca2 -ATPase试剂盒、SOD试剂盒、MDA试剂盒(均购自南京建成生物工程公司)，SDS凝胶配制试剂盒(购自Sigma)、转染蛋白分子量标准(碧云天生物技术研究所)。
垂直平板电泳仪(Apollo，美国)、半干印迹转移槽(OWL，英国)、凝胶成相分析系统(GeneGenius，英国)、超低温冰箱(Therm Forma 725，美国)、722紫外分光光度计(上海精工仪器有限公司)。
1.5测试指标与方法
1)测定大鼠海马区Hsp70。
(1)大鼠海马区蛋白质的提取。准确称取海马组织0.03 g，用预冷的PBS缓冲液洗涤，5 000 r/min离心5 min。弃上清液，加入约10倍沉淀物体积的RIPA细胞裂解液(使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1 mmol/L)，充分匀浆，直至细胞彻底裂解。再10 000 r/min离心5 min，取上清液，置于-20 ℃冰箱待测。
(2)Western blotting测定Hsp70。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(分离胶10%，浓缩胶5%)分离蛋白质。电泳2 h完毕后，取出凝胶转膜行电转移，0.8 mA/cm2，3 h。再取出硝酸纤维膜，用TBS清洗2次，然后置于封闭液(含20 mL 15% BSA的TBS)中，室温下封闭2 h。弃封闭液，用TBS洗膜3次，每次10 min，加入一抗，鼠抗人Hsp70抗体稀释(为体积比1︰700)，于脱色摇床上温和摇动孵育过夜。弃一抗溶液，用TBS洗膜2次，每次10 min，再加入羊抗鼠二抗稀释(为体积比1︰800)，孵育2 h。弃二抗溶液，用TBS洗膜3次，每次10 min。弃TBS，DAB显色，室温显色15 min，再用双蒸水洗膜终止显色。采用GeneGenius系列的Syngene凝胶成像分析系统分析Hsp70 水平，以积分光密度表示蛋白表达量，测试灰度值。
2)大鼠海马区SOD、MDA和Ca2 -ATPase的测试。
准确称取海马组织0.09 g，迅速剪碎后放入玻璃匀浆器中，加入约10倍组织体积的预冷生理盐水进行匀浆。将制备好的10%匀浆液进行离心(3 000 r/min，15 min)，取上清液用于指标测定。SOD、MDA和Ca2 -ATPase的测试，测定过程严格按照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书进行操作。其中SOD活性采用酶标法进行检测、MDA含量采用TBA法测定、Ca2 -ATPase采用比色法测定其酶活力。
关键词：运动生物化学；热激蛋白70；高温预处理；海马区；自由基；Ca2 -ATP酶；大鼠
中图分类号：G804.2文献标识码：A文章编号：1006-7116(2012)03-0140-05
当细胞暴露于约比正常生长温度高5 ℃的亚致死温度后，可诱导Hsp70等热激蛋白(The heat shock proteins，HSPs)一类高度保守的保护性蛋白大量表达[1]，使细胞获得更高的热耐受力(Thermotolerance)[2]。除热应激外，细胞也对诸如自由基、缺血、低氧、重金属和细胞毒素等其他应激产生交叉耐受现象(Cross-tolerance)[3]，以减轻受不良环境胁迫所引起的伤害。中枢神经系统的海马区，是与情绪、认知、学习记忆密切相关的关键脑区，对应激变化甚为敏感。运动作为一种应激源，大强度急性运动产生的大量氧自由基是运动机体神经组织损伤的主要原因之一。此外，神经元钙超载是导致神经细胞信号传导异常的主要因素，是脑细胞死亡的中心环节。高温预处理和急性运动的双重干预，对大脑海马区是否产生交叉耐受，进而对神经组织产生保护作用，目前的研究尚没有明确结论。因此，本实验旨在通过预热处理后进行不同强度的一次性急性运动，观察Hsp70的表达对海马区自由基代谢与Ca2 -ATPase的影响，以探讨高温预处理与一次性急性运动对神经系统区的神经保护作用，为科学训练提供新的方法和实验依据。
1材料与方法
1.1实验动物
雄性SD大鼠50只，3月龄，体重300～350 g，SPF级，购自广州中医药大学实验中心，合格证：SCXK(粤)2008-0020。动物购入后适应性饲养1周。室温(22±2) ℃，湿度(60±5) %。昼夜12 h/d节律变化，自由饮食，灭菌水饲养，饲料为标准啮齿类饲料。
1.2实验训练与分组
大鼠进行为期1周的适应性跑台训练，坡度为0°，跑速为10 m/min，1 d/次，每次8 min。训练结束后剔除不合格的大鼠，再随机分6组：室温安静组、室温15 m/min运动组(NS15)、室温27 m/min运动组(NS27)；高温安静组(HS)、高温15 m/min运动组(HS15)、高温27 m/min运动组(HS27)，每组8只，共48只，运动时间为1 h。按Bedford[4]方法改进运动方案：坡度0°，跑速15 m/min，为(50~60)%VO2max中等运动强度；跑速27 m/min，为80%~90% VO2max大运动强度。
1.3高温预处理模型与取材
高温预处理方案：用质量分数为1％戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，将大鼠置于恒温箱(45℃)中，监测肛温升至(42±0.5) ℃并持续15 min。再将大鼠置于室温环境，恢复至正常体温。高温安静组经热预处理24 h后麻醉取材。高温运动组则经热预处理24 h后，与其他运动组大鼠运动1 h，运动后即刻麻醉取材。室温安静组只需麻醉至自行苏醒24 h后再麻醉取材。每只大鼠分离、称取双侧海马0.12 g。经4 ℃预冷的生理盐水清洗，滤纸吸干后锡纸包裹，液氮速冻，于-80 ℃超低温冰箱冻存备用。
1.4主要试剂和实验仪器
鼠抗人Hsp70(小鼠IgG，抗Hsc73和Hsp72)、HRP标记的羊抗鼠IgG(均购自Sigma)，考马斯亮兰蛋白测定试剂盒、Ca2 -ATPase试剂盒、SOD试剂盒、MDA试剂盒(均购自南京建成生物工程公司)，SDS凝胶配制试剂盒(购自Sigma)、转染蛋白分子量标准(碧云天生物技术研究所)。
垂直平板电泳仪(Apollo，美国)、半干印迹转移槽(OWL，英国)、凝胶成相分析系统(GeneGenius，英国)、超低温冰箱(Therm Forma 725，美国)、722紫外分光光度计(上海精工仪器有限公司)。
1.5测试指标与方法
1)测定大鼠海马区Hsp70。
(1)大鼠海马区蛋白质的提取。准确称取海马组织0.03 g，用预冷的PBS缓冲液洗涤，5 000 r/min离心5 min。弃上清液，加入约10倍沉淀物体积的RIPA细胞裂解液(使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1 mmol/L)，充分匀浆，直至细胞彻底裂解。再10 000 r/min离心5 min，取上清液，置于-20 ℃冰箱待测。
(2)Western blotting测定Hsp70。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(分离胶10%，浓缩胶5%)分离蛋白质。电泳2 h完毕后，取出凝胶转膜行电转移，0.8 mA/cm2，3 h。再取出硝酸纤维膜，用TBS清洗2次，然后置于封闭液(含20 mL 15% BSA的TBS)中，室温下封闭2 h。弃封闭液，用TBS洗膜3次，每次10 min，加入一抗，鼠抗人Hsp70抗体稀释(为体积比1︰700)，于脱色摇床上温和摇动孵育过夜。弃一抗溶液，用TBS洗膜2次，每次10 min，再加入羊抗鼠二抗稀释(为体积比1︰800)，孵育2 h。弃二抗溶液，用TBS洗膜3次，每次10 min。弃TBS，DAB显色，室温显色15 min，再用双蒸水洗膜终止显色。采用GeneGenius系列的Syngene凝胶成像分析系统分析Hsp70 水平，以积分光密度表示蛋白表达量，测试灰度值。
2)大鼠海马区SOD、MDA和Ca2 -ATPase的测试。
准确称取海马组织0.09 g，迅速剪碎后放入玻璃匀浆器中，加入约10倍组织体积的预冷生理盐水进行匀浆。将制备好的10%匀浆液进行离心(3 000 r/min，15 min)，取上清液用于指标测定。SOD、MDA和Ca2 -ATPase的测试，测定过程严格按照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书进行操作。其中SOD活性采用酶标法进行检测、MDA含量采用TBA法测定、Ca2 -ATPase采用比色法测定其酶活力。