【摘 要】
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目的构建和包装稳定表达泛素化HBcAg融合基因和Tapasin基因的重组慢病毒,为慢性乙型肝炎免疫治疗的实验研究奠定基础。方法设计引物通过聚合酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因
【基金项目】
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江苏省自然科学基金面上项目(BK20181225);江苏省镇江市科技创新(重点研发计划-社会发展)项目(SH2016040)
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目的构建和包装稳定表达泛素化HBcAg融合基因和Tapasin基因的重组慢病毒,为慢性乙型肝炎免疫治疗的实验研究奠定基础。方法设计引物通过聚合酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因Ub-HBcAg,Ub-HBcAg基因与经酶切线性化的慢病毒表达载体质粒pLenti-CMV-HA-3Flag-P2A-EGFP定向连接,其产物pLenti-CMVUb-HBcAg-HA-3Flag-P2A-EGFP转化大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞,挑选阳性克隆进行PCR鉴定和直接测序序列分析。将化学合成的T2A-Tapasin基因插入至pLenti-CMV-Ub-HBcAg-HA-3Flag-P2A-EGFP,其产物p Lenti-CMV-Ub-HBcAg-HA-T2A-Tapasin-3Flag-P2A-EGFP经直接基因测序分析后与包装质粒pLP1、pLP2以及包膜质粒p LP/VSVG共转染人胚肾293T细胞,得到携带有Ub-HBcAg基因和Tapasin基因的重组慢病毒颗粒LV-Ub-HBcAg/Tapasin,重组慢病毒颗粒转染293T细胞,实时荧光定量PCR检测慢病毒浓缩液的滴度,Western blot法检测目的基因的表达。结果成功构建和包装了表达泛素化HBcAg融合基因和Tapasin基因的重组慢病毒,实时荧光定量PCR证实重组慢病毒的滴度达3.25×10~8TU/mL。结论成功构建稳定表达泛素化HBcAg融合基因和Tapasin基因的重组慢病毒,为慢性乙肝的免疫治疗提供了实验基础。
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