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摘要 蜂花粉素有“微型营养库”的称号，具有抗氧化、护肝、抑菌、抗炎等多种药理活性。在此对油菜蜂花粉中黄酮类物质的提取工艺、已分离或检测到的成分及其生物活性进行综述，为今后其研究和开发利用提供参考。
关键词 油菜蜂花粉；黄酮类；提取工艺；化学成分；生物活性
中图分类号 S609.9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）33-165-03
Research Progress on Flavonoids of Rape Bee Pollen
XUE Mingge1，2， WEN Miaomiao2， QI Mengya2， BU Cuiping2，3* et al
（1. College of Food Science and Engineering， Yangzhou University， Yangzhou， Jiangsu 225127； 2. Jiangsu Key Laboratory for Ecoagricultural Biotechnology around Hongze Lake， School of Life Sciences， Huaiyin Normal University， Huaian， Jiangsu 223300； 3. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Regional Modern Agriculture & Environmental Protection， Huaiyin Normal University， Huaian， Jiangsu 223300）
Abstract Rape bee pollen is called “micronutrition library”， with a variety of pharmacological activity， antioxidant， antibacterial， antiinflammatory and hepatoprotective. The extraction techniques， isolated and detected components and the physiological activities of citrus flavonoids were introduced， which will provide a reference on research and exploitation in the future.
Key words Rape bee pollen； Flavonoids； Extraction technique； Chemical components； Biological activity
蜂花粉是蜜蜂在采集的花粉中加入花蜜和唾液而形成的花粉团状物，种类多与蜜蜂采集花朵的种类相关，其中，油菜蜂花粉应用潜力大。油菜蜂花粉在我国分布广泛，产量丰富，居我国花粉贸易之首。营养价值方面，油菜蜂花粉因为含有人体所需的糖类、氨基酸、脂肪酸、维生素、微量元素以及大量的酚类、酶类等其他生物活性物质，被公认为天然的健康食品[1]。研究证明，油菜蜂花粉具有抗氧化、抗炎症、抗辐射、抑制肿瘤、调节免疫、抑菌、调节血脂等多种生物功效，在提高人体综合免疫功能、调节神经系统、改善肠胃功能、防治心脑血管疾病等方面发挥重要疗效[2-5]。
黄酮类化合物是一类重要的天然有机化合物，是植物在长期自然选择过程中产生的一类次生代谢产物。黄酮类化合物既有高度的化学反应性，又有很多重要的药理作用[6]。油菜花蜂花粉中总黄酮含量在玫瑰花、五味子花等15种蜂花粉中含量最高[7]，且与蜂花粉清除自由基、降血压、降血脂、糖尿病和前列腺炎治疗和预防的功效直接相关[8-11]。
目前油菜蜂花粉中黄酮类化合物的研究主要集中在提取纯化、测定含量及成分、生物活性等方面。笔者在此对油菜蜂花粉中黄酮类化合物的提取工艺、化学成分和生物活性进行归纳综述，为今后的深入研究和开发利用提供参考。
1 提取工艺
目前黄酮类化合物的传统提取方法主要有加热回流法、冷浸提取法、索式提取法，新型提取方法有超声波辅助提取法和微波辅助提取法。
王小艳等[12]分析比较加热回流法、冷浸提取法、索式提取法和超声波辅助提取法4种方法发现，索式提取法得率最高，但不适合大量样品的制备；加热回流法得率次之，但溶剂需求量较大，操作较繁琐；冷浸法和超声法得率近似，但冷浸法耗时过长，同时有效成分不易完全浸出；超声法提取时间短、使用溶剂少、操作简单，是一种可推广的新型提取方法；经正交试验，确定超声辅助提取法的最佳工艺条件为40 ℃、100 W功率下用1∶12的料液比，提取25 min，测得含量为31.27 mg/g。党云刚[13]通过响应面法确定以上4种方法的最佳提取条件，综合比较得出水浴回流法黄酮得率相对较高，但超声法提取效率最高，作为提取方法更为合适；超声波法最佳提取条件为温度50 ℃、时间20 min、功率200 W、乙醇浓度80%、料液比1∶31，超声次数3次，黄酮得率为3.249%。
微波辅助提取法作为一种新型方法，提取效率也较高。在相同的条件下，微波辅助提取法提取油菜花中黄酮得率比索式提取法、冷浸法、加热回流法更高，槲皮素和山奈酚的含量分别可达1.37、23.44 mg/g[14]。这是因为微波法可同时作用细胞壁的内外两层结构[15]，使蜂花粉同时被加热，内部迅速升温，内压大大增加，超过细胞壁膨胀所能承受的压力时，细胞破裂，从而使有效成分溶解于萃取溶剂中[16-17]。
为了更好地利用超声波和微波的优势，孙岩等[18]采用超声-微波协同萃取法提取油菜蜂花粉中黄酮类物质，与热回流法、超声法、微波法相比，提取效率明显提高，同时具有节能、安全的优点；在乙醇体积分数90%、料液比1∶30、微波功率260 W、提取时间180 s条件下，提取得率最高，达3.36%。 2 化学成分
已报道的油菜蜂花粉黄酮主要为黄酮醇苷类，主要包括槲皮素、山奈酚、异鼠李素、柚皮素、芦丁。其中经核磁鉴定的化合物有
山奈酚3OβD吡喃葡萄糖苷、山奈酚3，4′双OβD吡喃葡萄糖苷、山奈酚3OβD 葡萄糖（2→1）βD葡萄糖苷、山奈酚3OβD吡喃葡萄糖基（ 1→2）βD吡喃葡萄糖苷、山奈酚3O新橙皮糖苷[19]、槲皮素3OβD吡喃葡萄糖苷、槲皮素3OβD吡喃葡萄糖基-（ 1→2）OβD吡喃葡萄糖苷、槲皮素3OβD葡萄糖-（2→1）βD葡萄糖苷、5，7，4′三羟基8甲氧基黄酮醇3OβD槐糖苷[20]、异鼠李素3OβD吡喃葡萄糖基-（ 1→2）βD吡喃葡萄糖苷[18]。
3 生物活性
3.1 抗氧化性
黄酮类化合物可以通过酚羟基与体内自由基反应形成稳定半醌式自由基结构，发挥清除自由基作用，是抗氧化的主要活性成分之一。其中黄酮醇清除自由基的能力最强，黄酮最弱[21]。已有大量研究报道，蜂花粉中的总黄酮对·OH、O-2·、DPPH·皆有一定的清除作用[22-23]。一般情况下，黄酮含量越高，清除自由基的效果越好。蜂花粉总黄酮含量在12.5～100 μg/ml范围内浓度与清除效率呈线性关系[24]，总黄酮含量与DPPH自由基清除率相关系数最大，为0.778 0[25]，可能是黄酮类物质对自由基引起的连锁起始反应阶段的抑制作用较好。
杨佳林[26]首次采用TLCDPPH法分离蜂花粉酸解液中的黄酮醇，并评价抗氧化能力，筛选出槲皮素和山奈酚为生物活性组分，且具有比其糖苷更强的DPPH·清除活性，此法快速高效，可为蜂花粉中抗氧化活性物质的追踪提供参考。
试验表明，经乙酸乙酯萃取油菜蜂花粉，萃取物具有明显的抗氧作用。饶剑等[27]结合体内外试验发现乙酸乙酯萃取物能显著降低D半乳糖诱导衰老小鼠肝组织中丙二醛（MDA）含量和脑组织中单胺氧化酶（MAO）活力。赵剑喜等[28]评价不同提取部位对PC12细胞氧化损伤的保护作用，发现乙酸乙酯提取物细胞存活率最好；两者进一步鉴定结构发现，主要物质均为黄酮类化合物。曹炜等[29]将鼠红细胞膜预先用油菜花粉黄酮处理后，膜脂的MDA含量明显下降，呈现剂量与效应关系，膜脂流动性显著提高，表明油菜花粉黄酮对·OH、O-2·引起的鼠红细胞膜的氧化损伤有保护作用。魏永生等[30]用食用酒精冷浸法提取油菜蜂花粉中的总黄酮，工艺简单，产品纯度高，且对猪油具有抗氧化性能，能与Vc协同增效，与常用的人工抗氧化剂BHT相比，作用更强。
在还原力的评价结果中，黄酮类物质和其他酚类物质相互协同，一起发挥作用[31]。
从地理角度分析，全国几个油菜主产区中，新疆、湖北油菜蜂花粉中总黄酮含量、还原力和DPPH自由基清除率显著高于其他产地[32]。可能与植物生长环境的昼夜温差、湿度以及光照时间等因素有关[33-34]。
3.2 保肝作用
黄酮醇苷类物质是油菜蜂花粉中主要的保肝活性成分。CCl4经肝微粒体细胞色素P450酶激活后，生成三氯甲烷自由基（·CCl3）和氯自由基（·Cl），它们攻击肝细胞膜上磷脂分子引起脂质过氧化或肝微粒体脂质和蛋白质发生共价结合，可直接引发肝细胞脂质过氧化作用，诱发细胞死亡[35-37]。油菜蜂花粉黄酮醇苷类物质可以通过清除活性自由基，终止自由基链式反应，显著地降低CCl4造成的脂质过氧化小鼠苷匀浆和血清中MDA含量，提高SOD活性和总抗氧化能力（TAOC），改善CCl4诱导的脂质过氧化损伤[38-39]。彭定利等[9，20]建立以10 mmol/L CCl4诱导的体外肝细胞损伤模型中，通过MTT法测定细胞存活率并以其作为细胞活性筛选指标，正丁醇萃取组分在100 μg/ml剂量下活性可高于同剂量的水飞蓟宾，可为模型组的2.41倍，初步判断为黄酮醇苷类物质，并从作用机制验证了其对CCl4引起的肝损伤具有显著保护作用。
3.3 抑菌作用
Carpes[40]首先发现蜂花粉中的酚类物质具有抑菌作用。孙丽萍等[41]进而对油菜蜂花粉分离提取，以对枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的抑菌能力为活性跟踪指标，以最小抑菌质量浓度（MIC）和最小杀菌质量浓度（MBC）为评价指标，进行活性追踪和结构鉴定，结果表明，乙醚萃取部分的抑菌活性最强，山奈酚是其中主要抑菌活性成分，效果显著，是油菜蜂花粉抑菌作用的主要物质基础。
3.4 其他
郭雪微等[42]选择确诊血脂紊乱、2型糖尿病、脑梗塞和健康者各30例，给与油菜蜂花粉黄酮类化合物口服40 mg，每日2次，持续2个月，结果发现，血脂紊乱组、糖尿病组和脑梗塞各组甘油三酯（TG）、白细胞计数（WBC）、血小板计数（PCT）、高敏C反应蛋白（hsCRP）和丙二醛（MDA）明显下降，高密度脂蛋白胆固醇（HDL C）显著升高，血糖（BG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）也有一定程度下降，说明油菜蜂花粉黄酮类化合物具有一定程度地调节血脂、抑制炎性因子、控制血糖作用，在临床的药理研究有很广阔前景[43]。
4 结语
油菜蜂花粉含有大量黄酮类化合物，因其显著的药理特性和保健功能，具有很大的研发价值。但目前对油菜蜂花粉的主要研究停留在酚类化合物的生理活性上，在食品的应用上也主要侧重于蜂花粉整体的功能疗效，还没有完全科学地认识黄酮生物活性上的应用空间。另外，对黄酮的分离提取方法绝大多数还局限在试验室的操作阶段，与商业化大规模的生产开发上存在一定距离。相信随着相关试验的开展，油菜蜂花粉中黄酮类化合物更多的生物活性将被发现，被人们所开发利用。
参考文献
[1] 冯慧，焦士蓉，唐远谋，等.油菜花粉研究进展[J].食品工业，2011（9）：108-110. [2] WAGENLEHNER F M，SCHNEIDER H，LUDWIG M，et al.A pollen extract（Cernilton）in patients with inflammatory chronic prostatitischronic pelvic pain syndrome：A multicentre，randomised，prospective，doubleblind，placebocontrolled phase 3 study[J].European urology，2009，56：544–551.
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[4] MEDEIROS K C，FIGUEIREDO C A，FIGUEREDO T B，et al.Antiallergic effect of bee pollen phenolic extract and myricetin in ovalbuminsensitized mice[J].Journal of ethnopharmacology，2008，119：41-46.
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[18] 孙岩，郭庆兴，童群义.超声-微波协同萃取法提取油菜蜂花粉中黄酮类物质[J].食品与发酵工业，2014，40（10）：238-244.
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关键词 油菜蜂花粉；黄酮类；提取工艺；化学成分；生物活性
中图分类号 S609.9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）33-165-03
Research Progress on Flavonoids of Rape Bee Pollen
XUE Mingge1，2， WEN Miaomiao2， QI Mengya2， BU Cuiping2，3* et al
（1. College of Food Science and Engineering， Yangzhou University， Yangzhou， Jiangsu 225127； 2. Jiangsu Key Laboratory for Ecoagricultural Biotechnology around Hongze Lake， School of Life Sciences， Huaiyin Normal University， Huaian， Jiangsu 223300； 3. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Regional Modern Agriculture & Environmental Protection， Huaiyin Normal University， Huaian， Jiangsu 223300）
Abstract Rape bee pollen is called “micronutrition library”， with a variety of pharmacological activity， antioxidant， antibacterial， antiinflammatory and hepatoprotective. The extraction techniques， isolated and detected components and the physiological activities of citrus flavonoids were introduced， which will provide a reference on research and exploitation in the future.
Key words Rape bee pollen； Flavonoids； Extraction technique； Chemical components； Biological activity
蜂花粉是蜜蜂在采集的花粉中加入花蜜和唾液而形成的花粉团状物，种类多与蜜蜂采集花朵的种类相关，其中，油菜蜂花粉应用潜力大。油菜蜂花粉在我国分布广泛，产量丰富，居我国花粉贸易之首。营养价值方面，油菜蜂花粉因为含有人体所需的糖类、氨基酸、脂肪酸、维生素、微量元素以及大量的酚类、酶类等其他生物活性物质，被公认为天然的健康食品[1]。研究证明，油菜蜂花粉具有抗氧化、抗炎症、抗辐射、抑制肿瘤、调节免疫、抑菌、调节血脂等多种生物功效，在提高人体综合免疫功能、调节神经系统、改善肠胃功能、防治心脑血管疾病等方面发挥重要疗效[2-5]。
黄酮类化合物是一类重要的天然有机化合物，是植物在长期自然选择过程中产生的一类次生代谢产物。黄酮类化合物既有高度的化学反应性，又有很多重要的药理作用[6]。油菜花蜂花粉中总黄酮含量在玫瑰花、五味子花等15种蜂花粉中含量最高[7]，且与蜂花粉清除自由基、降血压、降血脂、糖尿病和前列腺炎治疗和预防的功效直接相关[8-11]。
目前油菜蜂花粉中黄酮类化合物的研究主要集中在提取纯化、测定含量及成分、生物活性等方面。笔者在此对油菜蜂花粉中黄酮类化合物的提取工艺、化学成分和生物活性进行归纳综述，为今后的深入研究和开发利用提供参考。
1 提取工艺
目前黄酮类化合物的传统提取方法主要有加热回流法、冷浸提取法、索式提取法，新型提取方法有超声波辅助提取法和微波辅助提取法。
王小艳等[12]分析比较加热回流法、冷浸提取法、索式提取法和超声波辅助提取法4种方法发现，索式提取法得率最高，但不适合大量样品的制备；加热回流法得率次之，但溶剂需求量较大，操作较繁琐；冷浸法和超声法得率近似，但冷浸法耗时过长，同时有效成分不易完全浸出；超声法提取时间短、使用溶剂少、操作简单，是一种可推广的新型提取方法；经正交试验，确定超声辅助提取法的最佳工艺条件为40 ℃、100 W功率下用1∶12的料液比，提取25 min，测得含量为31.27 mg/g。党云刚[13]通过响应面法确定以上4种方法的最佳提取条件，综合比较得出水浴回流法黄酮得率相对较高，但超声法提取效率最高，作为提取方法更为合适；超声波法最佳提取条件为温度50 ℃、时间20 min、功率200 W、乙醇浓度80%、料液比1∶31，超声次数3次，黄酮得率为3.249%。
微波辅助提取法作为一种新型方法，提取效率也较高。在相同的条件下，微波辅助提取法提取油菜花中黄酮得率比索式提取法、冷浸法、加热回流法更高，槲皮素和山奈酚的含量分别可达1.37、23.44 mg/g[14]。这是因为微波法可同时作用细胞壁的内外两层结构[15]，使蜂花粉同时被加热，内部迅速升温，内压大大增加，超过细胞壁膨胀所能承受的压力时，细胞破裂，从而使有效成分溶解于萃取溶剂中[16-17]。
为了更好地利用超声波和微波的优势，孙岩等[18]采用超声-微波协同萃取法提取油菜蜂花粉中黄酮类物质，与热回流法、超声法、微波法相比，提取效率明显提高，同时具有节能、安全的优点；在乙醇体积分数90%、料液比1∶30、微波功率260 W、提取时间180 s条件下，提取得率最高，达3.36%。 2 化学成分
已报道的油菜蜂花粉黄酮主要为黄酮醇苷类，主要包括槲皮素、山奈酚、异鼠李素、柚皮素、芦丁。其中经核磁鉴定的化合物有
山奈酚3OβD吡喃葡萄糖苷、山奈酚3，4′双OβD吡喃葡萄糖苷、山奈酚3OβD 葡萄糖（2→1）βD葡萄糖苷、山奈酚3OβD吡喃葡萄糖基（ 1→2）βD吡喃葡萄糖苷、山奈酚3O新橙皮糖苷[19]、槲皮素3OβD吡喃葡萄糖苷、槲皮素3OβD吡喃葡萄糖基-（ 1→2）OβD吡喃葡萄糖苷、槲皮素3OβD葡萄糖-（2→1）βD葡萄糖苷、5，7，4′三羟基8甲氧基黄酮醇3OβD槐糖苷[20]、异鼠李素3OβD吡喃葡萄糖基-（ 1→2）βD吡喃葡萄糖苷[18]。
3 生物活性
3.1 抗氧化性
黄酮类化合物可以通过酚羟基与体内自由基反应形成稳定半醌式自由基结构，发挥清除自由基作用，是抗氧化的主要活性成分之一。其中黄酮醇清除自由基的能力最强，黄酮最弱[21]。已有大量研究报道，蜂花粉中的总黄酮对·OH、O-2·、DPPH·皆有一定的清除作用[22-23]。一般情况下，黄酮含量越高，清除自由基的效果越好。蜂花粉总黄酮含量在12.5～100 μg/ml范围内浓度与清除效率呈线性关系[24]，总黄酮含量与DPPH自由基清除率相关系数最大，为0.778 0[25]，可能是黄酮类物质对自由基引起的连锁起始反应阶段的抑制作用较好。
杨佳林[26]首次采用TLCDPPH法分离蜂花粉酸解液中的黄酮醇，并评价抗氧化能力，筛选出槲皮素和山奈酚为生物活性组分，且具有比其糖苷更强的DPPH·清除活性，此法快速高效，可为蜂花粉中抗氧化活性物质的追踪提供参考。
试验表明，经乙酸乙酯萃取油菜蜂花粉，萃取物具有明显的抗氧作用。饶剑等[27]结合体内外试验发现乙酸乙酯萃取物能显著降低D半乳糖诱导衰老小鼠肝组织中丙二醛（MDA）含量和脑组织中单胺氧化酶（MAO）活力。赵剑喜等[28]评价不同提取部位对PC12细胞氧化损伤的保护作用，发现乙酸乙酯提取物细胞存活率最好；两者进一步鉴定结构发现，主要物质均为黄酮类化合物。曹炜等[29]将鼠红细胞膜预先用油菜花粉黄酮处理后，膜脂的MDA含量明显下降，呈现剂量与效应关系，膜脂流动性显著提高，表明油菜花粉黄酮对·OH、O-2·引起的鼠红细胞膜的氧化损伤有保护作用。魏永生等[30]用食用酒精冷浸法提取油菜蜂花粉中的总黄酮，工艺简单，产品纯度高，且对猪油具有抗氧化性能，能与Vc协同增效，与常用的人工抗氧化剂BHT相比，作用更强。
在还原力的评价结果中，黄酮类物质和其他酚类物质相互协同，一起发挥作用[31]。
从地理角度分析，全国几个油菜主产区中，新疆、湖北油菜蜂花粉中总黄酮含量、还原力和DPPH自由基清除率显著高于其他产地[32]。可能与植物生长环境的昼夜温差、湿度以及光照时间等因素有关[33-34]。
3.2 保肝作用
黄酮醇苷类物质是油菜蜂花粉中主要的保肝活性成分。CCl4经肝微粒体细胞色素P450酶激活后，生成三氯甲烷自由基（·CCl3）和氯自由基（·Cl），它们攻击肝细胞膜上磷脂分子引起脂质过氧化或肝微粒体脂质和蛋白质发生共价结合，可直接引发肝细胞脂质过氧化作用，诱发细胞死亡[35-37]。油菜蜂花粉黄酮醇苷类物质可以通过清除活性自由基，终止自由基链式反应，显著地降低CCl4造成的脂质过氧化小鼠苷匀浆和血清中MDA含量，提高SOD活性和总抗氧化能力（TAOC），改善CCl4诱导的脂质过氧化损伤[38-39]。彭定利等[9，20]建立以10 mmol/L CCl4诱导的体外肝细胞损伤模型中，通过MTT法测定细胞存活率并以其作为细胞活性筛选指标，正丁醇萃取组分在100 μg/ml剂量下活性可高于同剂量的水飞蓟宾，可为模型组的2.41倍，初步判断为黄酮醇苷类物质，并从作用机制验证了其对CCl4引起的肝损伤具有显著保护作用。
3.3 抑菌作用
Carpes[40]首先发现蜂花粉中的酚类物质具有抑菌作用。孙丽萍等[41]进而对油菜蜂花粉分离提取，以对枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的抑菌能力为活性跟踪指标，以最小抑菌质量浓度（MIC）和最小杀菌质量浓度（MBC）为评价指标，进行活性追踪和结构鉴定，结果表明，乙醚萃取部分的抑菌活性最强，山奈酚是其中主要抑菌活性成分，效果显著，是油菜蜂花粉抑菌作用的主要物质基础。
3.4 其他
郭雪微等[42]选择确诊血脂紊乱、2型糖尿病、脑梗塞和健康者各30例，给与油菜蜂花粉黄酮类化合物口服40 mg，每日2次，持续2个月，结果发现，血脂紊乱组、糖尿病组和脑梗塞各组甘油三酯（TG）、白细胞计数（WBC）、血小板计数（PCT）、高敏C反应蛋白（hsCRP）和丙二醛（MDA）明显下降，高密度脂蛋白胆固醇（HDL C）显著升高，血糖（BG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）也有一定程度下降，说明油菜蜂花粉黄酮类化合物具有一定程度地调节血脂、抑制炎性因子、控制血糖作用，在临床的药理研究有很广阔前景[43]。
4 结语
油菜蜂花粉含有大量黄酮类化合物，因其显著的药理特性和保健功能，具有很大的研发价值。但目前对油菜蜂花粉的主要研究停留在酚类化合物的生理活性上，在食品的应用上也主要侧重于蜂花粉整体的功能疗效，还没有完全科学地认识黄酮生物活性上的应用空间。另外，对黄酮的分离提取方法绝大多数还局限在试验室的操作阶段，与商业化大规模的生产开发上存在一定距离。相信随着相关试验的开展，油菜蜂花粉中黄酮类化合物更多的生物活性将被发现，被人们所开发利用。
参考文献
[1] 冯慧，焦士蓉，唐远谋，等.油菜花粉研究进展[J].食品工业，2011（9）：108-110. [2] WAGENLEHNER F M，SCHNEIDER H，LUDWIG M，et al.A pollen extract（Cernilton）in patients with inflammatory chronic prostatitischronic pelvic pain syndrome：A multicentre，randomised，prospective，doubleblind，placebocontrolled phase 3 study[J].European urology，2009，56：544–551.
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