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【摘要】目的:探讨甘草甜素抑制肝星状细胞增殖的相关机制。方法:用MTT法检测三组不同浓度甘草甜素对肝星状细胞增殖的抑制率,用免疫细胞化学法检测细胞周期素cyclinD1以及PCNA的表达情况。结果 MTT法检测不同药物浓度组:空白对照组、0.8mg/L 甘草甜素组、1.2mg/L甘草甜素组、1.6mg/L甘草甜素组细胞增殖抑制率分别为0,2.73%,14.75%,25.96%,有统计学意义(F=19.364,P<0.05);不同甘草甜素浓度组PCNA阳性表达细胞数与对照组比较差异有显著性(F=68.329,P<0.01);不同甘草甜素浓度组cyclinD1阳性表达细胞数与对照组比较差异有显著性(F=58.362,P<0.01)。结论:甘草甜素能够浓度依赖性的抑制大鼠肝星状细胞增殖;甘草甜素可通过降低细胞周期素cyclinD1的表达和PCNA的表达而抑制大鼠肝星状细胞增殖。
【关键词】甘草甜素;肝星状细胞;细胞周期素;PCNA ,cyclinD1
The Relevant Mechanisms Of Glycyrrhizin Inhibit Hepatic Stellate Cell Proliferation
WANG Xiaomei LIU JunmeiWANG JilingJI PengfeiZHU Lina
【Abstract】 ObjectiveTo discuss the relevant mechanisms of the glycyrrhizin inhibiting hepatic stellate cell proliferation. MethodeThe inhibition ratioes of the three group different density glycyrrhizin on hepatic stellatecell proliferation was detected by MTT method. The express of the cell cyclinD1 and PCNA was detected by immunocytochemical Method.RusultsThe inhibition ratio results of MTT method detecting different glycyrrhizin density groups inhibiting hepatic stellate cell proliferation: blank,0.8mg/l group,1.2mg/l group,1.6mg/l group in order were 0,2.73 percent,14.75 percent, 25.96 percent.It shows significant dose-dependent and have stati- stical significance (F=68.329,P<0.01).The cell population of PCNA positive express in the different glycyrrhizin groups have significant differences compared with control group (F=68.329, P<0.01). The cell population of cyclinD1 positive express in the different glycyrrhizin groups have significant differences compared with control group (F=58.362,P<0.01).ConclusionGlycyrrhizin relying on the density caninhibit the rat hepatic stellate cell proliferation. Glycyrrhizin may through cut down the cell cyclin express of cyclinD1 and PCNA inhibit the rat hepatic stellate cell proliferation.
【Key words】chronic liver disease,cytokine,IL-1,IL-6,TNF-α
【中图分类号】R248.2【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2010)010-0001-03
肝星状细胞(HSC)是细胞外基质(ECM)的主要来源细胞,在肝受到损伤时可被激活、转化及增殖,是肝纤维化发生、发展的核心环节。因此抑制HSC的活化和增殖是当今中医中药抗肝纤维化研究的一大热点。甘草甜素是由以β一甘草酸为主要成分的复方制剂,既往研究表明甘草甜素对肝星状细胞的增殖有抑制作用[1],但其对HSC活化、增值的抑制机制目前未见深入报道。本研究拟对肝星状细胞进行体外培养,从细胞周期调控角度探讨甘草甜素对肝星状细胞增殖的影响,进一步揭示肝纤维化的发生机制以及甘草甜素抑制肝星状细胞增殖的机制。
1 材料与方法
1.1 试验材料:肝星状细胞株HSC-T6,购自上海中医药大学肝病研究所。主要实验试剂有:特级胎牛血清(购自北京元亨圣马生物技术研究所),RPMI 1640 培养基、胰蛋白酶(购自Amresco),cyxlinD1抗体、PCNA抗体(购自Sant Cruz Biotechnoloyg),浓缩型DAB试剂盒:(购自北京中杉金桥生物技术有限公司),免疫组化染色试剂盒(购自北京中杉金桥生物技术有限公司),免疫染色一抗稀释液、免疫染色二抗稀释液以及封片液(购自江苏碧云天生物技术研究所)
1.2 实验方法:
1.2.1 实验分组:实验组:肝星状细胞10%特级胎牛血清RPMI 1640培养液中加入甘草甜素复方制剂药液,根据预实验情况,设置三个药物浓度组,分别:1.6mg/ml甘草甜素组;1.2mg/ml甘草甜素组;0.8mg/ml甘草甜素组。对照组:肝星状细胞10%特级胎牛血清RPMI 1640培养液中不加其他处理因素;
1.2.2 HSC-T6的复苏与培养:从液氮罐中取出细胞冻存管,迅速置入37℃水浴中,轻轻振荡至冻存液完全溶解(1~2分钟)。75%酒精擦拭冻存管后打开,将冻存液吸入15ml无菌离心管中,边滴加含10%PBS的DMEM培养基边振荡混匀。1000转/分离心5分钟,吸弃上清液,重复洗一次,再加入含10%PBS的RPMI 1640培养基3ml,接种于25ml培养瓶中,放入37℃、5%CO2培养箱中培养,24小时后,更换培养基继续培养。
1.2.3 MTT法检测甘草甜素对细胞增殖的影响:取对数生长期细胞,经0.25%胰蛋白酶消化后,用含10%PBS的RPMI1640培养基制备单细胞悬液,调节细胞浓度至1×104/ml,按每孔200μl接种于96孔板,置于37℃,5%CO2孵箱中培养,待细胞生长达70%融合,将细胞分为四组:空白对照组、0.8mmol/l甘草甜素组、1.2mmol/l甘草甜素组、1.6mmol/l甘草甜素组,每组设12个复孔。以无血清培养基洗细胞三次,加入不同浓度甘草甜素。甘草甜素处理24h后,每孔加入 MTT溶液(5mg/ml)20μl,37℃继续培养4h后终止反应,小心吸弃孔内上清液,每孔加入150μl DMSO,置摇床上低速振荡10min,使结晶充分溶解。用酶联免疫检测仪测各孔波长在490nm的光密度(OD)值,同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定3个复孔。以下列公式计算细胞抑制率:细胞抑制率CIR=(空白对照组平均OD值-处理组平均OD值)/空白对照组平均OD值×l00%。
1.2.4 免疫细胞化学法(SABC法)检测PCNA、cyclinD1的表达:取对数生长期细胞,经上述相同处理后接种于置有经多聚赖氨酸处理的盖玻片的24孔板中,置于37℃,5%CO2孵箱中培养,待细胞生长达70%融合,将细胞分为4组: 空白对照组、0.8mg/L 甘草甜素组、1.2mg/L 甘草甜素组、1.6mg/L 甘草甜素组。以无血清培养基洗细胞三次,加入不同浓度甘草甜素。 甘草甜素处理24h后,4%多聚甲醛固定细胞15min, 0.3% Tri-tonX-100通透细胞30min,3%过氧化氢-甲醇液中浸泡10min,非免疫性动物血清中孵10min,加一抗(PCNA、cyclinD1单克隆抗体)4℃冰箱过夜后,生物素标记的二抗中孵育10min,加HRP标记链亲和素孵育10min(以上每次操作均用PBS洗细胞3次后再进行下一步)。然后进行DAB显色(显微镜下观察掌握显色程度):自来水充分冲洗,苏木素复染,盐酸酒精分化,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜下观察,照相。 以PBS代替一抗作阴性对照。每组细胞各进行6次独立性实验。PCNA、cyclinD1阳性结果判断:PCNA染色:细胞核着色,染成棕黄(褐)色为阳性,浅(灰)蓝色视为阴性;cyclinD1定位于胞核,胞核染色棕黄色为阳性(cyclinD1在胞核可见棕褐色颗粒)[2],浅(灰)蓝色视为阴性。400倍镜下,PCNA、cyclinD1指数通过随机选择5个高倍视野,每视野计数100个细胞中的阳性细胞数。取平均数作为计数指标。
1.2.5 统计学分析:结果用X±s表示,数据统计分析利用SPSS 14.0软件完成,比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 甘草甜素对肝星状细胞增殖的影响:用MTT法检测了不同浓度药物对细胞增殖的影响,结果空白对照组、0.8mg/L 甘草甜素组、1.2mg/L 甘草甜素组、1.6mg/L 甘草甜素组细胞增殖抑制率分别为0,2.73%,14.75%,25.96%,甘草甜素在0.8mg/L-1.6mg/L的范围内显著抑制大鼠肝星状细胞的增殖(F=19.364,P<0.05),呈现明显的剂量依赖性(见表1)。
2.2 甘草甜素对肝星状细胞PCNA表达的影响: PCNA以细胞核表达为主,细胞质也有表达。0.8mg/L、1.2mg/L、1.6 mg/L 甘草甜素浓度组PCNA阳性表达细胞数较对照组明显减少,与对照组比较差异有显著性,具有统计学意义(F=68.329,P<0.01); PCNA阳性表达细胞数随着甘草甜素浓度的增高,阳性表达细胞数明显减少,各浓度组之间也存在显著差异(F=68.329,P<0.01) (见表2)。
2.3 甘草甜素对肝星状细胞cyclinD1表达的影响:cyclinD1以细胞核表达为主,细胞质也有表达。0.8mg/L、1.2mg/L、1.6mg/L甘草甜素浓度组cyclinD1阳性表达细胞数较对照组明显减少,与对照组比较差异有显著性,具有统计学意义(F=58.362,P<0.01);且随着甘草甜素浓度增加cyclinD1阳性表达细胞数明显减少,各浓度组之间也存在显著性差异(F=58.362,P<0.01) (见表3)。
3 讨论
肝纤维化是肝脏损伤后的异常修复反应,是细胞外基质成分在肝组织内过量生成和沉积的结果,是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段。肝星状细胞是肝脏的主要间质细胞,也是分泌细胞外基质的主要细胞,各种引起肝脏损伤的致病因素均可刺激肝星状细胞激活、增殖及转化,使细胞外基质合成增多及降解减少,继而沉积在细胞间隙,从而发生纤维化[3~4]。目前认为肝纤维化经过去除病因、护肝等治疗,部分肝纤维化可以恢复正常,但其中仍有25%~40% 最终会发展为肝硬化甚至肝癌。故近年来肝纤维化防治的研究已成为消化病学研究的热点。
复方甘草甜素为(复方甘草酸苷)是由以β-甘草酸为主要成分的复合制剂,包含甘草酸-铵,甘氨酸,L-半胱氨酸,甘氨酸-铵,DL-蛋铵酸,分子式:C42H6CO16,分子量822.94。既往研究证明甘草甜素不仅具有抗炎,抗病毒、免疫调节等多种药理作用[5],还有通过多种途径发挥抗纤维化作用[6]。同时有研究表明,甘草甜素对肝星状细胞的增殖有抑制作用[1],而甘草甜素抑制HSC的活化包括其有效性、有效剂量和可能的作用机制等,目前均未见深入报道。本研究在以往研究的基础上[6~8],选择甘草甜素 0.8 mg/L-1.6 mg/L中的3个不同剂量,用MTT法检测了不同浓度甘草甜素对肝星状细胞增殖的影响。本实验结果显示甘草甜素在0.8mg/L ~1.2mg/L的范围内显著抑制大鼠HSC的增殖(P<0.05),且呈现出明显的剂量依赖性,与文献[1]报道一致。
细胞增殖是肝星状细胞活化后的重要特征之一,其通过细胞周期的运行来实现,而细胞周期的调控则通过一系列的细胞周期调控蛋白(细胞周期素)的相互作用而完成。细胞周期蛋白是一种与细胞周期相关的核蛋白家族,通过与细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin depe- ndent kinases;CDKs)形成复合体并激活后者,在细胞的增殖分化中起作用。真核细胞的细胞周期由细胞周期素依次激活相应的细胞周期素依赖蛋白激酶所推动,细胞周期的不同时相由不同的cyclin控制。在非肿瘤研究中Dudas等[10]发现,培养2～7天的肝脏星状细胞cyclinD1蛋白及mRNA水平均上升,在培养8天时下降,增殖细胞核抗原(PCNA)水平变化与cyclinD1一致。cyclinD1高水平表达使cyclinE和PCNA转录,驱使细胞进入S期。
在真核细胞的细胞周期调控中,G1-S期之间的调控(restriction Point,又称R点)是细胞内外信号经传递、整合,汇集到细胞核对细胞增殖进行调控的关键点,cyclinD1是调控G1期周期蛋白之一。细胞能否通过限制点从G1期进入S期很大程度上取决于G1期cyclinD1的积累。细胞在生长因子的刺激下,G1期cyclinD1表达,并与CDK4、CDK6结合,使下游的蛋白质磷酸化,磷酸化的蛋白质释放出转录因子,促进许多基因的转录,如编码cyclinE、A和CDK1的基因。本实验通过免疫细胞化学进一步研究发现大鼠肝星状细胞中存在cyclinD1的表达,在一定范围内,随着甘草甜素浓度的增加,大鼠肝星状细胞cyclinD1蛋白的表达逐渐减少。说明甘草甜素可通过降低细胞周期素cyclinD1的表达而抑制大鼠肝星状细胞增殖。
PCNA是反映细胞增殖的最好标志,也称细胞周期蛋白,作为DNA聚合酶δ的辅助蛋白直接参与细胞增殖过程中的DNA复制,在细胞周期运行中也发挥重要作用,在细胞周期G1期和S期早期合成,S期达高峰,S期早期分布于细胞浆内(细胞核缺乏),S期晚期主要存在于细胞核内[9~10]。各种刺激因子可通过不同的途径诱导肝星状细胞增殖,但都必须通过PCNA的表达这一中间环节,因而它是细胞增殖的必经之路。本研究发现在一定范围内,随着甘草甜素浓度的增加,大鼠肝星状细胞PCNA表达也逐渐减少。说明PCNA表达减少也参与了甘草甜素抑制大鼠肝星状细胞增殖的机制。
综上可见,甘草甜素通过降低大鼠肝星状细胞cyclinD1、PCNA表达,发挥抑制大鼠肝星状细胞增殖的作用,具体机理可能是甘草甜素阻滞钙离子通道,降低细胞内钙离子浓度,抑制钙离子信号途径,减少cyclinD1蛋白表达进而降低PCNA蛋白表达,后者则阻止细胞通过G1-S调控点进入S期,使其停滞于 G0/G1期,细胞无法进入自主分裂程序,细胞增殖受到抑制。可见,甘草甜素能够浓度依赖性的抑制大鼠肝星状细胞增殖。可通过降低细胞周期素cyclinD1及PCNA的表达而抑制大鼠肝星状细胞的增殖。
参考文献
[1] 王志凌 成军 刘妍等,甘草甜素抑制肝星状细胞增殖作用的研究[J].肝脏2005年9月第10卷第3期
[2] Hammel P,Couvelard A,O'Toole MD,et a1. Regression of liver fibrosis after billary drainage in pents with chronic pancreatitis and stenosis of the common bile duct[J].N Earl J Med,2001,344:18
[3] Gabele E,Brenner DA,Rippe RA.Liver fibrosis:signals leading to the amplificationof the fibrogenic hepatic stellate cell[J].Front Biosci,2003,8:69~77
[4] Lamireau T,Desmouliere A,Bioulac Sage P,et al.Mechanisms of hepatic fibrogensis[J].Arch Pediatr.2002,9(4):392~405
[5] 王俊韬,于少军,肖炜.复方甘草甜素(美能)在肝病领域的临床应.中国药房,2002,13(8):50
[6] 贾道奎,张正,罗成福等,甘草甜素逆转肝纤维化及早期肝硬化的作用探讨[J]。中华消化杂志2001年l2月第2l卷第l2期Chin J Dig,December 200l,V021,No12
[7] 王吉耀,刘维田,胡美亚,等 甘草酸对成纤维细胞1,3型前胶原mRNA表达的抑制作用.中华消化杂志,1997,2:60~61
[8] Ono M,Miyamura M, Kyotan i S,et a1. Effects of Sho-saiko-to extract onliver fibrosis in relation to the chan ges in hydroxyproline an d retinoid levels ofthe liver in rats[J].J Pharm Pharmacol,1999,51:1079~1084
[9] Chunder N, Mandal S, Roy A, et al.. Analysis of different deleted regions in chromosome 11 and their interrelations in early- and late-onset breast tumors: association with cyclinD1 amplification and survival. Diagn Mol Pathol. 2004 Sep;13(3):172~82
[10] Dudas J,Saile B,EI-Armouche H,et a1.Endoreplication and polyploidy in primary culture of rat hepatic stellate cells. Cell Tissue Res.2003,313(3):301~311
【关键词】甘草甜素;肝星状细胞;细胞周期素;PCNA ,cyclinD1
The Relevant Mechanisms Of Glycyrrhizin Inhibit Hepatic Stellate Cell Proliferation
WANG Xiaomei LIU JunmeiWANG JilingJI PengfeiZHU Lina
【Abstract】 ObjectiveTo discuss the relevant mechanisms of the glycyrrhizin inhibiting hepatic stellate cell proliferation. MethodeThe inhibition ratioes of the three group different density glycyrrhizin on hepatic stellatecell proliferation was detected by MTT method. The express of the cell cyclinD1 and PCNA was detected by immunocytochemical Method.RusultsThe inhibition ratio results of MTT method detecting different glycyrrhizin density groups inhibiting hepatic stellate cell proliferation: blank,0.8mg/l group,1.2mg/l group,1.6mg/l group in order were 0,2.73 percent,14.75 percent, 25.96 percent.It shows significant dose-dependent and have stati- stical significance (F=68.329,P<0.01).The cell population of PCNA positive express in the different glycyrrhizin groups have significant differences compared with control group (F=68.329, P<0.01). The cell population of cyclinD1 positive express in the different glycyrrhizin groups have significant differences compared with control group (F=58.362,P<0.01).ConclusionGlycyrrhizin relying on the density caninhibit the rat hepatic stellate cell proliferation. Glycyrrhizin may through cut down the cell cyclin express of cyclinD1 and PCNA inhibit the rat hepatic stellate cell proliferation.
【Key words】chronic liver disease,cytokine,IL-1,IL-6,TNF-α
【中图分类号】R248.2【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2010)010-0001-03
肝星状细胞(HSC)是细胞外基质(ECM)的主要来源细胞,在肝受到损伤时可被激活、转化及增殖,是肝纤维化发生、发展的核心环节。因此抑制HSC的活化和增殖是当今中医中药抗肝纤维化研究的一大热点。甘草甜素是由以β一甘草酸为主要成分的复方制剂,既往研究表明甘草甜素对肝星状细胞的增殖有抑制作用[1],但其对HSC活化、增值的抑制机制目前未见深入报道。本研究拟对肝星状细胞进行体外培养,从细胞周期调控角度探讨甘草甜素对肝星状细胞增殖的影响,进一步揭示肝纤维化的发生机制以及甘草甜素抑制肝星状细胞增殖的机制。
1 材料与方法
1.1 试验材料:肝星状细胞株HSC-T6,购自上海中医药大学肝病研究所。主要实验试剂有:特级胎牛血清(购自北京元亨圣马生物技术研究所),RPMI 1640 培养基、胰蛋白酶(购自Amresco),cyxlinD1抗体、PCNA抗体(购自Sant Cruz Biotechnoloyg),浓缩型DAB试剂盒:(购自北京中杉金桥生物技术有限公司),免疫组化染色试剂盒(购自北京中杉金桥生物技术有限公司),免疫染色一抗稀释液、免疫染色二抗稀释液以及封片液(购自江苏碧云天生物技术研究所)
1.2 实验方法:
1.2.1 实验分组:实验组:肝星状细胞10%特级胎牛血清RPMI 1640培养液中加入甘草甜素复方制剂药液,根据预实验情况,设置三个药物浓度组,分别:1.6mg/ml甘草甜素组;1.2mg/ml甘草甜素组;0.8mg/ml甘草甜素组。对照组:肝星状细胞10%特级胎牛血清RPMI 1640培养液中不加其他处理因素;
1.2.2 HSC-T6的复苏与培养:从液氮罐中取出细胞冻存管,迅速置入37℃水浴中,轻轻振荡至冻存液完全溶解(1~2分钟)。75%酒精擦拭冻存管后打开,将冻存液吸入15ml无菌离心管中,边滴加含10%PBS的DMEM培养基边振荡混匀。1000转/分离心5分钟,吸弃上清液,重复洗一次,再加入含10%PBS的RPMI 1640培养基3ml,接种于25ml培养瓶中,放入37℃、5%CO2培养箱中培养,24小时后,更换培养基继续培养。
1.2.3 MTT法检测甘草甜素对细胞增殖的影响:取对数生长期细胞,经0.25%胰蛋白酶消化后,用含10%PBS的RPMI1640培养基制备单细胞悬液,调节细胞浓度至1×104/ml,按每孔200μl接种于96孔板,置于37℃,5%CO2孵箱中培养,待细胞生长达70%融合,将细胞分为四组:空白对照组、0.8mmol/l甘草甜素组、1.2mmol/l甘草甜素组、1.6mmol/l甘草甜素组,每组设12个复孔。以无血清培养基洗细胞三次,加入不同浓度甘草甜素。甘草甜素处理24h后,每孔加入 MTT溶液(5mg/ml)20μl,37℃继续培养4h后终止反应,小心吸弃孔内上清液,每孔加入150μl DMSO,置摇床上低速振荡10min,使结晶充分溶解。用酶联免疫检测仪测各孔波长在490nm的光密度(OD)值,同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定3个复孔。以下列公式计算细胞抑制率:细胞抑制率CIR=(空白对照组平均OD值-处理组平均OD值)/空白对照组平均OD值×l00%。
1.2.4 免疫细胞化学法(SABC法)检测PCNA、cyclinD1的表达:取对数生长期细胞,经上述相同处理后接种于置有经多聚赖氨酸处理的盖玻片的24孔板中,置于37℃,5%CO2孵箱中培养,待细胞生长达70%融合,将细胞分为4组: 空白对照组、0.8mg/L 甘草甜素组、1.2mg/L 甘草甜素组、1.6mg/L 甘草甜素组。以无血清培养基洗细胞三次,加入不同浓度甘草甜素。 甘草甜素处理24h后,4%多聚甲醛固定细胞15min, 0.3% Tri-tonX-100通透细胞30min,3%过氧化氢-甲醇液中浸泡10min,非免疫性动物血清中孵10min,加一抗(PCNA、cyclinD1单克隆抗体)4℃冰箱过夜后,生物素标记的二抗中孵育10min,加HRP标记链亲和素孵育10min(以上每次操作均用PBS洗细胞3次后再进行下一步)。然后进行DAB显色(显微镜下观察掌握显色程度):自来水充分冲洗,苏木素复染,盐酸酒精分化,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜下观察,照相。 以PBS代替一抗作阴性对照。每组细胞各进行6次独立性实验。PCNA、cyclinD1阳性结果判断:PCNA染色:细胞核着色,染成棕黄(褐)色为阳性,浅(灰)蓝色视为阴性;cyclinD1定位于胞核,胞核染色棕黄色为阳性(cyclinD1在胞核可见棕褐色颗粒)[2],浅(灰)蓝色视为阴性。400倍镜下,PCNA、cyclinD1指数通过随机选择5个高倍视野,每视野计数100个细胞中的阳性细胞数。取平均数作为计数指标。
1.2.5 统计学分析:结果用X±s表示,数据统计分析利用SPSS 14.0软件完成,比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 甘草甜素对肝星状细胞增殖的影响:用MTT法检测了不同浓度药物对细胞增殖的影响,结果空白对照组、0.8mg/L 甘草甜素组、1.2mg/L 甘草甜素组、1.6mg/L 甘草甜素组细胞增殖抑制率分别为0,2.73%,14.75%,25.96%,甘草甜素在0.8mg/L-1.6mg/L的范围内显著抑制大鼠肝星状细胞的增殖(F=19.364,P<0.05),呈现明显的剂量依赖性(见表1)。
2.2 甘草甜素对肝星状细胞PCNA表达的影响: PCNA以细胞核表达为主,细胞质也有表达。0.8mg/L、1.2mg/L、1.6 mg/L 甘草甜素浓度组PCNA阳性表达细胞数较对照组明显减少,与对照组比较差异有显著性,具有统计学意义(F=68.329,P<0.01); PCNA阳性表达细胞数随着甘草甜素浓度的增高,阳性表达细胞数明显减少,各浓度组之间也存在显著差异(F=68.329,P<0.01) (见表2)。
2.3 甘草甜素对肝星状细胞cyclinD1表达的影响:cyclinD1以细胞核表达为主,细胞质也有表达。0.8mg/L、1.2mg/L、1.6mg/L甘草甜素浓度组cyclinD1阳性表达细胞数较对照组明显减少,与对照组比较差异有显著性,具有统计学意义(F=58.362,P<0.01);且随着甘草甜素浓度增加cyclinD1阳性表达细胞数明显减少,各浓度组之间也存在显著性差异(F=58.362,P<0.01) (见表3)。
3 讨论
肝纤维化是肝脏损伤后的异常修复反应,是细胞外基质成分在肝组织内过量生成和沉积的结果,是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段。肝星状细胞是肝脏的主要间质细胞,也是分泌细胞外基质的主要细胞,各种引起肝脏损伤的致病因素均可刺激肝星状细胞激活、增殖及转化,使细胞外基质合成增多及降解减少,继而沉积在细胞间隙,从而发生纤维化[3~4]。目前认为肝纤维化经过去除病因、护肝等治疗,部分肝纤维化可以恢复正常,但其中仍有25%~40% 最终会发展为肝硬化甚至肝癌。故近年来肝纤维化防治的研究已成为消化病学研究的热点。
复方甘草甜素为(复方甘草酸苷)是由以β-甘草酸为主要成分的复合制剂,包含甘草酸-铵,甘氨酸,L-半胱氨酸,甘氨酸-铵,DL-蛋铵酸,分子式:C42H6CO16,分子量822.94。既往研究证明甘草甜素不仅具有抗炎,抗病毒、免疫调节等多种药理作用[5],还有通过多种途径发挥抗纤维化作用[6]。同时有研究表明,甘草甜素对肝星状细胞的增殖有抑制作用[1],而甘草甜素抑制HSC的活化包括其有效性、有效剂量和可能的作用机制等,目前均未见深入报道。本研究在以往研究的基础上[6~8],选择甘草甜素 0.8 mg/L-1.6 mg/L中的3个不同剂量,用MTT法检测了不同浓度甘草甜素对肝星状细胞增殖的影响。本实验结果显示甘草甜素在0.8mg/L ~1.2mg/L的范围内显著抑制大鼠HSC的增殖(P<0.05),且呈现出明显的剂量依赖性,与文献[1]报道一致。
细胞增殖是肝星状细胞活化后的重要特征之一,其通过细胞周期的运行来实现,而细胞周期的调控则通过一系列的细胞周期调控蛋白(细胞周期素)的相互作用而完成。细胞周期蛋白是一种与细胞周期相关的核蛋白家族,通过与细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin depe- ndent kinases;CDKs)形成复合体并激活后者,在细胞的增殖分化中起作用。真核细胞的细胞周期由细胞周期素依次激活相应的细胞周期素依赖蛋白激酶所推动,细胞周期的不同时相由不同的cyclin控制。在非肿瘤研究中Dudas等[10]发现,培养2～7天的肝脏星状细胞cyclinD1蛋白及mRNA水平均上升,在培养8天时下降,增殖细胞核抗原(PCNA)水平变化与cyclinD1一致。cyclinD1高水平表达使cyclinE和PCNA转录,驱使细胞进入S期。
在真核细胞的细胞周期调控中,G1-S期之间的调控(restriction Point,又称R点)是细胞内外信号经传递、整合,汇集到细胞核对细胞增殖进行调控的关键点,cyclinD1是调控G1期周期蛋白之一。细胞能否通过限制点从G1期进入S期很大程度上取决于G1期cyclinD1的积累。细胞在生长因子的刺激下,G1期cyclinD1表达,并与CDK4、CDK6结合,使下游的蛋白质磷酸化,磷酸化的蛋白质释放出转录因子,促进许多基因的转录,如编码cyclinE、A和CDK1的基因。本实验通过免疫细胞化学进一步研究发现大鼠肝星状细胞中存在cyclinD1的表达,在一定范围内,随着甘草甜素浓度的增加,大鼠肝星状细胞cyclinD1蛋白的表达逐渐减少。说明甘草甜素可通过降低细胞周期素cyclinD1的表达而抑制大鼠肝星状细胞增殖。
PCNA是反映细胞增殖的最好标志,也称细胞周期蛋白,作为DNA聚合酶δ的辅助蛋白直接参与细胞增殖过程中的DNA复制,在细胞周期运行中也发挥重要作用,在细胞周期G1期和S期早期合成,S期达高峰,S期早期分布于细胞浆内(细胞核缺乏),S期晚期主要存在于细胞核内[9~10]。各种刺激因子可通过不同的途径诱导肝星状细胞增殖,但都必须通过PCNA的表达这一中间环节,因而它是细胞增殖的必经之路。本研究发现在一定范围内,随着甘草甜素浓度的增加,大鼠肝星状细胞PCNA表达也逐渐减少。说明PCNA表达减少也参与了甘草甜素抑制大鼠肝星状细胞增殖的机制。
综上可见,甘草甜素通过降低大鼠肝星状细胞cyclinD1、PCNA表达,发挥抑制大鼠肝星状细胞增殖的作用,具体机理可能是甘草甜素阻滞钙离子通道,降低细胞内钙离子浓度,抑制钙离子信号途径,减少cyclinD1蛋白表达进而降低PCNA蛋白表达,后者则阻止细胞通过G1-S调控点进入S期,使其停滞于 G0/G1期,细胞无法进入自主分裂程序,细胞增殖受到抑制。可见,甘草甜素能够浓度依赖性的抑制大鼠肝星状细胞增殖。可通过降低细胞周期素cyclinD1及PCNA的表达而抑制大鼠肝星状细胞的增殖。
参考文献
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