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摘 要 目的：使用液相色谱-串联质谱分析水产品中的硝基呋喃类药物的残留情况。方法：使用乙酸乙酯液相色谱分离技术提取残留在水产品中的药物含量，并进行电喷雾串联质谱方法的检测活动。结果：硝基呋喃类药物在水产品中的含量保持在1～50 ng/ mL范围之内，比标准的范围值低10.4%。结论：这种方法具有准确性、灵敏性、专属性，对分析水产品中含硝基呋喃类药物含量非常的有效。
关键词 液相色谱-串联质谱；硝基呋喃类药物；水产品
中图分类号：TS254.7；O657.63 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2016）06--02
硝基呋喃类药物是一种综合型的光谱抗生素，具有预防畜禽胃肠道疾病的发生作用，经常用作饲料添加剂。这种药物带有慢性毒性，长期使用对动物产生一定的毒素，引起癌变、畸形等。这种药物在动物体内半衰期短，代谢速度快，可以长时间的残留与代谢，并伴有毒性，因此，对其进行检测，是为了更好地监控其在水产品中的残留情况。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
液相色谱-串联质谱，震荡器、离心机、氮吹仪。乙腈，甲醇，乙酸乙酯，正己烷均为色谱纯；50 mmol/L 2-硝基苯甲醛；0.125 mol/L盐酸溶液；1 mol/L氢氧化钾溶液；1 mol/L磷酸氢二钾溶液。硝基呋喃及同位素内标标准溶液：分别准确称取10 mg的AOZ、SEM、AHD、AMOZ、AMOZ-D5、AOZ-D4、AHD-D3、SEM-13C15标准品（纯度>98.0%），用甲醇溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，各组分浓度均为100 ?g/mL。
1.2 样品前处理
提取粉碎鱼肉2.00 g放在50 mL的离心管里，并加入150 ?g的内标混合工作液，加入适量的盐酸溶液均匀的摇晃30 s，再使用5 mL的0.125 mol/L盐酸溶液进行洗涤匀浆刀，与盐酸溶液一起放入离心管里。再加入2-肖基苯甲醛，摇晃半分钟后放于摇床中进行反应。将离心管中的上清液倒入另一个离心管中进入调试环节，保持pH数值在7～7.5。加入7 mL的乙酸乙酯进行分离，并要重复上述步骤，最后使用氮吹仪进行吹干处理，使用乙腈和乙酸水溶液对残渣进行溶解，并加入正己烷进行脱脂，将得到的下层溶液在12 000 r/min下进行离心10 min后，经过0.2 ?m滤膜的过滤，最后使用液相色谱-串联质谱进行测定[1]。
1.3 液相色谱一串联质谱测定
首先是液相色谱的条件：色谱柱100 mm×2.0 mm，粒度5 ?m，流速0.2 mL/min；柱温35 ℃；进样量20 ?L。流动相梯度洗脱见表1所示。其次是质谱条件：使用ESI的接口方式，雾化器6 mL/min，气帘气8 mL/min，加热温度450 ℃，碰撞气5 mL/min，使用5 000 V的电离电压，采用多反应选择离子的监测方法作为扫描方式。
2 结果与分析
2.1 样品前处理
硝基呋喃类药物的特点是代谢速度很快，与蛋白质结合在一起，呈现出结合状态的模式依附于动物的体中，当遇到适合的酸度条件时，会产生释放作用，代谢物的特点是小的分子化合物，分子的数值要保持在75～201，很难在质谱仪中产生特性的离子碎片，定性定量也非常的困难。本次试验使用的是衍生化试剂的柱前衍生方法，同时进行酸水解与衍生化。当衍生环节完成以后，会加大了代谢物的分子的质量，一般在208～335范围内，在合理的电压作用下，可以产生2个以上的特征性离子碎片峰。
2.2 质谱条件优化
开启ESI模式进行电离子活动，使用Q1开始扫描来确定每一组分母离子与子离子，将自动与手动结合在一起对代谢物进行离子化合物的分离与优化，并要对各种成分进行严格的检测活动，包括灵敏度，如果灵敏度不相同，那么得到的离子源条件会出现严重的偏重问题。
2.3 pH值对硝基呋喃代谢物提取效率的影响
如表2所示，是样品提取液pH数值对检测结果的影响表。通过这些数据可以分析出，4种代谢物的提取效率都受到pH数值的影响，直接决定了试验结果的准确性，并且严重的影响了每一组的保留时间，因此，采用这种方法进行试验，对pH数值有非常高的要求，在进行提取液pH数值的调试过程中，要在间隔半分钟以后重新测定，保证pH数值在7～7.5的范围中。
2.4 标准工作曲线及检出限
参照样品前处理条件，按照色譜与质谱的测度条件对AOZ、SEM、AHD、AMOZ的标准混合工作液进行测定，如图1所示，是对硝基呋喃代谢物的快速检测图样。表4表示的是回归方程、相关系数。依据仪器信噪比提供的数据，并参考了有关硝基呋喃代谢物检测的数据资料，得出这种方法的检出限是0.5 ?g/kg。
图1 硝基呋喃代谢物的快速检测
2.5 加标回收和精密度试验
在不含有硝基呋喃类代谢物残留物质的烤鳗身上进行添加抗生素药物的回收与精密度的试验，按照使用的方法分别加入了0.5、0.75、1.0 ?g/kg的抗生素溶液，根据实验提供的数据可以有效的分析出4种代谢物质回收率的平均数值在88.8%～111.0%，小于或等于标准偏差的15%。
2.6 试验中应注意问题
在进行硝基呋喃类代谢物在水产品中残留的试验时，要注意，硝基呋喃类代谢物在光合作用下，会进行分解反应，因此，在进行试验的过程中，要注意避光。此外，试验使用的样品不同，得到的试验结果也不相同，例如：使用面包虾与虾仁进行检测的时候，得到的SEM结果是不同的。试验使用的仪器设备、环境都会对试验的结果带来一定的影响，干扰检测的结果。
3 结语
本文使用柱前衍生的方法，检测出4种硝基呋喃类代谢物都是具有非常好的质谱特征的化合物，增加了检测物质的定性与定量。使用同位素内标检测、定量、测试的方法，是为了更好地提升试验使用方法的回收率与精密度，根据三离子确证的原则，增强了使用方法的可靠性，保障了试验样品技术的正确性。
参考文献
[1]王璟，杨楠，赵晶，等.液相色谱-串联质谱法检测水产品中硝基呋喃类代谢物[J].中国卫生检验杂志，2008（6）：978-980.
（责任编辑：刘昀）
关键词 液相色谱-串联质谱；硝基呋喃类药物；水产品
中图分类号：TS254.7；O657.63 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2016）06--02
硝基呋喃类药物是一种综合型的光谱抗生素，具有预防畜禽胃肠道疾病的发生作用，经常用作饲料添加剂。这种药物带有慢性毒性，长期使用对动物产生一定的毒素，引起癌变、畸形等。这种药物在动物体内半衰期短，代谢速度快，可以长时间的残留与代谢，并伴有毒性，因此，对其进行检测，是为了更好地监控其在水产品中的残留情况。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
液相色谱-串联质谱，震荡器、离心机、氮吹仪。乙腈，甲醇，乙酸乙酯，正己烷均为色谱纯；50 mmol/L 2-硝基苯甲醛；0.125 mol/L盐酸溶液；1 mol/L氢氧化钾溶液；1 mol/L磷酸氢二钾溶液。硝基呋喃及同位素内标标准溶液：分别准确称取10 mg的AOZ、SEM、AHD、AMOZ、AMOZ-D5、AOZ-D4、AHD-D3、SEM-13C15标准品（纯度>98.0%），用甲醇溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，各组分浓度均为100 ?g/mL。
1.2 样品前处理
提取粉碎鱼肉2.00 g放在50 mL的离心管里，并加入150 ?g的内标混合工作液，加入适量的盐酸溶液均匀的摇晃30 s，再使用5 mL的0.125 mol/L盐酸溶液进行洗涤匀浆刀，与盐酸溶液一起放入离心管里。再加入2-肖基苯甲醛，摇晃半分钟后放于摇床中进行反应。将离心管中的上清液倒入另一个离心管中进入调试环节，保持pH数值在7～7.5。加入7 mL的乙酸乙酯进行分离，并要重复上述步骤，最后使用氮吹仪进行吹干处理，使用乙腈和乙酸水溶液对残渣进行溶解，并加入正己烷进行脱脂，将得到的下层溶液在12 000 r/min下进行离心10 min后，经过0.2 ?m滤膜的过滤，最后使用液相色谱-串联质谱进行测定[1]。
1.3 液相色谱一串联质谱测定
首先是液相色谱的条件：色谱柱100 mm×2.0 mm，粒度5 ?m，流速0.2 mL/min；柱温35 ℃；进样量20 ?L。流动相梯度洗脱见表1所示。其次是质谱条件：使用ESI的接口方式，雾化器6 mL/min，气帘气8 mL/min，加热温度450 ℃，碰撞气5 mL/min，使用5 000 V的电离电压，采用多反应选择离子的监测方法作为扫描方式。
2 结果与分析
2.1 样品前处理
硝基呋喃类药物的特点是代谢速度很快，与蛋白质结合在一起，呈现出结合状态的模式依附于动物的体中，当遇到适合的酸度条件时，会产生释放作用，代谢物的特点是小的分子化合物，分子的数值要保持在75～201，很难在质谱仪中产生特性的离子碎片，定性定量也非常的困难。本次试验使用的是衍生化试剂的柱前衍生方法，同时进行酸水解与衍生化。当衍生环节完成以后，会加大了代谢物的分子的质量，一般在208～335范围内，在合理的电压作用下，可以产生2个以上的特征性离子碎片峰。
2.2 质谱条件优化
开启ESI模式进行电离子活动，使用Q1开始扫描来确定每一组分母离子与子离子，将自动与手动结合在一起对代谢物进行离子化合物的分离与优化，并要对各种成分进行严格的检测活动，包括灵敏度，如果灵敏度不相同，那么得到的离子源条件会出现严重的偏重问题。
2.3 pH值对硝基呋喃代谢物提取效率的影响
如表2所示，是样品提取液pH数值对检测结果的影响表。通过这些数据可以分析出，4种代谢物的提取效率都受到pH数值的影响，直接决定了试验结果的准确性，并且严重的影响了每一组的保留时间，因此，采用这种方法进行试验，对pH数值有非常高的要求，在进行提取液pH数值的调试过程中，要在间隔半分钟以后重新测定，保证pH数值在7～7.5的范围中。
2.4 标准工作曲线及检出限
参照样品前处理条件，按照色譜与质谱的测度条件对AOZ、SEM、AHD、AMOZ的标准混合工作液进行测定，如图1所示，是对硝基呋喃代谢物的快速检测图样。表4表示的是回归方程、相关系数。依据仪器信噪比提供的数据，并参考了有关硝基呋喃代谢物检测的数据资料，得出这种方法的检出限是0.5 ?g/kg。
图1 硝基呋喃代谢物的快速检测
2.5 加标回收和精密度试验
在不含有硝基呋喃类代谢物残留物质的烤鳗身上进行添加抗生素药物的回收与精密度的试验，按照使用的方法分别加入了0.5、0.75、1.0 ?g/kg的抗生素溶液，根据实验提供的数据可以有效的分析出4种代谢物质回收率的平均数值在88.8%～111.0%，小于或等于标准偏差的15%。
2.6 试验中应注意问题
在进行硝基呋喃类代谢物在水产品中残留的试验时，要注意，硝基呋喃类代谢物在光合作用下，会进行分解反应，因此，在进行试验的过程中，要注意避光。此外，试验使用的样品不同，得到的试验结果也不相同，例如：使用面包虾与虾仁进行检测的时候，得到的SEM结果是不同的。试验使用的仪器设备、环境都会对试验的结果带来一定的影响，干扰检测的结果。
3 结语
本文使用柱前衍生的方法，检测出4种硝基呋喃类代谢物都是具有非常好的质谱特征的化合物，增加了检测物质的定性与定量。使用同位素内标检测、定量、测试的方法，是为了更好地提升试验使用方法的回收率与精密度，根据三离子确证的原则，增强了使用方法的可靠性，保障了试验样品技术的正确性。
参考文献
[1]王璟，杨楠，赵晶，等.液相色谱-串联质谱法检测水产品中硝基呋喃类代谢物[J].中国卫生检验杂志，2008（6）：978-980.
（责任编辑：刘昀）