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摘 要 以柑橘溃疡病菌特异性高的假定蛋白基因（登录号：AE008923.1）为靶标，设计并筛选4条引物来特异性识别靶标序列中的6个独立区域，建立柑橘溃疡病菌LAMP实时浊度检测方法。该方法利用实时浊度仪检测反应过程中产生的焦磷酸镁白色沉淀，实现对LAMP整个反应过程的实时监控。从镁离子浓度、甜菜碱浓度、dNTPs浓度、引物浓度和反应温度5个变量参数对 LAMP检测体系进行优化，并对方法的特异性、灵敏度、稳定性及实际样品检测效果进行评价。结果显示，该体系经优化后稳定性良好，可在66 ℃ 恒温条件下，60 min内完成检测；DNA检测下限可达0.02 ng/μL，灵敏度与荧光定量PCR方法相同，比常规PCR方法高1个数量级；能快速、准确地对田间疑似样品进行检测，与荧光定量PCR方法的检出情况一致，没有漏检。结果说明柑橘溃疡病菌实时浊度LAMP检测方法操作简便、所需时间短，特异性与灵敏度高，为柑橘溃疡病菌的快速筛查提供较好的途径。
关键词 LAMP实时浊度检测方法；柑橘溃疡病菌；检测
中图分类号 S 436.661.1 文献标识码 A
Abstract The conserved hypothesis protein sequence published in GenBank（accession no.AE008923.1）of Xanthomonas axonopodis pv. citri was used to design a set of four special primers that recognized six distinct sequences of the conserved region of X. axonopodis pv. citri genome， and a real-time turbidity method for rapid detection of X. axonopodis pv. citri by loop-mediated isothermal amplification（LAMP）was established. Real-time monitoring of magnesium pyrophosphate produced from the LAMP reaction was achieved by the turbidimeter.The LAMP detection system was optimized by five variable parameters： magnesium ion concentration， dNTPs concentration， betaine concentration， primer concentration and reaction temperature， and the specificity， sensitivity， stability， and effect on real samples of this method were evaluated. Results showed that after optimizing the detection system the stability was good and detection was completed at 66 ℃ in 60 minutes.The lowest DNA detection limit was 0.02 ng/μL，with the same sensitivity as the real time Q-PCR method， but 10 times higher than the PCR method. This method could do field detection of suspected samples quickly and accurately， consistent with the fluorescence PCR detection methods without any missing cases. The LAMP real-time turbidity detection method is easy and quick to operate， with high specificity and sensitivity， and provides a good method for the rapid screening of X. axonopodis pv. citri. LAMP Real time turbidity method established in this study is a new method of LAMP detection of X. axonopodis pv. citri， has not been reported at home and abroad.
Key words LAMP real-time turbidity method； Xanthomonas axonopodis pv. citri； Detection
由地毯草黄单胞柑橘致病变种[Xanthomonas axonopodis pv. citri（Hasse） Vauterin et al.，简称柑橘溃疡病菌]引起的柑橘溃疡病（citrus bacterial canker disease，CBCD）是中国重要的检疫性有害生物，对柑橘生产危害极大，世界大部分国家对该病菌都有严格的检疫要求。该病目前广泛分布于亚洲、太平洋、印度洋岛国、非洲、南美洲和北美洲的30多个国家和地区。在中国已有14个省市（包括台湾）的柑橘产区有该病发生，尤以甜橙、柚和柑发生较严重[1-2]。
柑橘溃疡病菌，即旧的细菌分类系统中Xanthomonas campestris pv. citri中的A菌系，目前在Vauterin的新分类系统中被划分在地毯草黄单胞杆菌（Xanthomonas axonopodis）[3]。柑橘溃疡病菌侵染未老化的叶片、新梢和幼果形成病斑，严重时引起落叶、落果和枝梢枯死。同时，果实受害后还会影响外观、降低商品价值。柑橘溃疡病菌还有潜伏侵染现象，给此病的检疫、采穗和防治工作带来困难。柑橘溃疡病发生后，没有有效的防治办法，只能通过砍树烧毁等措施杜绝病害蔓延，对果农的利益造成极大的冲击[4]。因此迫切需要建立一种简单可靠的快速筛选方法，以便更好地对该菌进行检疫和监测，为柑橘溃疡病的防控提供可靠的资料和数据。 长期以来科研人员已对柑橘溃疡病进行了多种检测方法的研究。ELISA检测技术方法[5]、普通PCR检测方法[6]、荧光定量PCR检疫检验方法[7-8]、滚环扩增检测方法[9]、分子指纹图谱鉴别方法[10-11]等已被应用于柑橘溃疡病菌的检测。一些新的检测手段如脂肪酸色谱图检测法、激光检测法、噬菌体检验方法[12]等也相继展开，但这些检测技术普遍存在检测周期长、假阳性和误判率高、灵敏度差、仪器设备昂贵、检测过程复杂等缺点，限制了其在基层的推广。环介导恒温扩增（loop-mediated isothermal amplification， LAMP）是日本荣研化学株式会社Notomi等[13]在2000年发明并建立的一种新型核酸扩增方法，该技术通过设计两对特异性引物识别靶基因的6个特定区域，检测结果只通过扩增产物的有无来判别，在恒温条件下，15～90 min内可扩增 109～ 1010倍，免去了反复升温降温的过程，使得扩增过程更加简便。LAMP技术目前已在病原微生物的检测中得到广泛应用[14-15]。
起初，LAMP技术主要是利用水浴锅和金属浴等加热装置反应，观察LAMP反应中的副产物焦磷酸镁沉淀，或者通过SYBR Green I染料显色进行结果判定，但由于LAMP高温反应产生的气溶胶容易导致污染，后来发展了不开盖检测技术来避免污染。随着LAMP RealTime Turbidimeter LA-320c等浊度仪的开发利用，人们开始采用浊度仪对LAMP反应产生的副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行实时检测和定量分析。因为DNA浓度、焦磷酸镁、浊度三者呈线性相关，因此可依据DNA和浊度之间的相关性构建标准曲线从而实现目标基因的检测[16-17]。该技术的优点是在恒温条件下1 h即可完成扩增，耗时短，并可通过设置分析标准排除假阳性和非特异性反应等干扰引物，使得检测结果更加有效、准确，是新一代的LAMP检测方法[18-19]。本研究建立了柑橘溃疡病菌Xanthomonas axonopodis pv. citri的LAMP实时浊度检测方法，对优化后的LAMP反应体系进行了特异性、灵敏性和稳定性检测，同时与PCR检测技术进行了灵敏度的比较。该方法为口岸和基层实验室检疫和监测柑橘溃疡病菌，防止病菌传入侵风险，保证无病苗木繁育和生产提供了新的技术手段。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 感染柑橘溃疡病菌（Xanthomonas axonopodis pv. citri）的柑橘叶片由中国农科院柑橘研究所赠送，柑橘黄龙病菌亚洲种（Candidatus Liberobacter asiaticum）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、短波单胞杆菌（Brevundimonas segers）、鞘胺醇单胞嗜冷杆菌（Psychrobacter sp.）、水稻细条病菌（Xanthomons. oryzae pv. oryzicola）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡质芽孢杆菌（Bacillus cereus）均由重庆出入境检验检疫局植物检疫实验室提供。野油菜黄单胞杆菌（Xanthomons campestris pv. campestris）、番茄细菌性溃疡病菌（Clavibater michiganensis）、大白菜软腐病菌（Erwinia carotovora subsp. carotovora）均由山东出入境检验检疫局植物检疫实验室提供。
1.1.2 试剂与仪器 WizardR Genomic DNA Purification Kit、Bacterial DNA Kit和小量质粒DNA提取试剂盒购自OMEGA公司；Taq DNA Polymerase、dNTP Mixture、MgCl2、PCR buffer购自Promega公司；LAMP DNA扩增试剂盒购自日本荣研化学株式会社；DNA Marker（DL2000）购自宝生物（大连）有限公司；LB液体培养基购自北京陆桥技术有限责任公司。
生物安全柜（北京东联哈尔仪器制造有限公司），台式高速冷冻离心机（德国SIGMA公司）、水浴锅（南通凯达实验仪器有限公司）、空气浴摇床、球磨仪（德国Retsch公司）、电泳仪（美国BioRad公司）、凝胶成像系统[西盟生命技术（国际）有限公司]、LAMP RealTime Turbidimeter LA-320c（日本荣研化学株式会社）、荧光定量PCR仪（美国ABI公司）、PCR仪（美国ABI公司）。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 取小片新鲜病叶组织，经表面消毒后剪碎，放入充分预冷的研钵中， 加入液氮迅速研磨至粉末状，用promega wizard基因组DNA提取试剂盒提取样品总DNA，保存于-20 ℃冰箱备用。
1.2.2 引物的设计 根据巴西Silva等报道的柑橘溃疡病菌染色体全基因组序列（登录号：AE008923.1）与野油菜黄单胞菌（X. campestris pv. campestris）全基因组序列（登录号：AE008922.1）的同源性比对，选择柑橘溃疡病菌特异性高的假定蛋白（hypothesis protein）基因，利用LAMP引物在线设计软件Primer Explorer V4.0（http：//primerexplorer.jp/e/），根据Tm值、各引物的末端安定性、GC对含量、引物间距离、二次结构等条件设计5组LAMP引物，引物序列见表1。引物由上海生工生物工程有限公司合成。按照荣研LAMP试剂盒体系配制反应体系，用LAMP RealTime Turbidimeter LA-320c对反应进程进行实时监控，根据阳性样品的反应时间、扩增速率、引物组的非特异性扩增等条件进行5组引物的筛选。反应条件设定为62 ℃（根据Bst酶推荐的扩增温度为60～65 ℃的特性确定）60 min。 1.2.3 LAMP反应体系优化方法 参照国内外相关文献[15-19]，初步确定25 μL的LAMP反应体系，其成分包括：基础反应液12.5 μL，F3、B3（10 μmol/L）各0.5 μL，FIP、BIP（100 μmol/L）各0.5 μL，Bst DNA聚合酶1 μL，模板DNA 2 μL，灭菌双蒸水7.5 μL。反应条件为66 ℃ 60 min。基础液反应成分及浓度为：20 mmol/L Tris-HCl（pH=8.8，25 ℃），20 mmol/L KCl，20 mmol/L（NH4）2SO4，1% Tween-20，1.5 mol/L Betaine，2.5 mmol/L dNTPs，15 mmol/L MgSO4。
从镁离子浓度、甜菜碱浓度、dNTPs浓度、引物浓度和反应温度5个变量参数进行单因素变化实验，对 LAMP反应体系进行优化。
（1）镁离子浓度优化：设置镁离子浓度梯度依次为12、14、16、18、20 mmol/L；
（2）甜菜碱浓度变化：甜菜碱的浓度分别设定为2.4、2.6、2.8、3.0、3.2 mol/L；
（3）dNTPs浓度优化：dNTPs的浓度分别设定为2.2、2.4、2.6、2.8、3.0 mmol/L；
（4）引物浓度优化：固定外引物F3、B3的用量（5 pmol）不变，设置内引物FIP、BIP的用量以20、30、40、50、60 pmol依次递增；
（5）反应温度优化：将反应温度梯度设定为58、60、62、64、66、68 ℃；
利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320c对反应进行实时监控，收集扩增起始时间、最大扩增速率等信息进行显著性分析。
1.2.4 特异性分析 分别以柑橘溃疡病菌（X. axonopodis pv. citri）、柑橘黄龙病菌亚洲种（Ca. Liberobacter asiaticum）、野油菜黄单胞杆菌（X. campestris pv. campestris）、短小芽孢杆菌（B. pumilus）、短波单胞杆菌（B. segers）、鞘胺醇单胞菌（S. sp.）、成团泛菌（P. agglomerans）、嗜冷杆菌（P. sp.）、水稻细条病菌（X. oryzae pv. oryzicola）、苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、蜡质芽孢杆菌（B. cereus）、番茄细菌性溃疡病菌（C. michiganensis）、大白菜软腐病菌（E. carotovora subsp. carotovora）的DNA为模板，用筛选出的引物及温度条件进行LAMP扩增，评价引物的特异性。
1.2.5 灵敏度分析 将提取的柑橘溃疡病菌基因组DNA稀释至 20 μg/mL，然后10倍梯度稀释到10-7，采用以上优化的体系进行LAMP扩增。同时按照SN/T 2622-2010《柑橘溃疡病菌检疫鉴定方法》[20]进行常规PCR扩增和荧光定量 PCR扩增，比较LAMP体系与PCR体系基因组DNA检测的灵敏度。
1.2.6 稳定性试验 为评价该LAMP检测体系的稳定性，采用同一批提取的柑橘溃疡病菌基因组DNA作为模板进行为期一周的稳定性试验，每天1次，每次3个重复，用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320c收集开始扩增时间，计算变异系数（coefficient of variation，CV）。
1.2.7 扩大试验 分别采用LAMP方法、PCR方法、Real-Time PCR方法对212份柑橘叶片样品进行实际检测，比较符合率。所采集样品包括疑似染病的柑橘叶片样品和无染病症状的柑橘叶片样品。
2 结果与分析
2.1 引物筛选结果
实时扩增图见图1，5组引物中有ID1、ID3、ID5三组成功扩增目的片段，3次重复结果见表2所示，ID1引物组平均起始扩增时间为28.08 min，4 min内即达到最大反应速率，较其他引物组起始反应时间短，扩增速率高，符合LAMP快速反应的要求，初步确定为xac-LAMP检测用引物。使用ID1号引物进行LAMP扩增后的产物测序后经比对显示，序列与X. axonopodis pv. citri的hypothetical protein基因序列相似度达100%，表明ID1号引物组扩增准确及特异。
2.2 LAMP的反应体系优化结果
根据LAMP Real Time Turbidimeter LA-320c对反应进行实时监控和信息分析得出最佳参数为：镁离子浓度16 mmol/L；甜菜碱浓度2.8 mol/L；dNTPs浓度2.8 mmol/L；反应温度66 ℃。当外引物F3、B3的用量为5 pmol，内引物FIP、BIP为50 pmol时，起始反应时间最短，扩增效率最高，因此确定引物FIP、BIP、F3与B3的终浓度比为10 ∶ 10 ∶ 1 ∶ 1。根据上述数据，建立最佳反应体系，见表3所示。
2.3 特异性试验结果
用ID1引物组进行特异性试验，实时扩增见图2，结果显示，仅有柑橘溃疡病菌的 DNA产生扩增反应，其余13种对照菌株均未产生扩增反应，表明ID1引物组特异性良好，可以作为xac-LAMP特异性检测的引物。
2.4 LAMP与PCR 方法检测灵敏度的比较
所建立的xac-LAMP检测方法分别与普通PCR方法、实时荧光定量 PCR方法进行了灵敏度比较试验，结果见图3和表4。
从结果可看出，PCR方法的DNA检测下限为10-2，浓度为0.2 ng/μL，LAMP与荧光定量PCR方法的DNA检测下限均可达10-3，可检测到0.02 ng/μL的DNA。说明本研究所建立的LAMP方法灵敏度与荧光定量PCR方法相同，比常规PCR方法高1个数量级，显示出良好的应用前景。 2.5 稳定性试验结果
根据表5的统计结果，为期1周的稳定性试验结果良好，检测结果之间的CV%小于5%，介于0.55%与2.21%之间，说明该LAMP检测体系的稳定性良好。
2.6 扩大试验结果
采集212份柑橘叶片样品作为试验材料，样品包括疑似染病的柑橘叶片样品和无染病症状的柑橘叶片样品。柑橘叶片样品经表面消毒后剪碎放入充分预冷的研钵中， 加入液氮迅速研磨至粉末状，用promega wizard基因组DNA提取试剂盒提取样品总DNA，于-20 ℃保存备用。按照xac-LAMP检测方法对提取的样品总DNA进行检测，每个样品2次重复，统计阳性结果。结果用本研究建立的xac-LAMP检测方法检出阳性样品73份，阴性样品139份，用实时荧光定量PCR方法检出阳性73份，阴性139份，用PCR方法检出阳性56份，阴性样品156份。由此可知，本研究建立的xac-LAMP检测方法与荧光PCR方法的符合率为100%，与常规PCR方法的符合率为91.98%。
3 讨论与结论
目前已有利用LAMP方法检测柑橘溃疡病菌的相关文献报道。2010年，董欢[21]基于柑橘溃疡病菌独有的保守蛋白基因设计了LAMP特异性引物，并对该方法特异性和灵敏性进行了评估。2013年，张仑等[22]建立了柑橘溃疡病菌的普通LAMP及快速LAMP检测方法，还应用环介导等温扩增技术快速检测柑橘溃疡病菌进行研究[23]。本研究也是采用LAMP方法对柑橘溃疡病菌进行检测，但采用的LAMP技术不同。本研究通过浊度仪的精确设置排除了假阳性和非特异反应，保证了检测的准确性。而上述报道的研究仍停留于2000年初的LAMP检测技术，LAMP检测结果的判定采用的是凝胶电泳方法，耗时费力，因此不是真正的快速检测技术。上述研究也没有采用不开盖技术，由于LAMP高温反应后产生的气溶胶极易导致污染，因此假阳性率高。
在LAMP检测技术的关键环节上，已报道的柑橘溃疡病菌的LAMP检测技术与本研究也存在很多不同。首先，引物的设计与前述研究完全不同。本研究基于柑橘溃疡病菌高度保守的蛋白序列（accession no.AE008923.1）设计LAMP引物，通过浊度图、扩增效率和扩增曲线相互印证，筛选出扩增效率最佳的一组引物，保证了引物的高度特异。其次，在特异性实验中提供的对照菌不同。本研究筛选的引物组对柑橘黄龙病菌亚洲种、短小芽孢杆菌、短波单胞杆菌等13种对照菌均未产生扩增反应，表明LAMP引物组具有很高的特异性。董欢[21]的研究中仅提供了4种对照菌，对照菌数量太少，不能在假阳性和假阴性的排除上提供有说服力的证据。另外，在实际检测中的稳定性效果不同。本研究从镁离子浓度、甜菜碱浓度、dNTPs浓度、引物浓度和反应温度5个变量参数对 LAMP检测体系进行了优化，保证了检测体系的特异性、灵敏度和稳定性。该检测方法经实际检测，结果之间的变异系数CV%小于5%。而文献[21-22]中没有经过大量样本的实际检测来验证LAMP检测体系的稳定性，因此LAMP体系的实际检测效果不明确。对灵敏度的检测限进行比较，本研究基因组DNA最低检测限可达0.02 ng/μL，灵敏度与荧光定量PCR方法相当，比PCR方法高1个数量级，显示出了较高的应用价值。田间实测试验表明，本研究检测结果与荧光定量 PCR符合率为100%，没有出现漏检。且实测试验数据建立在染病柑橘叶片样品总DNA的基础上，灵敏度结果与实际情况更接近。该检测灵敏度为张仑研究报道的普通IAMP检测体系灵敏度的10倍。虽然张仑报道快速LAMP检测体系的DNA检测灵敏度可达2.03×10-5 ng/μL，但同时指出由于快速LAMP检测体系污染率较高，实验室对环境和操作要求极为严格，因此难以满足田间大规模样品普测的要求。在董欢[21]与张仑等[22]的研究中，实验样品均为纯菌菌株DNA，而在实际检测中提取的是总DNA，因此无法精确评估实验的实际检测灵敏度。
综上所述，本研究建立的LAMP实时浊度法是一种全新的柑橘溃疡病菌的LAMP检测方法，国内外未见相关报道。本研究还可利用钙黄绿素、SYBR GREEN等染料对扩增产物进行显色，通过反应管最终的颜色变化肉眼观察检测结果，满足可视化现场检测的要求。该方法具有特异性强，灵敏度高，方便可靠，成本低的特点，作为柑橘的口岸检疫和生产上的快速筛查手段，具有广阔的应用前景。
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关键词 LAMP实时浊度检测方法；柑橘溃疡病菌；检测
中图分类号 S 436.661.1 文献标识码 A
Abstract The conserved hypothesis protein sequence published in GenBank（accession no.AE008923.1）of Xanthomonas axonopodis pv. citri was used to design a set of four special primers that recognized six distinct sequences of the conserved region of X. axonopodis pv. citri genome， and a real-time turbidity method for rapid detection of X. axonopodis pv. citri by loop-mediated isothermal amplification（LAMP）was established. Real-time monitoring of magnesium pyrophosphate produced from the LAMP reaction was achieved by the turbidimeter.The LAMP detection system was optimized by five variable parameters： magnesium ion concentration， dNTPs concentration， betaine concentration， primer concentration and reaction temperature， and the specificity， sensitivity， stability， and effect on real samples of this method were evaluated. Results showed that after optimizing the detection system the stability was good and detection was completed at 66 ℃ in 60 minutes.The lowest DNA detection limit was 0.02 ng/μL，with the same sensitivity as the real time Q-PCR method， but 10 times higher than the PCR method. This method could do field detection of suspected samples quickly and accurately， consistent with the fluorescence PCR detection methods without any missing cases. The LAMP real-time turbidity detection method is easy and quick to operate， with high specificity and sensitivity， and provides a good method for the rapid screening of X. axonopodis pv. citri. LAMP Real time turbidity method established in this study is a new method of LAMP detection of X. axonopodis pv. citri， has not been reported at home and abroad.
Key words LAMP real-time turbidity method； Xanthomonas axonopodis pv. citri； Detection
由地毯草黄单胞柑橘致病变种[Xanthomonas axonopodis pv. citri（Hasse） Vauterin et al.，简称柑橘溃疡病菌]引起的柑橘溃疡病（citrus bacterial canker disease，CBCD）是中国重要的检疫性有害生物，对柑橘生产危害极大，世界大部分国家对该病菌都有严格的检疫要求。该病目前广泛分布于亚洲、太平洋、印度洋岛国、非洲、南美洲和北美洲的30多个国家和地区。在中国已有14个省市（包括台湾）的柑橘产区有该病发生，尤以甜橙、柚和柑发生较严重[1-2]。
柑橘溃疡病菌，即旧的细菌分类系统中Xanthomonas campestris pv. citri中的A菌系，目前在Vauterin的新分类系统中被划分在地毯草黄单胞杆菌（Xanthomonas axonopodis）[3]。柑橘溃疡病菌侵染未老化的叶片、新梢和幼果形成病斑，严重时引起落叶、落果和枝梢枯死。同时，果实受害后还会影响外观、降低商品价值。柑橘溃疡病菌还有潜伏侵染现象，给此病的检疫、采穗和防治工作带来困难。柑橘溃疡病发生后，没有有效的防治办法，只能通过砍树烧毁等措施杜绝病害蔓延，对果农的利益造成极大的冲击[4]。因此迫切需要建立一种简单可靠的快速筛选方法，以便更好地对该菌进行检疫和监测，为柑橘溃疡病的防控提供可靠的资料和数据。 长期以来科研人员已对柑橘溃疡病进行了多种检测方法的研究。ELISA检测技术方法[5]、普通PCR检测方法[6]、荧光定量PCR检疫检验方法[7-8]、滚环扩增检测方法[9]、分子指纹图谱鉴别方法[10-11]等已被应用于柑橘溃疡病菌的检测。一些新的检测手段如脂肪酸色谱图检测法、激光检测法、噬菌体检验方法[12]等也相继展开，但这些检测技术普遍存在检测周期长、假阳性和误判率高、灵敏度差、仪器设备昂贵、检测过程复杂等缺点，限制了其在基层的推广。环介导恒温扩增（loop-mediated isothermal amplification， LAMP）是日本荣研化学株式会社Notomi等[13]在2000年发明并建立的一种新型核酸扩增方法，该技术通过设计两对特异性引物识别靶基因的6个特定区域，检测结果只通过扩增产物的有无来判别，在恒温条件下，15～90 min内可扩增 109～ 1010倍，免去了反复升温降温的过程，使得扩增过程更加简便。LAMP技术目前已在病原微生物的检测中得到广泛应用[14-15]。
起初，LAMP技术主要是利用水浴锅和金属浴等加热装置反应，观察LAMP反应中的副产物焦磷酸镁沉淀，或者通过SYBR Green I染料显色进行结果判定，但由于LAMP高温反应产生的气溶胶容易导致污染，后来发展了不开盖检测技术来避免污染。随着LAMP RealTime Turbidimeter LA-320c等浊度仪的开发利用，人们开始采用浊度仪对LAMP反应产生的副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行实时检测和定量分析。因为DNA浓度、焦磷酸镁、浊度三者呈线性相关，因此可依据DNA和浊度之间的相关性构建标准曲线从而实现目标基因的检测[16-17]。该技术的优点是在恒温条件下1 h即可完成扩增，耗时短，并可通过设置分析标准排除假阳性和非特异性反应等干扰引物，使得检测结果更加有效、准确，是新一代的LAMP检测方法[18-19]。本研究建立了柑橘溃疡病菌Xanthomonas axonopodis pv. citri的LAMP实时浊度检测方法，对优化后的LAMP反应体系进行了特异性、灵敏性和稳定性检测，同时与PCR检测技术进行了灵敏度的比较。该方法为口岸和基层实验室检疫和监测柑橘溃疡病菌，防止病菌传入侵风险，保证无病苗木繁育和生产提供了新的技术手段。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 感染柑橘溃疡病菌（Xanthomonas axonopodis pv. citri）的柑橘叶片由中国农科院柑橘研究所赠送，柑橘黄龙病菌亚洲种（Candidatus Liberobacter asiaticum）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、短波单胞杆菌（Brevundimonas segers）、鞘胺醇单胞嗜冷杆菌（Psychrobacter sp.）、水稻细条病菌（Xanthomons. oryzae pv. oryzicola）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡质芽孢杆菌（Bacillus cereus）均由重庆出入境检验检疫局植物检疫实验室提供。野油菜黄单胞杆菌（Xanthomons campestris pv. campestris）、番茄细菌性溃疡病菌（Clavibater michiganensis）、大白菜软腐病菌（Erwinia carotovora subsp. carotovora）均由山东出入境检验检疫局植物检疫实验室提供。
1.1.2 试剂与仪器 WizardR Genomic DNA Purification Kit、Bacterial DNA Kit和小量质粒DNA提取试剂盒购自OMEGA公司；Taq DNA Polymerase、dNTP Mixture、MgCl2、PCR buffer购自Promega公司；LAMP DNA扩增试剂盒购自日本荣研化学株式会社；DNA Marker（DL2000）购自宝生物（大连）有限公司；LB液体培养基购自北京陆桥技术有限责任公司。
生物安全柜（北京东联哈尔仪器制造有限公司），台式高速冷冻离心机（德国SIGMA公司）、水浴锅（南通凯达实验仪器有限公司）、空气浴摇床、球磨仪（德国Retsch公司）、电泳仪（美国BioRad公司）、凝胶成像系统[西盟生命技术（国际）有限公司]、LAMP RealTime Turbidimeter LA-320c（日本荣研化学株式会社）、荧光定量PCR仪（美国ABI公司）、PCR仪（美国ABI公司）。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 取小片新鲜病叶组织，经表面消毒后剪碎，放入充分预冷的研钵中， 加入液氮迅速研磨至粉末状，用promega wizard基因组DNA提取试剂盒提取样品总DNA，保存于-20 ℃冰箱备用。
1.2.2 引物的设计 根据巴西Silva等报道的柑橘溃疡病菌染色体全基因组序列（登录号：AE008923.1）与野油菜黄单胞菌（X. campestris pv. campestris）全基因组序列（登录号：AE008922.1）的同源性比对，选择柑橘溃疡病菌特异性高的假定蛋白（hypothesis protein）基因，利用LAMP引物在线设计软件Primer Explorer V4.0（http：//primerexplorer.jp/e/），根据Tm值、各引物的末端安定性、GC对含量、引物间距离、二次结构等条件设计5组LAMP引物，引物序列见表1。引物由上海生工生物工程有限公司合成。按照荣研LAMP试剂盒体系配制反应体系，用LAMP RealTime Turbidimeter LA-320c对反应进程进行实时监控，根据阳性样品的反应时间、扩增速率、引物组的非特异性扩增等条件进行5组引物的筛选。反应条件设定为62 ℃（根据Bst酶推荐的扩增温度为60～65 ℃的特性确定）60 min。 1.2.3 LAMP反应体系优化方法 参照国内外相关文献[15-19]，初步确定25 μL的LAMP反应体系，其成分包括：基础反应液12.5 μL，F3、B3（10 μmol/L）各0.5 μL，FIP、BIP（100 μmol/L）各0.5 μL，Bst DNA聚合酶1 μL，模板DNA 2 μL，灭菌双蒸水7.5 μL。反应条件为66 ℃ 60 min。基础液反应成分及浓度为：20 mmol/L Tris-HCl（pH=8.8，25 ℃），20 mmol/L KCl，20 mmol/L（NH4）2SO4，1% Tween-20，1.5 mol/L Betaine，2.5 mmol/L dNTPs，15 mmol/L MgSO4。
从镁离子浓度、甜菜碱浓度、dNTPs浓度、引物浓度和反应温度5个变量参数进行单因素变化实验，对 LAMP反应体系进行优化。
（1）镁离子浓度优化：设置镁离子浓度梯度依次为12、14、16、18、20 mmol/L；
（2）甜菜碱浓度变化：甜菜碱的浓度分别设定为2.4、2.6、2.8、3.0、3.2 mol/L；
（3）dNTPs浓度优化：dNTPs的浓度分别设定为2.2、2.4、2.6、2.8、3.0 mmol/L；
（4）引物浓度优化：固定外引物F3、B3的用量（5 pmol）不变，设置内引物FIP、BIP的用量以20、30、40、50、60 pmol依次递增；
（5）反应温度优化：将反应温度梯度设定为58、60、62、64、66、68 ℃；
利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320c对反应进行实时监控，收集扩增起始时间、最大扩增速率等信息进行显著性分析。
1.2.4 特异性分析 分别以柑橘溃疡病菌（X. axonopodis pv. citri）、柑橘黄龙病菌亚洲种（Ca. Liberobacter asiaticum）、野油菜黄单胞杆菌（X. campestris pv. campestris）、短小芽孢杆菌（B. pumilus）、短波单胞杆菌（B. segers）、鞘胺醇单胞菌（S. sp.）、成团泛菌（P. agglomerans）、嗜冷杆菌（P. sp.）、水稻细条病菌（X. oryzae pv. oryzicola）、苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、蜡质芽孢杆菌（B. cereus）、番茄细菌性溃疡病菌（C. michiganensis）、大白菜软腐病菌（E. carotovora subsp. carotovora）的DNA为模板，用筛选出的引物及温度条件进行LAMP扩增，评价引物的特异性。
1.2.5 灵敏度分析 将提取的柑橘溃疡病菌基因组DNA稀释至 20 μg/mL，然后10倍梯度稀释到10-7，采用以上优化的体系进行LAMP扩增。同时按照SN/T 2622-2010《柑橘溃疡病菌检疫鉴定方法》[20]进行常规PCR扩增和荧光定量 PCR扩增，比较LAMP体系与PCR体系基因组DNA检测的灵敏度。
1.2.6 稳定性试验 为评价该LAMP检测体系的稳定性，采用同一批提取的柑橘溃疡病菌基因组DNA作为模板进行为期一周的稳定性试验，每天1次，每次3个重复，用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320c收集开始扩增时间，计算变异系数（coefficient of variation，CV）。
1.2.7 扩大试验 分别采用LAMP方法、PCR方法、Real-Time PCR方法对212份柑橘叶片样品进行实际检测，比较符合率。所采集样品包括疑似染病的柑橘叶片样品和无染病症状的柑橘叶片样品。
2 结果与分析
2.1 引物筛选结果
实时扩增图见图1，5组引物中有ID1、ID3、ID5三组成功扩增目的片段，3次重复结果见表2所示，ID1引物组平均起始扩增时间为28.08 min，4 min内即达到最大反应速率，较其他引物组起始反应时间短，扩增速率高，符合LAMP快速反应的要求，初步确定为xac-LAMP检测用引物。使用ID1号引物进行LAMP扩增后的产物测序后经比对显示，序列与X. axonopodis pv. citri的hypothetical protein基因序列相似度达100%，表明ID1号引物组扩增准确及特异。
2.2 LAMP的反应体系优化结果
根据LAMP Real Time Turbidimeter LA-320c对反应进行实时监控和信息分析得出最佳参数为：镁离子浓度16 mmol/L；甜菜碱浓度2.8 mol/L；dNTPs浓度2.8 mmol/L；反应温度66 ℃。当外引物F3、B3的用量为5 pmol，内引物FIP、BIP为50 pmol时，起始反应时间最短，扩增效率最高，因此确定引物FIP、BIP、F3与B3的终浓度比为10 ∶ 10 ∶ 1 ∶ 1。根据上述数据，建立最佳反应体系，见表3所示。
2.3 特异性试验结果
用ID1引物组进行特异性试验，实时扩增见图2，结果显示，仅有柑橘溃疡病菌的 DNA产生扩增反应，其余13种对照菌株均未产生扩增反应，表明ID1引物组特异性良好，可以作为xac-LAMP特异性检测的引物。
2.4 LAMP与PCR 方法检测灵敏度的比较
所建立的xac-LAMP检测方法分别与普通PCR方法、实时荧光定量 PCR方法进行了灵敏度比较试验，结果见图3和表4。
从结果可看出，PCR方法的DNA检测下限为10-2，浓度为0.2 ng/μL，LAMP与荧光定量PCR方法的DNA检测下限均可达10-3，可检测到0.02 ng/μL的DNA。说明本研究所建立的LAMP方法灵敏度与荧光定量PCR方法相同，比常规PCR方法高1个数量级，显示出良好的应用前景。 2.5 稳定性试验结果
根据表5的统计结果，为期1周的稳定性试验结果良好，检测结果之间的CV%小于5%，介于0.55%与2.21%之间，说明该LAMP检测体系的稳定性良好。
2.6 扩大试验结果
采集212份柑橘叶片样品作为试验材料，样品包括疑似染病的柑橘叶片样品和无染病症状的柑橘叶片样品。柑橘叶片样品经表面消毒后剪碎放入充分预冷的研钵中， 加入液氮迅速研磨至粉末状，用promega wizard基因组DNA提取试剂盒提取样品总DNA，于-20 ℃保存备用。按照xac-LAMP检测方法对提取的样品总DNA进行检测，每个样品2次重复，统计阳性结果。结果用本研究建立的xac-LAMP检测方法检出阳性样品73份，阴性样品139份，用实时荧光定量PCR方法检出阳性73份，阴性139份，用PCR方法检出阳性56份，阴性样品156份。由此可知，本研究建立的xac-LAMP检测方法与荧光PCR方法的符合率为100%，与常规PCR方法的符合率为91.98%。
3 讨论与结论
目前已有利用LAMP方法检测柑橘溃疡病菌的相关文献报道。2010年，董欢[21]基于柑橘溃疡病菌独有的保守蛋白基因设计了LAMP特异性引物，并对该方法特异性和灵敏性进行了评估。2013年，张仑等[22]建立了柑橘溃疡病菌的普通LAMP及快速LAMP检测方法，还应用环介导等温扩增技术快速检测柑橘溃疡病菌进行研究[23]。本研究也是采用LAMP方法对柑橘溃疡病菌进行检测，但采用的LAMP技术不同。本研究通过浊度仪的精确设置排除了假阳性和非特异反应，保证了检测的准确性。而上述报道的研究仍停留于2000年初的LAMP检测技术，LAMP检测结果的判定采用的是凝胶电泳方法，耗时费力，因此不是真正的快速检测技术。上述研究也没有采用不开盖技术，由于LAMP高温反应后产生的气溶胶极易导致污染，因此假阳性率高。
在LAMP检测技术的关键环节上，已报道的柑橘溃疡病菌的LAMP检测技术与本研究也存在很多不同。首先，引物的设计与前述研究完全不同。本研究基于柑橘溃疡病菌高度保守的蛋白序列（accession no.AE008923.1）设计LAMP引物，通过浊度图、扩增效率和扩增曲线相互印证，筛选出扩增效率最佳的一组引物，保证了引物的高度特异。其次，在特异性实验中提供的对照菌不同。本研究筛选的引物组对柑橘黄龙病菌亚洲种、短小芽孢杆菌、短波单胞杆菌等13种对照菌均未产生扩增反应，表明LAMP引物组具有很高的特异性。董欢[21]的研究中仅提供了4种对照菌，对照菌数量太少，不能在假阳性和假阴性的排除上提供有说服力的证据。另外，在实际检测中的稳定性效果不同。本研究从镁离子浓度、甜菜碱浓度、dNTPs浓度、引物浓度和反应温度5个变量参数对 LAMP检测体系进行了优化，保证了检测体系的特异性、灵敏度和稳定性。该检测方法经实际检测，结果之间的变异系数CV%小于5%。而文献[21-22]中没有经过大量样本的实际检测来验证LAMP检测体系的稳定性，因此LAMP体系的实际检测效果不明确。对灵敏度的检测限进行比较，本研究基因组DNA最低检测限可达0.02 ng/μL，灵敏度与荧光定量PCR方法相当，比PCR方法高1个数量级，显示出了较高的应用价值。田间实测试验表明，本研究检测结果与荧光定量 PCR符合率为100%，没有出现漏检。且实测试验数据建立在染病柑橘叶片样品总DNA的基础上，灵敏度结果与实际情况更接近。该检测灵敏度为张仑研究报道的普通IAMP检测体系灵敏度的10倍。虽然张仑报道快速LAMP检测体系的DNA检测灵敏度可达2.03×10-5 ng/μL，但同时指出由于快速LAMP检测体系污染率较高，实验室对环境和操作要求极为严格，因此难以满足田间大规模样品普测的要求。在董欢[21]与张仑等[22]的研究中，实验样品均为纯菌菌株DNA，而在实际检测中提取的是总DNA，因此无法精确评估实验的实际检测灵敏度。
综上所述，本研究建立的LAMP实时浊度法是一种全新的柑橘溃疡病菌的LAMP检测方法，国内外未见相关报道。本研究还可利用钙黄绿素、SYBR GREEN等染料对扩增产物进行显色，通过反应管最终的颜色变化肉眼观察检测结果，满足可视化现场检测的要求。该方法具有特异性强，灵敏度高，方便可靠，成本低的特点，作为柑橘的口岸检疫和生产上的快速筛查手段，具有广阔的应用前景。
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